一種可視化鑒定美洲大蠊的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可視化鑒定美洲大蠊的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 可視化檢測(cè)是近幾年新興的一種利用具有酶催化活性的DNA序列進(jìn)行物種鑒定 的技術(shù)。該技術(shù)在DNA測(cè)序、序列分析的技術(shù)上改進(jìn)而來的檢測(cè)鑒定方法。利用DNA條形碼 自身物種的保守性和不同物種之間的特異性，尋找物種之間特異的片段，設(shè)計(jì)特異性探針。 該技術(shù)免去了測(cè)序的步驟，無需進(jìn)行序列分析比對(duì)，更無需昂貴的熒光PCR儀，不需凝膠分 析，僅需要普通的PCR儀，用肉眼即可檢測(cè)。
[0003]DNA條形碼技術(shù)是利用生物本身普遍具有的一段保守性適中、容易獲得的基因片 段作為標(biāo)準(zhǔn)，建立在現(xiàn)代先進(jìn)的DNA擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)技術(shù)基礎(chǔ)之上的一種物種鑒定手段。 與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定相比，利用DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定具有以下優(yōu)勢(shì)：對(duì)物種的鑒定將不 再受物種發(fā)育狀態(tài)的限制，克服了卵、幼蟲、蛹等無法直接鑒定的缺點(diǎn)；對(duì)鑒定者的經(jīng)驗(yàn)和 專業(yè)背景知識(shí)大大降低，減少主觀判斷的干擾；物種的鑒定更加準(zhǔn)確快速。
[0004] 美洲大蠊是一種常見的醫(yī)學(xué)媒介生物，攜帶大量的細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲卵， 經(jīng)常出沒在廚房等家居環(huán)境，嚴(yán)重威脅著人民的生命健康，而其卵和若蟲無法根據(jù)形態(tài)進(jìn) 行直接鑒定，往往需要利用熒光PCR儀（儀器昂貴、耗材昂貴）、普通PCR儀（需凝膠檢測(cè)， 接觸對(duì)人體有害的核酸染料）進(jìn)行特異性檢測(cè)或者利用DNA條形碼技術(shù)（需凝膠檢測(cè)和耗 時(shí)的測(cè)序）進(jìn)行鑒定。急需一種簡(jiǎn)便、快捷、直觀的鑒定方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種可視化鑒定美洲大 蠊的方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供實(shí)現(xiàn)可視化鑒定美洲大蠊的方法的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種可視化鑒定美洲大蠊的方法，包括如 下步驟：
[0008] (1)設(shè)計(jì)美洲大蠊的可視化探針序列，如下：
[0009]探針 1(5' -3'）：
[0010] ICCCTACCCAIAACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGG ATGGGTAGGGCGGGTTGGG；
[0011] 其中，方框框住部分為前綴序列；與劃?rùn)M線部分序列反向互補(bǔ)，起到沉默空白的作 用；粗體字部分為G-四聯(lián)結(jié)構(gòu)；
[0012] (2) |旲板DNA的提取：提取待檢標(biāo)本的基因組DNA;
[0013] (3)C0I序列的制備：以步驟（2)得到的基因組DNA為模板，以LC01490和HC02198 為引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，再將PCR產(chǎn)物純化，得到C0I序列；
[0014]LC01490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
[0015]HC02198 :5, -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3,；
[0016] (4)可視化擴(kuò)增：以步驟⑶得到的C0I序列為模板，以LC01490和探針I(yè)為引物 對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0017] (5)顯色和結(jié)果判斷：向步驟（4)得到的可視化擴(kuò)增產(chǎn)物中加入NaCl溶液，變性 和復(fù)性；接著加入氯鐵血紅素（hemin)反應(yīng)，再加入H202和ABTS%觀察顏色變化；顏色變?yōu)?綠色，表示待檢樣品為美洲大蠊；顏色沒有發(fā)生變化，表示待檢樣品非美洲大蠊；
