本發(fā)明屬于萃取探針技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種表面修飾分子印跡固相微萃取探針及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

孔雀石綠(malachitegreen,mg)又稱苯胺綠、鹽基塊綠等，是一種陽離子型的偶氮化合物，屬于三苯甲烷類染料，廣泛用于制陶業(yè)、紡織業(yè)、皮革業(yè)、食品顏色劑和細(xì)胞化學(xué)染色。在以往的漁業(yè)生產(chǎn)中，孔雀石綠被用作驅(qū)蟲劑、殺蟲劑和防腐劑大量地應(yīng)用于防治水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鰓霉病和寄生蟲病等，但其具有持久性、生物毒性和生物蓄積性等持久性有機(jī)污染物的典型特征，近年來，孔雀石綠已成為生物、食品和環(huán)境分析領(lǐng)域普遍關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。目前，孔雀石綠的檢測(cè)技術(shù)主要為液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，但傳統(tǒng)的分析方法耗時(shí)繁瑣，需要消耗大量溶劑和樣品進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間提取，并需要樣品前處理對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的痕量孔雀石綠進(jìn)行富集和凈化，以消除基質(zhì)干擾，這些繁瑣復(fù)雜的前處理工作會(huì)對(duì)分析結(jié)果帶來無法預(yù)測(cè)的誤差。

近年來，環(huán)境和生物體中獸藥孔雀石綠殘留的檢測(cè)是公認(rèn)的熱點(diǎn)問題之一。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是常規(guī)的檢測(cè)孔雀石綠的方法。然而，該方法繁瑣耗時(shí)，需要大體積的樣品來進(jìn)行痕量目標(biāo)物的富集，而且需要多步的前處理手段來消除基體的干擾。另外一個(gè)分析難點(diǎn)是孔雀石綠是水溶性的極性化合物，十分難以從極性的復(fù)雜基體中分離出來。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種表面修飾分子印跡固相微萃取探針的制備方法。該方法是以孔雀石綠為模板分子，通過將有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液在表面富含羥基的尖狀木纖維基質(zhì)進(jìn)行熱聚合反應(yīng)，獲得表面修飾分子印跡固相微萃取探針。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述方法制備的表面修飾分子印跡固相微萃取探針。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種上述表面修飾分子印跡固相微萃取探針的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種表面修飾分子印跡固相微萃取探針的制備方法，包括如下具體步驟：

s1.將功能單體和乳化劑混合，在攪拌條件下70～110℃加熱，得到分子印跡預(yù)乳液；

s2.分子印跡預(yù)乳液加入去離子水、碳酸氫鈉和引發(fā)劑，溫度升至70～110℃反應(yīng)，得到種子乳液；

s3.在種子乳液中滴加硅烷化試劑，反應(yīng)0.5～1h，得到聚丙烯酸酯乳液；

s4.將聚丙烯酸酯乳液靜置后冷卻至20～40℃，用氨水調(diào)節(jié)ph至7～9，再加入孔雀石綠模版分子，制得孔雀石綠有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液；

s5.將干凈的木質(zhì)纖維或竹質(zhì)纖維在孔雀石綠有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液中浸泡后，在80～120℃熱聚合反應(yīng)20～60min，用洗脫液洗去孔雀石綠模版分子后，得到表面修飾分子印跡固相微萃取探針。

優(yōu)選地，步驟s1中所述功能單體為甲基丙烯酸、丙烯酸、苯乙烯、丙烯酸羥丙酯、丙烯酸丁酯或丙烯酸-2-乙基己酯中的一種以上，所述乳化劑為辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基硫酸鈉或仲辛基酚聚氧乙烯醚中的一種以上，所述功能單體和乳化劑的質(zhì)量為(10～50)：1。

優(yōu)選地，步驟s1中所述攪拌的速率為10000～30000rpm/min。

優(yōu)選地，步驟s2中所述引發(fā)劑為過硫酸鉀、偶氮二異丁腈或過氧化苯甲酰，所述分子印跡預(yù)乳液和去離子水的體積比為(1～3)：1，所述碳酸氫鈉和引發(fā)劑的質(zhì)量比為(2～3)：1。

