因子或其基因的抑制劑"或"本發(fā)明抑制劑"。例 如，所述的抑制劑包括纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子的抗體、抑制性mRNA、反義RNA、 microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及鋅指轉(zhuǎn)錄因子的活性抑制劑。
[0066] 同樣，在獲得了本發(fā)明鋅指轉(zhuǎn)錄因子的序列或其編碼核苷酸后，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)手段設(shè)計、合成、鑒定并驗證這些抑制劑及其效果。應(yīng)理解，這些抑制 劑可以是完全抑制本發(fā)明鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達和/或活性，也可以是部分抑制，從而獲得 (半）纖維素酶活性增強的本發(fā)明工程菌。
[0067] 應(yīng)用
[0068] 通過抑制本發(fā)明鋅指蛋白，可以人為地提高絲狀真菌中（半）纖維素酶的表達量 和/或活性，從而增加菌株對纖維素（尤其是木質(zhì)纖維素）的利用。
[0069] 例如，當獲得了本發(fā)明的工程菌后，可以通過加入纖維素原料的誘導，對所述的工 程菌進行培養(yǎng)。此時，所述的菌株會分泌纖維素酶和半纖維素酶，對其進行分離并提純后， 就可以獲得較純的纖維素酶和半纖維素酶。
[0070] 由于產(chǎn)生纖維素酶和半纖維素酶的過程中，纖維素原料受其降解，形成降解產(chǎn)物。 因此當進一步對培養(yǎng)物進行分離時，就可以獲得纖維素的多種降解產(chǎn)物，例如多種單體化 合物：葡萄糖、木糖等。
[0071] 本發(fā)明有益效果
[0072] 本發(fā)明通過改造絲狀真菌在纖維素降解的調(diào)控因子及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，增強了絲狀真菌 對纖維素的利用，提高了生物質(zhì)降解，從而成為能量利用中的新途徑。
[0073] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0074] 本發(fā)明所采用的原始出發(fā)菌株商購于美國真菌菌種保存庫（FGSC)，其余所用材料 均為商購。
[0075] 實施例1工程菌的獲得
[0076] 可采用常規(guī)技術(shù)對出發(fā)菌株中的轉(zhuǎn)錄因子進行敲除。
[0077] 以粗糙脈胞菌出發(fā)菌株（FGSC2489)(購自FGSC)為例，根據(jù)同源重組的原理，利 用hph基因（潮霉素B抗性基因）置換待NCU05064的整個開放閱讀框（open reading frame, 0RF)〇
[0078] 1)設(shè)計同源臂特異性引物
[0079] 上游同源臂特異性引物：
[0080] NCU05064-5f:GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGGACTTGACTTGAGTGACAGG(SEQ ID NO. :11)；
[0081] NCU05064-5r:ATCCACTTAACGTTACTGAAATCTCCAACGTTAGAAGCAGGAAGGAAGG(SEQ ID NO. : 12)
[0082] 下游同源臂特異性引物：
[0083] NCU05064-3f:CTCCTTCAATATCATCTTCTGTCTCCGACTACTGCGAGGAAGATCAAGG(SEQ ID NO. : 13)；
[0084] NCU05064-3r:GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCCCTACCTACCTATCCAGACG(SEQ ID NO. : 14)
[0085] 擴增目標基因上下游同源臂；然后利用引物從質(zhì)粒PCSN44中擴增hph抗性元件。 將上述擴增所得3個片段利用酵母組裝的方法連接至pRS426中。引物如下所示
[0086] hph-F ：GTCGGAGACAGAAGATGATATTGAAGGAGC(SEQ ID NO. :15)
[0087] hph-R ：GTTGGAGATTTCAGTAACGTTAAGTGGAT(SEQ ID NO. :16)
[0088] 2)將上述所獲得質(zhì)粒作為模板，用SEQ ID NO. : 11-12所示的引物擴增NCU05064 敲除元件，凝膠純化PCR產(chǎn)物。
[0089]3)將上述PCR產(chǎn)物10ii g電擊轉(zhuǎn)化至野生型菌株（FGSC2489，A)，通過含有潮霉素 的平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。
[0090] 4)提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以其為模板，利用引物擴增，其中hphDC是驗證基因敲 除的通用引物，如果可以擴增得到目的片段，則說明這些轉(zhuǎn)化子發(fā)生了預(yù)期的同源重組。引 物如下所示：