[0018] 步驟⑵中所述的待檢標(biāo)本的基因組DNA的提取可通過常規(guī)方法或試劑盒提??；
[0019]步驟（3)中所述PCR反應(yīng)的體系優(yōu)選為：10XPCRbuffer5ill，dNTP(2. 5mM each)2ii1，EXTaq酶（5U/iil)0.5iil，LC01490(20iiM)和HC02198(20iiM)各lii1，基因 組DNA3ill，ddH20 補(bǔ)足至 50ill;
[0020] 步驟（3)中所述PCR反應(yīng)的條件優(yōu)選為：94°C3min;94°C30s、50°C30s、72°C30s， 20 個(gè)循環(huán)；72°ClOmin;
[0021] 步驟（3)中所述的將PCR產(chǎn)物純化可通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電 泳，切下含目的基因條帶的凝膠，提取目的基因；
[0022] 所述的凝膠為瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠；
[0023] 所述的提取可通過常規(guī)方法提取或通過試劑盒提?。蝗绛傊悄zDNA回收試劑 盒；
[0024]步驟⑷中所述可視化擴(kuò)增的體系優(yōu)選為10XPCRbuffer5ill，dNTP(2. 5mM each)2iU，DNAPolymeraseI酶（5U/iU) 0.5iU，1X01490(20iiM)liU，探針 I(20iiM) 4ii1，COI序列 1ii1，ddH20 補(bǔ)足至 50ii1 ;
[0025] 步驟⑷中所述可視化擴(kuò)增的條件優(yōu)選為94°C3min;94°C30s、50°C30s、 72°C45s，30 個(gè)循環(huán)；
[0026] 步驟（5)中所述的空白沉默液優(yōu)選為濃度為1. 714M的NaCl溶液；
[0027] 步驟（5)中所述的變性的條件優(yōu)選為：95°C保溫5min;
[0028] 步驟（5)中所述的復(fù)性的條件優(yōu)選為：變性后以1°C/min的速度降溫至25°C保溫 30min；
[0029] 步驟（5)中所述的反應(yīng)的條件為25°C保溫60min;
[0030] 步驟（5)中所述的觀察顏色變化的觀察時(shí)間優(yōu)選為2min;
[0031] 步驟（5)中各成分的用量如下：每50ill可視化擴(kuò)增產(chǎn)物加入0. 012molNaCl、 0.108iimolhemin、0.126mmolH202 和 0.126mmolABTS2 ;
[0032] -種實(shí)現(xiàn)上述可視化鑒定美洲大蠊的方法的試劑盒，包含探針I(yè);探針I(yè)的序列如 下：
[0033] 5,-ICCCTACCCA]AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGG ATGGGTAGGGCGGGTTGGG-3,；
[0034] 其中，方框框住部分為前綴序列；與劃?rùn)M線部分序列反向互補(bǔ)，起到沉默空白的作 用；粗體字部分為G-四聯(lián)結(jié)構(gòu)；
[0035] 所述的試劑盒還包含如下引物對(duì)：
[0036] LC01490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' ；
[0037] HC02198 :5, -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3,；
[0038] 所述的試劑盒還包含陽性對(duì)照，陽性對(duì)照為美洲大蠊的C0I序列；
[0039] 所述的試劑盒還包含酶、dNTP、反應(yīng)緩沖液。
[0040] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0041] (1)本發(fā)明通過美洲大蠊探針的設(shè)計(jì)和篩選，得到美洲大蠊特異性的探針，所建立 的體系重復(fù)性高，經(jīng)多次試驗(yàn)穩(wěn)定性好。其擴(kuò)增結(jié)果與直接擴(kuò)DNA條形碼全長(zhǎng)相比，免去測(cè) 序、序列分析比對(duì)的步驟，更快捷，免去購(gòu)買昂貴的熒光PCR儀，節(jié)省成本。從而為美洲大蠊 可視化鑒定提供了一種可靠、便捷的方法。
[0042] (2)本發(fā)明提供的方法和試劑盒能直接鑒定待檢測(cè)的卵、若蟲、成蟲等是否為美洲 大蠊，方便，快捷，可靠。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] (1)設(shè)計(jì)探針：