優(yōu)選地，步驟s2中所述反應(yīng)的時(shí)間為3～5h。

優(yōu)選地，步驟s4中所述靜置的時(shí)間為2～3h；步驟s5中所述浸泡的時(shí)間為5～20min，所述洗脫液為甲醇和乙酸銨，所述甲醇和乙酸銨的體積比為95：5。

上述方法制備的表面修飾分子印跡的固相微萃取探針。

優(yōu)選地，包括帶有尖端的固體基質(zhì)和涂層材料，所述的帶有尖端的固體基質(zhì)為木質(zhì)纖維或竹質(zhì)纖維；所述木質(zhì)纖維或竹質(zhì)纖維的直徑在0.1～0.2mm，所述涂層材料為有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液。

上述表面修飾分子印跡固相微萃取探針在萃取痕量的目標(biāo)物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述目標(biāo)物為孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫或隱性結(jié)晶紫中的一種以上。

另外，上述表面修飾分子印跡固相微萃取探針在電噴霧電離進(jìn)行質(zhì)譜分析中的應(yīng)用。

固相微萃取(solid-phasemicroextraction,spme)是集采樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體的前處理技術(shù)，其通過物理或化學(xué)方法，將具有吸附萃取功能的涂層材料固載在一定的基質(zhì)表面，與樣品進(jìn)行直接或間接的接觸，將目標(biāo)分析物富集濃縮，然后進(jìn)行解吸，從而對(duì)樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行分析。其具有樣品用量小、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。spme涂層材料的性質(zhì)決定了萃取容量、選擇性和靈敏度

原位電離質(zhì)譜(ambientmassspectrometry,ams)是近年來新興的一種無需或者只需很少樣品前處理步驟，在敞開的常壓環(huán)境中可直接對(duì)物體表面物質(zhì)進(jìn)行離子化的質(zhì)譜分析技術(shù)。對(duì)于復(fù)雜基體中的目標(biāo)分析物而言，spme與ams聯(lián)用是一種直接有效的分析手段。將這兩種技術(shù)聯(lián)用，能夠大大的提高檢測(cè)靈敏度、降低復(fù)雜基體的基體效應(yīng)，同時(shí)又能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品的直接、快速的分析?；诖思夹g(shù)的優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展一種可直接用于復(fù)雜基體痕量化合物固相微萃取和直接電噴霧質(zhì)譜分析的探針對(duì)樣品快速檢測(cè)具有很大的潛力，也具有重要的意義。

本發(fā)明的固相微萃取探針在對(duì)樣品中目標(biāo)物進(jìn)行萃取后，可以作為固體基質(zhì)電噴霧離子源來進(jìn)行直接電噴霧離子化質(zhì)譜分析。固相微萃取探針固定在距離質(zhì)譜入口處5-20mm的支架(例如三維移動(dòng)平臺(tái))，其尖端對(duì)準(zhǔn)質(zhì)譜入口，質(zhì)譜入口端施加高壓電場(chǎng)以進(jìn)行固相微萃取探針解吸/電離質(zhì)譜分析。該方法整合了固相微萃取和探針電噴霧質(zhì)譜技術(shù)，將固相微萃取探針作為固體基質(zhì)來誘導(dǎo)電噴霧離子化，實(shí)現(xiàn)了痕量孔雀石綠的直接、快速分析。方法學(xué)考察結(jié)果表明該方法具有良好的線性、重復(fù)性和回收率的特點(diǎn)，可有效用于目標(biāo)物的定量分析。

