一種快速區(qū)分prv中國型、歐美型及疫苗株的雙色熒光檢測方法、引物及探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha?K61的雙色熒光檢測方法、引物及探針。該方法結合了實時熒光PCR技術及熔解曲線分析技術，根據(jù)熔解曲線Tm值差異鑒定豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha?K61；操作簡單：只需一個反應即可實現(xiàn)兩個基因型及疫苗株Bartha?K61的鑒別檢測；檢測速度快且高通量：全部操作過程可在3小時內(nèi)完成，不需要病毒的細胞培養(yǎng)，極大縮短了豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha?K61鑒別檢測所需時間；準確性高、特異性好，重復性好，可以準確、快速、高通量地進行分析，有利于在臨床實踐中推廣應用。
【專利說明】
一種快速區(qū)分PRV中國型、歐美型及疫苗株的雙色熒光檢測方法、引物及探針
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及病毒不同基因型，及疫苗毒與野毒株的鑒別方法，具體涉及一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)中國型、歐美型及疫苗株Bartha_K61的雙色熒光檢測方法和試劑盒，該方法是一種基于兩條雙標記自猝滅探針的探針熔解曲線分析技術，用于豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的檢測方法。
【背景技術】
[0002]2011以來，我國華北、華中、華南等地規(guī)模化豬場先后出現(xiàn)免疫過豬偽狂犬疫苗后爆發(fā)偽狂犬病，部分豬場豬群野毒抗體陽性率高達100%，妊娠母豬35%出現(xiàn)流產(chǎn)，這是我國生豬養(yǎng)豬業(yè)遭遇的重大沖擊。疫苗免疫接種是當前控制豬偽狂犬病的有效手段，目前我國共有4種PRV商品化弱毒疫苗(Bartha-K61株、Bucharest株、HB-98株，及SA215株)臨床使用，其中Bartha-K61株市場占有率較高。另有I種商品化滅活疫苗:鄂A株也有銷售。滅活苗在安全性方面高于弱毒苗，但不能在偽狂犬病毒潛伏組織(如三叉神經(jīng)等)中增殖，對有潛伏感染的豬不能起到預防作用;豬偽狂犬基因缺失疫苗毒力較弱、免疫原性較好，但有毒力返強導致疾病流行、潛伏感染引起散毒的危險，所以有必要建立配套的疫苗檢測方法。2015年，童光志等通過PRV全基因及67個基因的進化分析，證實PRV可以分為兩個進化分支:歐美型(Genotype I，見于歐洲、美洲、澳大利亞、亞洲等地)和中國型(Genotype II，見于中國、馬來西亞等地)，歐美型的代表株有Bartha、Becker、Kaplan、HS等；中國型的代表株有Fa、Ea、HeNl、JS、TJ等(Chao Ye, eta I, Guang-Zhi Tong.Virology (2015) 483: 32-43)。目前豬偽狂犬病毒的流行毒株與中國型毒株Fa及Ea株親緣關系較近(Xiuling Yu，etal,
&,Kegong Tian.Emerging Infect1us Diseases (2014) 20: 102-104;Yinbiao Wang,etal, &, Gaiping Zhang.Virus Genes (2015) 50: 401-409)，有必要跟蹤檢測臨床是否有歐美型的出現(xiàn)，所以建立中國型與歐美型豬偽狂犬病毒的鑒別檢測方法意義重大。
[0003]根據(jù)基因缺失苗缺失全部或部分gE基因而建立的gpI(gE)抗體ELISA檢測試劑盒及gB抗體ELISA檢測試劑盒，雖然配合使用可以達到鑒定疫苗毒感染的目地，但抗體檢測存在嚴重滯后性，同時也無法鑒別毒株類型，不利于進一步指導疫苗免疫，因此目前也急需一種操作相對簡易、檢測結果可靠且可高通量、快速的區(qū)分豬偽狂犬病毒不同基因型及疫苗株的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述存在的問題，本發(fā)明建立了一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光PCR檢測方法，該方法操作簡易、快速、高通量、檢測結果可靠，有利于在臨床實踐中推廣應用。
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光PCR弓I物及探針。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光PCR方法。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光PCR試劑盒。