[0046] 探針I(yè):
[0047] 5 '-CCCTACCCAAACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGATGGGTAGGGCGGGT TGGG-3,；
[0048] 探針I(yè)I:
[0049] 5' -AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGATGGGTAGGGCGGGTTGGG-3'。
[0050] 探針I(yè)和探針I(yè)I的差別是探針I(yè)比探針I(yè)I多前面9個(gè)堿基，探針I(yè)第10~70 位的核苷酸序列即為探針I(yè)I。
[0051] (2)基因組DNA的提?。涸趶V東中山新鮮采集的美洲大蠊按中國(guó)"陸寶麟?yún)呛?永.中國(guó)重要醫(yī)學(xué)昆蟲分類與鑒別[M].河南科學(xué)技術(shù)出版社，2003,632"進(jìn)行鑒定，經(jīng)形 態(tài)學(xué)方法準(zhǔn)確鑒定后，交于中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院復(fù)核鑒定。在鑒定無誤后，從新鮮標(biāo)本右 側(cè)后腿從股節(jié)處取下，用基因組DNA提取試劑盒（TIANampGenomicDNAKit)，按試劑盒說 明書純化得到其基因組DNA。
[0052] (3)C0I片段的獲得：以得到的基因組DNA為模板，以LC01490和HC02198為引 物，經(jīng)C0I序列PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10XPCRbuffer5iil，dNTP(2.5mMeach)2iil，EX Taq酶（5U/ii1) 0? 5ii1，LC01490 (20iiM)和HC02198 (20iiM)各 1ii1，基因組DNA3ii1， (1(1112037.5 111。反應(yīng)條件為941：3111111;941：308、501：308、721：308,20個(gè)循環(huán)；721：10111111。 使用1 %的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，接著用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 (TIANGEN，編號(hào)：DP210)純化回收，得到含C0I片段的溶液。
[0053] (4)可視化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確定：將ddH20作為模板進(jìn)行可視化PCR擴(kuò)增。 反應(yīng)體系為：l〇XPCRbuffer5ii1，dNTP(2. 5mMeach)2ii1，DNAPolymeraseI酶（5U/ii1)0. 1，LC01490(20iiM) 1ii1，探針I(yè)(20iiM)或探針I(yè)I(20iiM)4ii1，ddH20 補(bǔ)足至 50111。反應(yīng)條件為：941：3111111;941：308、501：308、721：458,30個(gè)循環(huán)。在可視化？〇?擴(kuò) 增結(jié)束后進(jìn)行下列操作：①不加空白沉默液，95°C保溫5min;②不加空白沉默液，常溫3h; ③加入空白沉默液7iU，95°C保溫5min;④加入空白沉默液7iU，常溫3h?？瞻壮聊簽?1.714MNaCl溶液。然后加入hemin(108iiM)liil，25°C保溫 60min，加入H202 (126mM)和 ABTS2_(126mM)按體積比1 :1得到的混合物2iil，2min后結(jié)果如下所示。
[0054] 反應(yīng)結(jié)果如下：
[0055] ①使用探針I(yè)的結(jié)果如下：
[0056] 不加空白沉默液（NaCl溶液），所有的顯色反應(yīng)中都變?yōu)榫G色了；加熱空白沉默 液，顯色反應(yīng)均為無色。這說明高濃度NaCl在反應(yīng)中起到沉默空白的作用，即在非美洲大 蠊樣本中高濃度的NaCl可以促進(jìn)G-四聯(lián)結(jié)構(gòu)和前綴序列配對(duì)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；常溫3h與 95°C保溫5min效果幾乎一樣，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中就將空白沉默液條件設(shè)定為NaCl(1. 714M)， 95°C保溫 5min