本發(fā)明的固相微萃取探針的涂層材料是以孔雀石綠為模版分子制成的表面分子印跡聚合膜，模版分子被洗脫下來后，印跡位點(diǎn)帶有負(fù)電荷的羧酸根(-coo^-)，可與孔雀石綠或其結(jié)構(gòu)類似化合物的帶有正電荷的伯胺基團(tuán)進(jìn)行離子鍵結(jié)合，從而達(dá)到與目標(biāo)物的特異性識(shí)別吸附。因此，本發(fā)明的固相微萃取探針對(duì)孔雀石綠或其結(jié)構(gòu)類似化合物具有很好的吸附性能，使得萃取過程的對(duì)目標(biāo)物具有極強(qiáng)的選擇性和富集能力，尤其適合用于帶有三苯甲烷和氨基基團(tuán)的孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫等化合物的分析檢測(cè)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明的固相微萃取探針以孔雀石綠為模版分子制成的表面分子印跡聚合膜，模版分子被洗脫下來后，印跡位點(diǎn)帶有負(fù)電荷的羧酸根(-coo^-)，可與帶有三苯甲烷和氨基基團(tuán)的孔雀石綠或其結(jié)構(gòu)類似化合物中正電荷的伯胺基團(tuán)進(jìn)行離子鍵結(jié)合，從而達(dá)到與帶有三苯甲烷和氨基基團(tuán)的目標(biāo)物的特異性識(shí)別吸附，可以用于直接檢測(cè)痕量的孔雀石綠。

2.本發(fā)明的方法整合了固相微萃取和探針電噴霧質(zhì)譜技術(shù)，將固相微萃取探針作為固體基質(zhì)來誘導(dǎo)電噴霧離子化，實(shí)現(xiàn)了痕量孔雀石綠的直接、快速分析。該方法具有良好的線性、重復(fù)性和回收率的特點(diǎn)，可有效用于目標(biāo)物的定量分析，尤其適合用于帶有三苯甲烷和氨基基團(tuán)的孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫等化合物的分析檢測(cè)。

3.本發(fā)明的固相微萃取探針對(duì)孔雀石綠或其結(jié)構(gòu)類似化合物具有很好的吸附性能，使得萃取過程的對(duì)帶有三苯甲烷和氨基基團(tuán)的目標(biāo)物具有極強(qiáng)的選擇性和富集能力，最高可達(dá)1854倍，且方法線性關(guān)系良好，回收率高，重復(fù)性好。

4.本發(fā)明可以針對(duì)復(fù)雜基體中的孔雀石綠進(jìn)行有效地萃取富集，其富集系數(shù)最高可達(dá)1800倍，檢出限可達(dá)0.01μg/l。

附圖說明

圖1是本發(fā)明固相微萃取探針的制備過程。

圖2是固相微萃取探針的紅外光譜圖。

圖3是本發(fā)明固相微萃取探針電噴霧離子源示意圖。

圖4是固相微萃取探針的萃取率與溶液體積和萃取時(shí)間的關(guān)系。

圖5是實(shí)施例1制備的固相微萃取探針在不同基質(zhì)中對(duì)目標(biāo)物萃取率對(duì)比圖。

圖6是有模版表面修飾分子印跡固相微萃取探針(mip-tip)與無模版表面修飾分子印跡固相微萃取探針(nip-tip)對(duì)目標(biāo)物(孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫、堿性黃ⅰ和玫紅酸)選擇性吸附的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

下述實(shí)施例中所采用的材料和試劑為：

甲基丙烯酸、丙烯酸、苯乙烯、辛基酚聚氧乙烯醚、丙烯酸羥丙酯、十二烷基硫酸鈉、丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸丁酯、乙烯基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷)、過硫酸鉀、碳酸氫鈉氨水、甲醇、冰醋酸、去離子水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：孔雀石綠(malachitegreen,mg)、隱性孔雀石綠(leucomalachitegreen,lmg)、結(jié)晶紫(crystalviolet,cv)、隱性結(jié)晶紫(leucocrystalviolet,lcv)、堿性黃ⅰ(thioflavint,tht)、玫紅酸(rosolicacid,ra)。內(nèi)標(biāo)：孔雀石綠苦味酸鹽-d5(mg-d5)。所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度均＞99％。

實(shí)施例1固相微萃取探針的制備

1.取24ml去離子水，加入0.1g甲基丙烯酸、0.05g丙烯酸、0.2g苯乙烯、0.2g丙烯酸羥丙酯、1.5g丙烯酸丁酯、1.5g丙烯酸-2-乙基己酯功能單體和0.05g辛基酚聚氧乙烯醚、0.05g十二烷基硫酸鈉乳化劑，在乳化機(jī)(20000rpm/min)攪拌15min制得預(yù)乳液備用。