[0008]本發(fā)明所采取的技術方案是:
一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光PCR引物，其核苷酸序列如下所示:
引物F:5’-GGGCGTCTACACGTGGCGC-3’(SEQ ID N0:1)，
引物R:5’-GTTGGTCACGAAGGCGGCGT-3’(SEQ ID NO:2)。
[0009]—種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha_K61的雙色熒光PCR探針，其核苷酸序列如下所示:
探針P1:5’-CGCAGCGCCAACGTCTCGCTCGTCCTGTAC-3’(SEQ ID NO:3)，探針P2:5’-CCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCC-3’(SEQ ID NO:4)。
[0010]進一步的，所述探針序列5’端標記的熒光基團為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種，探針序列3 ’端標記的淬滅基團為TAMRA、MGB、BHQ中一種;且探針PI和P2的5 ’端標記的熒光基團不相同。
[0011 ] 一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha_K61的雙色熒光PCR試劑盒，該試劑盒中含有上述所述的引物。
[0012]進一步的，上述試劑盒中還含有上述所述的探針。
[0013]一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha_K61的雙色熒光PCR方法，包括以下步驟:
1)從樣品中提取病毒DNA；
2)以提取的DNA為模板，用上述所述的引物對F、R，及上述所述探針Pl和探針P2進行熒光PCR擴增反應獲得擴增產(chǎn)物；
3)對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析，確定樣品中的病毒類型。
[0014]進一步的，步驟2)中的熒光PCR擴增反應體系為:
Premix Ex-Taq5.Ομ?
引物 Ρ1(1μΜ)0.4μ1
引物Ρ2(10 μΜ)0.4μ1
探針 Probe I (10 μΜ) 0.2μ1探針Probe2(10 μΜ) 0.2μ1模板1.Ομ?
CldH2O2.8μ1ο
[0015]進一步的，步驟2)中的熒光PCR擴增反應程序為:95°C預變性5min;95°C變性20s，60 °C退火20s，72 °C延伸20s;循環(huán)55次。
[0016]進一步的，步驟3)中的熔解曲線分析程序為:95°(:變性10 sec; 40 V到97°C以0.130C/s的速率，5次/ 0C連續(xù)采集探針Pl和P2的熒光信號，進行熔解曲線分析。
[0017]進一步的，步驟3)中所述熔解曲線分析的具體分析過程為:
I)在探針Pl的熒光檢測結果中，以Bartha-K61標準樣品為對照時，若樣品熔解溫度和陽性對照Bartha-K61熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C時，則判定為歐美型豬偽狂犬病毒；
2)在探針Pl的熒光檢測結果中，以HDDJ標準樣品為對照時，若樣品熔解溫度和陽性對照HDDJ熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC時，則判定為中國型豬偽狂犬病毒；
3)在探針P2的熒光檢測結果中，以Bartha-K61標準樣品為對照時，若樣品熔解溫度和陽性對照Bartha-K61熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C時，則判定為Bartha_K61疫苗株。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:
I)本發(fā)明首次建立了一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-Kei的雙色熒光檢測方法、引物及探針。操作簡單:只需一個反應即可實現(xiàn)中國型、歐美型與疫苗株Bartha-K61的鑒別檢測;檢測速度快且高通量:全部操作過程可在3小時內(nèi)完成，不需要病毒的細胞培養(yǎng)，極大縮短了豬偽狂犬病毒中國型、歐美型毒株與Bartha-K61疫苗株鑒別檢測所需時間;準確性高、特異性好，重復性好，可以準確、快速、高通量地進行分析，有利于在臨床實踐中推廣應用。
[0019]2)本發(fā)明的PCR引物對F/R，對豬偽狂犬病毒野毒中國型、歐美型、及疫苗株Bartha-K61可特異性擴增，有助于提高PCR的效率，減少病毒鑒別分型的時間。探針Pl可特異性與豬偽狂犬病毒中國型和歐美型核酸位點雜交，特異性較好。探針P2可特異性與豬偽狂犬病毒Bartha-K61疫苗株及其它非Bartha-K61毒株鑒別位點雜交，特異性較好。引物F/R、探針Pl和P2，均不與其他常見豬繁殖障礙相關病毒核酸結合，有利于提高本發(fā)明對結果分析的正確性。