[0091] NCU05064DC ：GCGACTTGGACCTGACCACT(SEQ ID NO. : 17)
[0092] hphDC ：GCTCCGGGCGTATATGCT (SEQ ID NO. : 18)
[0093] 5)將所獲得的轉(zhuǎn)化子與野生型菌株雜交（FGSC4200, a)，將雜交得到的子囊孢子 熱激（60°C，45min)后，稀釋涂布在平板上，萌發(fā)后挑至斜面上，生長7天后，提取基因組，利 用PCR進行鑒定。
[0094] 其余工程菌株均根據(jù)類似方法獲得，所需的引物如表1所示：
[0095] 表 1
[0096]
【主權(quán)項】
1. 一種提高絲狀真菌纖維素酶和/或半纖維酶的表達、和/或提高絲狀真菌的纖維素 降解活性的方法，包括步驟： 抑制絲狀真菌的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子或其基因的表達和/或活性，從而提高 絲狀真菌纖維素和/或半纖維酶的表達、和/或提高絲狀真菌的纖維素降解活性。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的絲狀真菌包括：脈孢菌 (Neurospora)、或側(cè)抱霉（Sporotrichum)。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子包括： (a)SEQIDNO. :1、3、5、7、或9所示序列的一種或多種。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制包括敲除和/或下調(diào)所述的纖維素 降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達和/或活性。
5. -種纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子或其基因的抑制劑的用途，其特征在于，（a)用 于提高絲狀真菌纖維素和/或半纖維酶的表達；和/或（b)用于提高絲狀真菌的纖維素降 解活性。
6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑包括所述纖維素降解相關(guān)鋅 指轉(zhuǎn)錄因子的抗體、抑制性mRNA、反義RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及鋅指轉(zhuǎn)錄 因子的活性抑制劑。
7. -種用于降解纖維素的工程菌，其特征在于，所述工程菌中纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn) 錄因子被敲除或被下調(diào)。
8. -種生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的方法，其特征在于，在纖維素原料的存在下， 培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的工程菌，并從培養(yǎng)物中分離提純所述的纖維素酶和/或半纖維素酶。
9. 一種降解纖維素并獲得纖維素降解產(chǎn)物的方法，其特征在于，在木質(zhì)素原料的存在 下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的工程菌，從而降解木質(zhì)素并獲得木質(zhì)素降解產(chǎn)物。
10. 權(quán)利要求7所述工程菌的用途，其特征在于，用于制備纖維素酶和/或半纖維素酶、 和/或用于提高纖維素的降解。
【專利摘要】本發(fā)明一種提高真菌降解木質(zhì)纖維素或是生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。該方法是利用敲除或突變轉(zhuǎn)錄因子部分堿基或減弱轉(zhuǎn)錄因子的表達的微生物菌株降解木質(zhì)纖維素或是生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶，所述微生物為脈孢菌、曲霉、木霉、青霉、鐮刀霉或側(cè)孢霉，所述轉(zhuǎn)錄因子基因包括NCU05064、NCU03699、NCU02576、NCU06186和NCU08744，敲除其中的任意一個，或突變其中的部分堿基，或減弱任意一個表達。本發(fā)明通過敲除或是部分堿基突變或是減弱微生物轉(zhuǎn)錄因子基因表達得到一類出發(fā)菌，并應(yīng)用其降解木質(zhì)纖維素或是提高纖維素酶、半纖維素酶表達或其它蛋白的表達量。
【IPC分類】C12N1-14, C12N9-42, C12N15-87, C12R1-66, C12R1-645, C12R1-80, C12P19-14, C12R1-77, C12N1-15, C12R1-885
【公開號】CN104845954
【申請?zhí)枴緾N201510081685
【發(fā)明人】田朝光, 林良才, 李金根, 齊西珍, 孫文良, 李慧燕, 馬延和
【申請人】中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年2月15日