2.在裝有溫度計(jì)、回流冷凝管、攪拌器的四口燒瓶中加入13ml去離子水、0.1g碳酸氫鈉、約7.5g預(yù)乳液，在250rpm/min攪拌下升溫至80℃，再加入一半的5ml0.11mol/l過硫酸鉀引發(fā)劑，反應(yīng)1h后，得到泛藍(lán)光的種子乳液。

3.把攪拌速度降低，在4h內(nèi)滴加完剩余的預(yù)乳液和過硫酸鉀溶劑至種子乳液中，得到丙烯酸酯乳液，繼續(xù)滴加乙烯基三(β-甲氧基乙氧基)硅烷，0.5h后再加入1ml過硫酸鉀以消除殘余的單體，溫度保持2.5h后，再冷卻至40℃，通過氨水調(diào)節(jié)ph至8.5，得到有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液。

4.把木纖維剪成約2cm長(zhǎng)度，然后用小刀進(jìn)一步把木纖維尖端部分削成更為尖細(xì)的尖端(外徑為0.1～0.2mm，與商品化電噴霧離子源的毛細(xì)管尺寸相近)，制作成固相微萃取探針的木纖維基質(zhì)。

5.晾干后的木質(zhì)纖維(樺木牙簽)放入通入氮?dú)獬?5min的有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液，浸泡10min。取出木質(zhì)纖維于烘箱以120℃熱聚反應(yīng)20min。

6.反應(yīng)完成后，木質(zhì)纖維浸泡于洗脫液(甲醇/乙酸銨的體積比＝95:5)，置恒溫振蕩器(轉(zhuǎn)速100rpm/min)洗脫48h，其中每24h更換一次洗脫液。洗脫完畢后，木質(zhì)纖維用去離子水沖洗干凈，晾干后即得表面修飾分子印跡固相微萃取探針，如圖1所示。

實(shí)施例2

1.取24ml去離子水，加入0.3g甲基丙烯酸、0.15g丙烯酸、0.6g苯乙烯、0.6g丙烯酸羥丙酯、4.5g丙烯酸丁酯、4.5g丙烯酸-2-乙基己酯功能單體和0.15g十二烷基硫酸鈉和仲辛基酚聚氧乙烯醚乳化劑，在乳化機(jī)(10000rpm/min)攪拌15min制得預(yù)乳液備用。

2.在裝有溫度計(jì)、回流冷凝管、攪拌器的四口燒瓶中加入13ml去離子水、0.1g碳酸氫鈉、約7.5g預(yù)乳液，在250rpm/min攪拌下升溫至110℃，再加入一半的5ml0.11mol/l偶氮二異丁腈引發(fā)劑，反應(yīng)3h后，得到泛藍(lán)光的種子乳液。

3.把攪拌速度降低，在4h內(nèi)滴加完剩余的預(yù)乳液和過硫酸鉀溶劑至種子乳液中，得到丙烯酸酯乳液，繼續(xù)滴加乙烯基三(β-甲氧基乙氧基)硅烷，反應(yīng)0.5h后再加入1ml過硫酸鉀以消除殘余的單體，溫度保持2h后，再冷卻至40℃，通過氨水調(diào)節(jié)ph至7，得到有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液。

4.把木纖維剪成約2cm長(zhǎng)度，然后用小刀進(jìn)一步把木纖維尖端部分削成更為尖細(xì)的尖端(外徑為0.1～0.2mm，與商品化電噴霧離子源的毛細(xì)管尺寸相近)，制作成固相微萃取探針的木纖維基質(zhì)。

5.晾干后的木質(zhì)纖維放入通入氮?dú)獬?5min的有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液，浸泡10min。取出木質(zhì)纖維于烘箱以120℃熱聚反應(yīng)20min。

6.反應(yīng)完成后，木質(zhì)纖維浸泡于洗脫液(甲醇/乙酸銨的體積比＝95:5)，置恒溫振蕩器(轉(zhuǎn)速100rpm/min)洗脫48h，其中每24h更換一次洗脫液。洗脫完畢后，木質(zhì)纖維用去離子水沖洗干凈，晾干后即得表面修飾分子印跡固相微萃取探針。