[0020]4)本發(fā)明一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光檢測方法的最低檢測限可達到單拷貝，靈敏度較高。
【附圖說明】
[0021]圖1為陽性標準化樣本基因進化分析圖，其中?為標準化樣本中國型HDDJ，▲為標準化樣本中國型Ea，■為為標準化樣本中國型Fa，?為標準化樣本Bartha_K61疫苗株(同時也是歐美型)，Λ為標準化樣本歐美型HS;
圖2為標準化樣品雙色熒光檢測方法熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測熔解曲線圖，B和C分別為FAM和HEX單通道分別檢測熔解曲線圖；標準樣品為Bartha_K61疫苗株(同時也是歐美型)，非Bartha-K61毒株HDDJ(同時也是中國型)；
圖3為雙色熒光檢測方法特異性試驗熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測熔解曲線圖，8和(:分別為FAM和HEX單通道分別檢測熔解曲線圖；
圖4為雙色熒光檢測方法陽性質(zhì)粒p-Bartha-K61靈敏度試驗擴增曲線圖和熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測擴增曲線圖，B為FAM和HEX雙通道同時檢測熔解曲線圖，C和D分別為FAM單通道和HEX單通道分別檢測擴增曲線圖；E和F分別為FAM單通道和HEX單通道分別檢測熔解曲線圖；
圖5為雙色熒光檢測方法陽性質(zhì)粒p-HDDJ靈敏度試驗擴增曲線圖和熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測擴增曲線圖，B*FAM和HEX雙通道同時檢測熔解曲線圖，C和D分別為FAM單通道和HEX單通道分別檢測擴增曲線圖；E和F分別為FAM單通道和HEX單通道分別檢測熔解曲線圖；
圖6為臨床樣品雙色熒光檢測方法熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測熔解曲線圖，B和C分別為FAM和HEX單通道分別檢測熔解曲線圖；標準樣品Bar tha_K61疫苗株(同時也是歐美型)和非Bartha-K61毒株HDDJ(同時也是中國型)為陽性對照，臨床樣本4個，編號分別為INT、S、ZZ、LC;結果顯示樣本INT和S為歐美型毒株，ZZ和LC為中國型毒株，都不是Bar tha_K61疫苗株。該結果已經(jīng)過測序驗證。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0023]實施例1引物及探針
經(jīng)過對所設計的大量引物和探針進行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對F、R，及探針Pl和P2對雙色熒光法區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的效果最好，其堿基序列如下所示。
[0024]引物F:5，-GGGCGTCTACACGTGGCGC-3，(SEQID N0:1)，
引物R:5’-GTTGGTCACGAAGGCGGCGT-3’(SEQ ID NO:2)，
探針P1:5’-FAM-CGCAGCGCCAACGTCTCGCTCGTCCTGTAC- BHQ1-3'(SEQ ID NO:3)，
探針P2:5’-HEX- CCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCC-BHQ1-3' (SEQ ID NO:4)。
[0025]實施例2標準樣品的制備、雙色熒光PCR擴增及熔解曲線分析 I)豬偽狂犬病毒DNA的提取:
分別取疑似感染有PRV的病料樣品，病料樣品可以是病死豬的淋巴結、腦、心、肝、脾、肺、腎、扁桃體等組織，或采集豬血清或鼻式子。血清可直接取200μ1備用；鼻式子需溶解于ImL PBS鹽酸緩沖溶液中，靜置10-20min后取200μ1備用；病死豬的組織樣本需研磨后離心取上清200μ1備用;Bartha-K61疫苗，加入3mL PBS鹽酸緩沖溶液進行溶解，取200yL備用。按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extract1n Kit Ver.4.0的說明書進行核酸提取。
[0026]2)標準樣品的制備:
為了驗證本發(fā)明方法可行性與可靠性，同時構建標準陽性樣品(經(jīng)序列測定正確)，為之后的臨床樣品檢測提供陽性對照，本發(fā)明需先制備豬偽狂犬病毒Bartha-K61疫苗株(同時也是歐美型)、歐洲型毒株HS、中國型毒株HDDJ、中國型毒株Fa、中國型毒株Ea陽性標準樣品。標準樣品的制備步驟如下:取Bartha-K61疫苗株(同時也是歐美型)、歐洲型毒株HS、中國型毒株HDDJ、中國型毒株Fa、中國型毒株Ea，分別在ST細胞(豬睪丸細胞)傳代培養(yǎng)至狀態(tài)穩(wěn)定，取200μ1病毒液按照豬偽狂犬病毒DNA的提取方法進行提取核酸，作為陽性標準品。
[0027]通過上述方法，分別獲得含有目的基因片斷的豬偽狂犬病毒Bartha-K61疫苗株(同時也是歐美型)、歐洲型毒株HS、中國型毒株HDDJ、中國型毒株Fa、中國型毒株Ea。
[0028]為驗證所選標準陽性樣本的基因型，按照文獻報道(ChaoYe, etal，<fe，Guang_Zhi Tong.Virology (2015) 483: 32-43)，選取相應具有分型特點的基因做進化樹分析，如圖1所示。
[0029]圖1為標準化樣本gC基因進化分析圖，其中?為標準化樣本中國型HDDJ，▲為標準化樣本中國型Ea，■為為標準化樣本中國型Fa，?為標準化樣本Bartha_K61疫苗株(同時也是歐美型)，Λ為標準化樣本歐美型HS。從圖1可以看出Bartha-K61疫苗株、HS為歐美型(Genotype I)，HDDJ、Fa、Ea為中國型(Genotype II) ο[0030 ] 3 )陽性標準樣品的熒光PCR操作步驟:
分別以上述獲得的三種陽性標準樣品為DNA模板，分別進行熒光PCR擴增反應和熔解曲線分析；
PCR反應體系:
CldH2O2.8μ1
Premix Ex-Taq5.Ομ?
ΙμΜ 引物F0.4μ1
ΙΟμΜ 引物R0.4μ1
ΙΟμΜ Pl0.2μ1
ΙΟμΜ Ρ20.2μ1
模板1.Ομ?
總體積10μ1。
[0031 ] PCR擴增反應程序如下:
95°C 預變性 5min;95°C 變性 208，60°(:退火208，72°(:延伸208;循環(huán)55次。
[0032]熔解曲線分析程序如下:
95 °C變性1 se c; 40 °C到97 °C以0.13 °C /s的速率，5次/ °C連續(xù)采集FAM和HEX熒光信號，進行熔解曲線分析。
[0033]4)陽性標準樣品熔解曲線分析結果分析
PCR擴增產(chǎn)物用LightCycler 96分析儀進行分析。豬偽狂犬病毒5個陽性標準樣品熔解曲線分析結果如圖2所示。
[0034]圖2為陽性標準樣品雙色熒光檢測方法熔解曲線圖，圖2A為圖2B和圖2C熒光曲線的置加圖。
[0035]圖2B為FAM熒光通道分析結果(即探針Pl的熒光檢測結果)，從中可以看出，歐美型毒株Bartha-K61、HS和中國型毒株HDDJ、Fa、Ea標準樣品的熔解曲線相互分開，表明所設計引物F、R及探針Pl適合用于豬偽狂犬病毒中國型和歐美型兩種基因型的熔解曲線分析。根據(jù)兩種陽性標準樣品熔解溫度(Tm)的不同，歐美型毒株Bartha-K61、HS熔解溫度較低為70.42 ± 0.15 °C，中國型毒株HDDJ熔解溫度較高為76.8 ± 0.07 °C (圖2A和圖2B)。
[0036]圖2C為HEX熒光通道的分析結果(即探針P2的熒光檢測結果)，從中可以看出，疫苗株Bar tha-K61和非Bar tha_K61毒株HS、HDDJ、Fa、Ea標準樣品熔解曲線相互分開，表明所設計引物F、R及探針P2適合用于豬偽狂犬病毒疫苗株Bartha-K61和非Bartha-K61毒株的熔解曲線分析。根據(jù)兩種標準樣品熔解溫度(Tm)的不同，疫苗株Bartha-K61熔解溫度較低為71.66°C，非Bartha-K61毒株熔解溫度較高為76.08±0.08°C(圖2A和圖2C)。
[0037]實施例3特異性實驗
下面對本發(fā)明建立的檢測方法作特異性檢測。
[0038]分別提取其他常見豬繁殖障礙性疾病相關病毒核酸，如提取豬瘟病毒(classicalswine fever virus , CSFV)、豬乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、豬圓環(huán)2型(Porcine circovirus type 2，PCV 2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus , PRRSV)，豬細小病毒(PorcinePPV的核酸及水分別作為PCR模板，以上述(2)中的PCR擴增反應和熔解曲線分析方法進行分析，并與豬偽狂犬病毒Bartha-K61疫苗株(同時也是歐美型)和非Bartha-K61毒株HDDJ(同時也是中國型)陽性標準樣品進行對比分析，熔解曲線峰型化圖如圖3所示。
[0039]從圖3A~C中可以看出，本發(fā)明檢測方法只能特異性擴增出豬偽狂犬病毒Bartha-K61疫苗株(同時也是歐美型)和非Bartha-K61毒株HDDJ(同時也是中國型)陽性標準樣品熔解峰，而其它豬繁殖障礙性疾病相關病毒，如CSFV、JEV、PRRSV、PCV 2和PPV都沒有擴增出特異熔解峰。表明引物F、R及探針Pl和P2特異性較好，可以用于豬偽狂犬病毒中國型與歐美型，及疫苗株Bartha-K61的熒光檢測。
