一種源于極端抗鹽堿曲霉的纖維素酶基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種纖維素酶及其編碼基因、含 有編碼基因的重組載體、基因工程菌株以及其生物學(xué)活性和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶是一種高活性生物催化劑，是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總 稱，包括三類酶，即外切B-1，4-葡聚糖苷酶（簡(jiǎn)稱CBH)、內(nèi)切B-1，4-葡聚糖苷酶（簡(jiǎn)稱EG) 和B-1，4-葡萄糖苷酶（簡(jiǎn)稱BG)，在這3種酶的協(xié)同作用下，纖維素最終被分解成葡萄糖。
[0003] 纖維素類物質(zhì)是自然界中最豐富的一種可再生資源。生物資源是可再生性資源， 地球上每年光合作用的產(chǎn)物高達(dá)1. 5X10n_2.OX10nt，是人類社會(huì)賴以生存的基本物質(zhì) 來(lái)源，其中90%以上為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，其中的纖維素是地球上最豐富的多糖物質(zhì)，這類 物質(zhì)是植物細(xì)胞壁的主要成分。據(jù)報(bào)道，我國(guó)的纖維素類資源極為豐富，僅秸桿和皮殼每年 可達(dá)7X10s噸。但是這些物質(zhì)的利用率卻很低，多采用燃燒的方法處理，這樣不僅造成了 環(huán)境污染，也是資源和能源的巨大浪費(fèi)。隨著世界人口迅速增長(zhǎng)、糧食、礦產(chǎn)資源日漸枯竭， 開(kāi)發(fā)高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類可再生資源的微生物技術(shù)，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物等發(fā)酵生產(chǎn)人類 急需的燃料、飼料及化工產(chǎn)品，即化工原料綠色化，具有極其重大的現(xiàn)實(shí)意義和光明的發(fā)展 前景。
[0004] 自從纖維素酶被人類認(rèn)識(shí)和利用以來(lái)，在食品、飼料、釀酒、紡織、中藥提取和造紙 等眾多的工業(yè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前，人們?cè)谘芯坷w維素酶過(guò)程中認(rèn)識(shí)到，提高 酶產(chǎn)量、活力和穩(wěn)定性，將在應(yīng)用中顯現(xiàn)巨大的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種酶活力高和穩(wěn)定性強(qiáng)的纖維素酶，及其編碼基因、重組 載體、基因工程菌株及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明從極端抗鹽堿曲霉CCHA獲得一種纖維素酶基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為 CCHA333〇
[0008] 該基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，該基因序列長(zhǎng)度為1509bp，編碼502個(gè) 氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。將此氨基酸序列在國(guó)際基因庫(kù)中進(jìn)行檢索，發(fā) 現(xiàn)屬于糖苷水解酶第5家族，該酶含有一個(gè)纖維素結(jié)合位點(diǎn)。
[0009] 構(gòu)建含有纖維素酶基因CCHA333序列的重組表達(dá)質(zhì)粒載體pPIC9K-CCHA333,利用 電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化PIChiapastoriSGsll5,在MD和MM培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽(yáng) 性轉(zhuǎn)化子，G418篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，然后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，獲得畢赤酵母重組基因工程菌 株GS115-pPIC9K-CCHA333。該工程菌株接種于含BMGY培養(yǎng)基中，在28°C、200rpm/min搖床 培養(yǎng)2d后，以5:1比例濃縮轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)基中，在25°C、200rpm/min搖床培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá) 2d后，纖維素酶產(chǎn)量達(dá)0. 2mg/ml。本發(fā)明的纖維素酶水解羧甲基纖維素鈉實(shí)驗(yàn)中，最適pH 值為6,最適酶反應(yīng)溫度為55°C。酶在pH范圍4-12,溫度80°C加熱2h，酶活性能保持50% 以上，具有較高的熱穩(wěn)定性。在眾多金屬離子存在環(huán)境下，酶活性明顯提高，在ImMCo2+和 Cu2+濃度環(huán)境下，酶活性提高分別為1. 95倍和1. 53倍，在500mMNa2+濃度環(huán)境下酶活性提 高2. 15倍。在分解玉米秸桿的試驗(yàn)中，每0. 05g玉米秸桿粉可產(chǎn)生0. 253mg葡萄糖。