實(shí)施例3

1.取24ml去離子水，加入0.51g甲基丙烯酸、0.26g丙烯酸、1g苯乙烯、1g丙烯酸羥丙酯、7.7g丙烯酸丁酯、7.7g丙烯酸-2-乙基己酯功能單體和0.26g辛基酚聚氧乙烯醚、0.26g十二烷基硫酸鈉乳化劑，在乳化機(jī)(30000rpm/min)攪拌15min制得預(yù)乳液備用。

2.在裝有溫度計(jì)、回流冷凝管、攪拌器的四口燒瓶中加入13ml去離子水、0.1g碳酸氫鈉、約7.5g預(yù)乳液，在250rpm/min攪拌下升溫至70℃，再加入一半的5ml0.11mol/l過氧化苯甲酰引發(fā)劑，反應(yīng)5h后，得到泛藍(lán)光的種子乳液。

3.把攪拌速度降低，在4h內(nèi)滴加完剩余的預(yù)乳液和過硫酸鉀溶劑至種子乳液中，得到丙烯酸酯乳液，繼續(xù)滴加乙烯基三(β-甲氧基乙氧基)硅烷，反應(yīng)1h后再加入1ml過硫酸鉀以消除殘余的單體，溫度保持3h后，再冷卻至20℃，通過氨水調(diào)節(jié)ph至9，得到有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液。

4.把木纖維剪成約2cm長(zhǎng)度，然后用小刀進(jìn)一步把木纖維尖端部分削成更為尖細(xì)的尖端(外徑為0.1～0.2mm，與商品化電噴霧離子源的毛細(xì)管尺寸相近)，制作成固相微萃取探針的木纖維基質(zhì)。

5.晾干后的竹質(zhì)纖維放入通入氮?dú)獬?5min的有機(jī)硅改性丙烯酸酯分子印跡乳液，浸泡10min。取出竹質(zhì)纖維于烘箱以80℃熱聚反應(yīng)60min。

6.反應(yīng)完成后，竹質(zhì)纖維浸泡于洗脫液(甲醇/乙酸銨的體積比＝95:5)，置恒溫振蕩器(轉(zhuǎn)速100rpm/min)洗脫48h，其中每24h更換一次洗脫液。洗脫完畢后，竹質(zhì)纖維用去離子水沖洗干凈，晾干后即得表面修飾分子印跡固相微萃取探針。

實(shí)施例4固相微萃取探針的表征

圖2為固相微萃取探針的紅外光譜圖。其中，a為無涂層木質(zhì)纖維的固相微萃取探針，b為無模版表面修飾分子的固相微萃取探針，c為有模版表面修飾分子的固相微萃取探針。從圖2中可知，有分子印跡聚合膜涂層的探針比無涂層木質(zhì)纖維明顯多出許多官能團(tuán)的吸收峰。丙烯酸酯聚合后表露出的－coo^-特異性識(shí)別位點(diǎn)增多，使得1734cm^-1c＝o的伸縮振動(dòng)吸收峰變強(qiáng)。而無模版分子的表面修飾分子印跡固相微萃取探針與有模版分子的表面修飾分子印跡固相微萃取探針的紅外譜圖的差異主要在3440cm^-1處，有模版分子的表面修飾分子印跡固相微萃取探針在3440cm^-1的吸收峰更強(qiáng)，主要因?yàn)橛锌兹甘G模版分子的紅外吸收。

實(shí)施例5萃取及固相微萃取探針電噴霧質(zhì)譜分析

圖3是本發(fā)明固相微萃取探針電噴霧離子源示意圖。將微萃取探針于含有目標(biāo)物的基體中進(jìn)行萃取后，將高壓電場(chǎng)加載于微萃取探針，并滴加噴霧溶劑使得目標(biāo)物解吸并誘導(dǎo)電噴霧的形成，直接于質(zhì)譜中進(jìn)行分析。