[0040]實施例4靈敏度實驗
下面對本發(fā)明建立的檢測方法作靈敏度檢測。
[0041 ]以實施例2中標準品Bartha_K61為模板，引物Pl和P2為擴增引物，將擴增產(chǎn)物克隆至PMD18T_Vector中，構建陽性質(zhì)粒p-Bartha_K61，對p-Bartha_K61做核酸檢測，換算質(zhì)粒數(shù)，做10倍梯度稀釋，形成1.(^109、1.(^108、1.(^107、1.(^106、1.(^105、1.(^104、1.(^103、1.0xl02、l.0xlO1U.0x1q copies/μ?共10個梯度，按上述實施例2中的熒光PCR擴增反應和熔解曲線分析方法進行分析，擴增曲線圖和熔解曲線峰型化圖如圖4所示。
[0042]圖4為陽性質(zhì)粒p-Bartha_K61的雙色熒光檢測方法靈敏度試驗擴增曲線圖和熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測的擴增曲線圖，S卩C和D圖中曲線的疊加圖；C和D分別為FAM單通道和HEX單通道檢測的擴增曲線圖；B為FAM和HEX雙通道同時檢測的熔解曲線圖，S卩E和F圖中曲線的疊加圖;E和F分別為FAM單通道和HEX單通道檢測的熔解曲線圖。從中可以看出該檢測方法隨著核酸濃度的降低呈現(xiàn)明顯的下降的熒光信號，質(zhì)粒個數(shù)低至1.0 copy/μ?，F(xiàn)AM通道和HEX通道還可以檢測到相應熒光信號。
[0043]按照上述同樣的方法構建陽性質(zhì)粒p-HDDJ，10倍梯度稀釋，用上述實施例2中的熒光PCR擴增反應和熔解曲線分析方法進行分析，擴增曲線圖和熔解曲線峰型化圖如圖5所不O
[0044]圖5為陽性質(zhì)粒p-HDDJ的雙色熒光檢測方法靈敏度試驗擴增曲線圖和熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測的擴增曲線圖，S卩C和D圖中曲線的疊加圖；C和D分別為FAM單通道和HEX單通道檢測的擴增曲線圖；B*FAM和HEX雙通道同時檢測的熔解曲線圖，SPE和F圖中曲線的疊加圖；E和F分別為FAM單通道和HEX單通道檢測的熔解曲線圖。從中可以看出該檢測方法隨著核酸濃度的降低呈現(xiàn)明顯的下降的熒光信號，質(zhì)粒個數(shù)低至1.0copy/μ?，F(xiàn)AM通道和HEX通道還可以檢測到相應熒光信號。
[0045]上述檢測結果說明本發(fā)明方法靈敏度較高。
[0046]實施例5臨床樣品熒光PCR擴增及熔解曲線分析
I)從樣本中提取病毒核酸:方法同上述實施例2中核酸提取方法，提取4份臨床樣品中的病毒核酸；
2 )以提取的病毒核酸為模板，方法同上述實施例2中熒光PCR擴增反應和熔解曲線分析；同時以實施例2中所述的陽性標準品豬偽狂犬病毒Bartha-K61疫苗株(同時也是歐美型)和非Bartha-K61毒株HDDJ(同時也是中國型)作為陽性對照。
[0047]3)臨床樣品熔解曲線分析結果分析熒光PCR擴增產(chǎn)物用LightCycler 96分析儀進行分析。本發(fā)明檢測了4份臨床樣品，熔解曲線分析結果如圖6所示。
[0048]從圖6的臨床樣品雙色熒光檢測方法熔解曲線圖上可看出，分析FAM熒光通道(SP探針Pl的檢測結果)時，以PRV歐美型Bartha-K61和中國型HDDJ標準樣品熔解曲線作為對照時，待檢樣品和陽性對照Bartha-K61之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于1.0°C時判定為歐美型PRV;待檢樣品和陽性對照HDDJ之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于1.0°C時判定為中國型PRV;結果顯示，所檢測的4份臨床樣本中編號INT和S為歐美型PRV，編號ZZ和LC為中國型PRV(見圖6A和B)。
[0049]分析HEX熒光通道(即探針P2的檢測結果)時，以PRV疫苗株Bartha_K61和非Bar tha-K61毒株HDD J標準樣品熔解曲線作為對照時，待檢樣品和陽性對照Bartha_K61之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于1.0°C時判定為PRV疫苗株Bartha-K61;待檢樣品和陽性對照HDDJ之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于1.0°C時判定為非PRV疫苗Bartha-K61;結果顯示，所檢測的4份臨床樣本中INT、S、ZZ和LC都不是PRV疫苗株Bartha-K61。
[0050]綜合上述FAM通道和HEX通道結果(即探針Pl和P2的檢測結果)，判定4份臨床樣本中編號為INT和S的均為歐美型PRV，ZZ和LC均為中國型PRV，都不是PRV疫苗株Bartha-K61。該結果已經(jīng)過測序驗證。