[0010] 通過(guò)構(gòu)建重組載體并在畢赤酵母中超量表達(dá)的產(chǎn)物具有高效的水解羧甲基纖維 素鈉和玉米秸桿的功能，本發(fā)明的纖維素酶及其編碼基因在纖維素降解中可廣泛應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為纖維素酶SDS-PAGE凝膠電泳圖
[0012] 圖2為纖維素酶水解羧甲基纖維素鈉的最適酶反應(yīng)溫度示意圖
[0013] 圖3為纖維素酶水解羧甲基纖維素鈉的最適pH值的測(cè)定結(jié)果示意圖
[0014] 圖4為纖維素酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果示意圖
[0015] 圖5為纖維素酶pH穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果示意圖
[0016] 圖6為纖維素酶在不同金屬離子環(huán)境下酶活性的測(cè)定結(jié)果示意圖
[0017] 圖7為纖維素酶在NaCl環(huán)境下酶活性的測(cè)定結(jié)果示意圖
[0018] 圖8為纖維素酶在Co2+環(huán)境下酶活性的測(cè)定結(jié)果示意圖
[0019] 圖9為纖維素酶水解玉米秸桿前后葡萄糖產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1:極端耐鹽曲霉CCHA的cDNA合成
[0021] (1)極端耐鹽曲霉CCHA總RNA的提?。簠⒄誘riZol試劑盒說(shuō)明。
[0022] (2)cDNA鏈的合成：按照Takara公司的TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver3. 0 試劑盒說(shuō) 明書(shū)進(jìn)行：取l_2yg總RNA，加RnaseFreeddH20至9. 5yL，將RNA樣品在75°C變性5min， 立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分：10mmol/L dNTPMixture2yL, 10XRTBuffer(Mg2+) 2μL, 25mmol/LMgcl24μL, 01igod(T)-Adaptor PrimerlμL，RnaseInhibiter0. 5μL,AMVReverseTranseriptase1μL(FinalVolume 20μL)，將反應(yīng)液混合后，室溫下放10min，然后42°C溫育60min，再煮沸5min以滅活反轉(zhuǎn)錄 酶。加入180yLDEPC處理的ddH20,稀釋至200yL，混勾，稍微離心，-20°C保存，備用。
[0023] 實(shí)施例2:纖維素酶基因CCHA333的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建
[0024] (1)引物設(shè)計(jì)：根據(jù)纖維素酶基因同源序列的保守區(qū)，結(jié)合所用載體設(shè)計(jì)引物，在 引物的5'端分別引入EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)（下劃線部分）：
[0025]上游引物：5' -CCGGAATTCATGAGATTCACCAGTTTG(SEQIDNO. 3)
[0026]下游引物：5'-TTGCGGCCGCAATCACTGGCACTGT(SEQIDNO. 4)
[0027] (3)PCR擴(kuò)增：以極端耐鹽曲霉CCHAcDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系 (25μL)如下：
[0028] 10XExTagBuffer2. 5μL，2. 5mmol/L的dNTPsmixture1μL，10μmol/L的上 下游引物各1μL，ExTagDNA擴(kuò)增酶0. 5μL，模板10-100ng，無(wú)菌去離子水18μL。PCR擴(kuò) 增條件：94°C預(yù)變性 3min;94°C30s，50°C30s，72°C90s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸 10min。 利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。
[0029] (4)表達(dá)載體的構(gòu)建：純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD_18TVector，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒并測(cè)序。利用EcoRI和NotI將目的基因和 PPIC9K載體分別雙酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽(yáng) 性重組質(zhì)粒并提取重組質(zhì)粒。經(jīng)酶切驗(yàn)證的重組質(zhì)粒（PPIC9K-CCHA333)測(cè)序確認(rèn)表達(dá)載 體構(gòu)建正確。
[0030] 實(shí)施例3:表達(dá)纖維素酶基因CCHA333的酵母工程菌株的構(gòu)建、篩選與誘導(dǎo)表達(dá)