樣品萃取的操作方式與固相微萃取的萃取方式一致，采用直接萃取的模式。萃取后，將固相微萃取探針固定在三維移動(dòng)臺(tái)上，使探針尖端對(duì)準(zhǔn)質(zhì)譜入口并距離質(zhì)譜入口約10mm，使用移液槍將10μl的解吸溶劑滴加到探針尖端的表面，解吸的樣品溶液在質(zhì)譜的真空系統(tǒng)作用下形成一股吸力，通過探針表面的分子印跡涂層向探針的尖端移動(dòng)，在尖端形成泰勒錐，在毛細(xì)管端口的高壓電場(chǎng)作用下形成帶電液滴細(xì)的噴霧，液滴在電場(chǎng)和真空系統(tǒng)的作用下，飛向毛細(xì)管。在高流量的高溫反吹干燥氮?dú)獾姆聪蛄鲃?dòng)，噴霧液滴進(jìn)一步脫溶劑形成帶電荷的氣相離子，通過質(zhì)譜入口進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行分析。

固相微萃取探針電噴霧質(zhì)譜分析：正離子檢測(cè)模式，離子傳輸管溫度350℃，錐口電壓為65v，八極桿電壓為750v，霧化器壓力為1psi，干燥器流量為1l/min，串聯(lián)四極桿質(zhì)譜分析采用選擇高分辨掃描模式，掃描質(zhì)量范圍100～500m/z，離子參數(shù)見表1。從表1中可知，在優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓與毛細(xì)管電壓的參數(shù)后，使mg、lmg、cv、lcv和mg-d5的[m+h]⁺峰的響應(yīng)信號(hào)達(dá)到最大，獲得最佳的子離子，故選擇豐度最高的子離子的電壓參數(shù)為電離最佳參數(shù)。

表1各種化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)

注：*標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)內(nèi)標(biāo)物

實(shí)施例6萃取條件研究

在純凈水樣品中以50μg/l的添加量加入mg，研究不同萃取條件(溶液體積、萃取時(shí)間)對(duì)萃取結(jié)果的影響，如圖4所示。其中，圖4(1)為不同溶液體積(5、10、50、100、150、200ml)下的萃取結(jié)果。，圖4(2)為萃取時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響。從圖4(1)中可知，增加溶液體積有利于提供更多的目標(biāo)物，從而提高萃取效率。在低濃度范圍內(nèi)，提高溶液體積明顯有利于萃取效率的提升，但當(dāng)達(dá)到一定體積后(100ml)，萃取達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，溶液體積進(jìn)一步的增加無法明顯地提升萃取效率。從圖4(2)中可知，分析物在樣品溶液及固相微萃取探針之間的分布是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，萃取效率隨著萃取時(shí)間的增加而提升，直到在40min時(shí)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。

實(shí)施例7萃取能力研究

樣品萃取的操作方式與固相微萃取的萃取方式一致，采用直接萃取的模式。

水樣(去離子水和河水)：采用蒸餾水或河水各采配制mg、lmg、cv和lcv濃度為50μg/l的混合加標(biāo)樣品，有模版分子的表面修飾分子印跡固相微萃取探針(mip-tip)置于去離子水和河水中400rpm攪拌萃取40min。

牛奶樣品：mip-tip加入到牛奶采配制mg、lmg、cv和lcv濃度為50μg/l的混合加標(biāo)樣品中400rpm攪拌萃取60min。

萃取完后，將固相微萃取探針快速從樣品中取出，然后放入去離子水中潤(rùn)洗10s后取出，待自然晾干后進(jìn)行固相微萃取探針電噴霧質(zhì)譜分析，研究固相微萃取探針的抗干擾萃取能力(圖5)。

圖5是實(shí)施例1制備的固相微萃取探針在不同基質(zhì)(去離子水、河水和牛奶)中對(duì)mg、lmg、cv和lcv萃取率對(duì)比圖。從圖5中可知，固相微萃取探針在江水和牛奶中萃取mg、lmg、cv和lcv的吸附量比在去離子水中的吸附量低，江水和牛奶中含有許多復(fù)雜基質(zhì)，直接影響到目標(biāo)化合物的吸附效率，但總體來看，即便在食品和環(huán)境樣品的復(fù)雜基體中，mip-tip仍對(duì)mg和cv及其代謝產(chǎn)物有較好的選擇性吸附。