[0051]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1.一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光PCR引物，其核苷酸序列如下所示: 引物F:5’-GGGCGTCTACACGTGGCGC-3’(SEQ ID N0:1)， 引物R:5’-GTTGGTCACGAAGGCGGCGT-3’(SEQ ID NO:2)。2.一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光PCR探針，其核苷酸序列如下所示: 探針Pl: 5 ’ -CGCAGCGCCAACGTCTCGCTCGTCCTGTAC-3 '(SEQ ID NO: 3)， 探針P2:5’-CCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCC-3’(SEQ ID NO:4)。3.根據(jù)權利要求2所述的探針，其特征在于，所述探針序列5’端標記的熒光基團為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種，探針序列3’端標記的淬滅基團為TAMRA、MGB、BHQ中一種;且探針PI和P2的5 ’端標記的熒光基團不相同。4.一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒中含有權利要求1所述的引物。5.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒中還含有權利要求2或3所述的探針。6.一種快速區(qū)分豬偽狂犬病毒中國型、歐美型及疫苗株Bartha-K61的雙色熒光PCR方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)從樣品中提取病毒DNA; 2)以提取的DNA為模板，用權利要求1所述的引物對F、R，及權利要求2或3所述探針Pl和探針P2進行熒光PCR擴增反應獲得擴增產(chǎn)物； 3 )對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析，確定樣品中的病毒類型。7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于:步驟2)中的熒光PCR擴增反應體系為: Premix Ex-Taq5.Ομ? ΙμΜ 引物 Pl0.4μ1 10 μΜ引物Ρ20.4μ1 10 μΜ 探針 Probe I0.2μ1 10 μΜ探針Probe20.2μ1 模板1.Ομ? CldH2O2.8μ1。8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于:步驟2)中的熒光PCR擴增反應程序為:950C預變性5min; 95 °C變性20s，60 °C退火20s，72 °C延伸20s;循環(huán)55次。9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于:步驟3)中的熔解曲線分析程序為:95°C變性10 s; 40 0C到97 °C以0.13 °C/s的速率，5次/ V連續(xù)采集探針Pl和P2的熒光信號，進行熔解曲線分析。10.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述熔解曲線分析的具體分析過程為: I)在探針Pl的熒光檢測結果中，以Bartha-Kei標準樣品為對照時，若樣品熔解溫度和陽性對照Bartha-K61熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C時，則判定為歐美型豬偽狂犬病毒； 2)在探針Pl的熒光檢測結果中，以HDDJ標準樣品為對照時，若樣品熔解溫度和陽性對照HDDJ熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC時，則判定為中國型豬偽狂犬病毒； 3)在探針P2的熒光檢測結果中，以Bartha-K61標準樣品為對照時，若樣品熔解溫度和陽性對照Bartha-K61熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C時，則判定為Bartha_K61疫苗株。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048079SQ201610296853
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】張建峰, 劉志成, 孫俊穎, 張春紅, 沈海燕
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所