本發(fā)明固相微萃取探針的萃取能力通過研究mip-tip在不同基體中的富集倍數(shù)來確定。在水樣基體中，500ml(5倍最優(yōu)量)的樣品溶液進(jìn)行120min(3倍最優(yōu)時(shí)間)的萃取，以模擬原位分析條件。對(duì)于牛奶樣品，采用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，即，100ml溶液下萃取60min。所獲得的富集倍數(shù)如表2所示。表2為固相微萃取探針萃取不同基質(zhì)中mg類化合物的富集倍數(shù)。從表2中可知，本發(fā)明的固相微萃取探針對(duì)于水基體具有非常理想的富集能力。對(duì)于純凈水、河水樣本，富集倍數(shù)值達(dá)到約1100-1800倍。不同的水基體對(duì)固相微萃取探針的富集能力影響并不明顯。

在牛奶樣品中，最佳萃取條件下的富集倍數(shù)值可達(dá)400-550倍。盡管在牛奶樣本中，由于基體雜質(zhì)的干擾，其富集能力遠(yuǎn)低于水樣，然而，如此的富集能力已比現(xiàn)有的方法提高了1個(gè)數(shù)量級(jí)的靈敏度。

表2固相微萃取探針萃取不同基質(zhì)中mg類化合物的富集倍數(shù)

實(shí)施例8特異性吸附研究

圖6是有模版表面修飾分子印跡固相微萃取探針(mip-tip)與無模版表面修飾分子印跡固相微萃取探針(nip-tip)對(duì)樣品(mg、lmg、cv、lcv、tht和ra)選擇性吸附的結(jié)果。其中，圖6(1)為孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫、堿性黃ⅰ和玫紅酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖6(2)為mip-tip萃取50μg/l孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫、堿性黃ⅰ和玫紅酸混合加標(biāo)去離子水樣品分析示意圖；圖6(3)為nip-tip萃取50μg/l孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫、堿性黃ⅰ和玫紅酸混合加標(biāo)去離子水樣品分析示意圖。采用的化合物的結(jié)構(gòu)與mg的結(jié)構(gòu)部分相同，如圖6(1)所示，研究mip-tip的特異性識(shí)別基團(tuán)與吸附能力。總體而言mip-tip表面的分子印跡涂層對(duì)帶有氨基基團(tuán)的化合物有明顯的吸附、富集效果，而對(duì)三苯類結(jié)構(gòu)的化合物無吸附作用，如圖6(2)所示，說明分子印跡涂層的特異性識(shí)別位點(diǎn)是通過與化合物的氨基基團(tuán)識(shí)別結(jié)合。nip-tip對(duì)mg、lmg、cv、lcv、tht有一定的吸附作用，如圖6(3)所示，但其富集效果遠(yuǎn)不足mip-tip的明顯，說明mip-tip對(duì)孔雀石綠模版分子及其結(jié)構(gòu)類似化合物具有優(yōu)越的特異性識(shí)別吸附能力。

實(shí)施例9定量準(zhǔn)確性研究

在去離子水中添加濃度范圍0.1-100μg/l的mg、lmg、cv和lcv混合標(biāo)樣，研究固相微萃取探針電噴霧質(zhì)譜分析的定量準(zhǔn)確性。表3為固相微萃取探針電噴霧質(zhì)譜分析孔雀石綠類化合物的線性方程、范圍、檢出限、重復(fù)性和回收率。將mg-d5添加到噴霧溶劑中，作為10μg/l濃度水平下的氘代同位素內(nèi)標(biāo)化合物。內(nèi)標(biāo)化合物用于分析過程的誤差校準(zhǔn)，可以大大地提高方法的重復(fù)性。結(jié)果表明，本發(fā)明方法具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r²)不低于0.9948，如表3所示。最低檢出限為0.01–0.05μg/l(由信噪比為3時(shí)的峰的濃度確定)。

考察不同探針之間的可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，以同樣的發(fā)明方法制備6根不同的固相微萃取探針，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了良好的重復(fù)性，rsds不高于10.8％。回收率試驗(yàn)顯示該方法具有良好的準(zhǔn)確性，回收率達(dá)93.7～99.6％。這些結(jié)果顯示了本發(fā)明的固相微萃取探針電噴霧質(zhì)譜法可以適用于痕量水平孔雀石綠的直接定量檢測(cè)。

表3固相微萃取探針電噴霧質(zhì)譜分析孔雀石綠類化合物的

線性方程、范圍、檢出限、重復(fù)性和回收率

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合和簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。