[0031] (1)重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化：將重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K-CCHA333用限制性內(nèi)切酶 SalI線性化。
[0032] (2)轉(zhuǎn)化：電擊轉(zhuǎn)化酵母菌株P(guān)ichiapastoriSGS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法參 見(jiàn)工nvitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。
[0033] (3)篩選：用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化子對(duì)應(yīng)點(diǎn)種在MM和MD平板上，30°C培養(yǎng)2-4d，挑 取在MD/MM平板上均生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種于lmg/ mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mLG418的YPD平板上篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。
[0034] (4)誘導(dǎo)表達(dá)：工程菌株接種于含BMGY培養(yǎng)基中，在28°C、200rpm/min搖床培養(yǎng) 2d后，以5:1比例濃縮轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)基中，在25°C、200rpm/min搖床培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)2d， 每12h補(bǔ)充甲醇終濃度為1%，每12h取樣，12000rmp/min離心5min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分析。
[0035] 實(shí)施例4:纖維素酶活性測(cè)定
[0036] (1)沒(méi)活力單位的定義：lmL液體酶在最適酶反應(yīng)條件下，每分鐘水解羧甲基纖維 素鈉產(chǎn)生1μg葡萄糖，為一個(gè)酶活力單位（U/mL)。
[0037] (2)酶活性測(cè)定方法：酶活性測(cè)定采用DNS法，蛋白含量測(cè)定采用Bradford法。
[0038] (3)纖維素酶的最適反應(yīng)溫度、最適pH及熱穩(wěn)定性和pH的測(cè)定：誘導(dǎo)表達(dá)的纖維 素酶經(jīng)過(guò)DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析，獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的纖維素 酶測(cè)定其性質(zhì)。分別在20-90°C，梯度為10°C的溫度和pH3-11，梯度為1的pH條件下測(cè)定 纖維素酶的酶活力。將纖維素酶在不同的溫度（60°C和80°C)下保溫不同的時(shí)間（lh，2h， 3h，4h)后和在不同pH(3-12)緩沖液下4°C放置12h后，分別測(cè)定剩余酶活力。
[0039] (4)纖維素酶在不同金屬離子中酶活力的測(cè)定：分別在終濃度為lmmol的Co2+、 Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg'Mn2+、Ba2+、Ni2+、EDTA中測(cè)定纖維素酶的酶活力。分別在不同Co2+離子 濃度和不用Na+離子濃下測(cè)定纖維素酶的酶活力。
[0040] 實(shí)施例5:纖維素酶水解玉米秸桿的應(yīng)用
[0041] (1)玉米秸桿樣本的制備：將粉碎過(guò)的玉米秸桿用蒸餾水沖洗干凈，加入1. 0%的 稀硫酸，于120 °C下保溫2h。取出后過(guò)濾至濾出液呈中性，將玉米秸桿殘?jiān)?5 °C下烘24h， 待試樣品。
[0042] 纖維素酶水解玉米秸桿：取0. 05g待試樣品放入400μL的pH為5的緩沖液中，加 入100μL的纖維素酶液，在纖維素酶的最適溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)30min。對(duì)照取0. 05g待 試樣品放入400μL的pH為5的緩沖液中，加入100μL的蒸餾水，在纖維素酶的最適溫度 條件下進(jìn)行反應(yīng)30min。反應(yīng)完畢，將水解物過(guò)濾，測(cè)定濾出液中還原糖的含量。
[0043]


【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種纖維素酶基因CCHA333,其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 按權(quán)利要求1所述的纖維素酶基因CCHA333,其特征在于所述纖維素酶基因CCHA333 的編碼序列如SEQIDNO. 2所示。3. -種重組載體，以及重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，其特征在于含有權(quán)利要 求2所述的纖維素酶基因CCHA333的編碼序列。4. 一種權(quán)利要求1所述的纖維素酶基因CCHA333的應(yīng)用，其特征在于作為水解羧甲基 纖維素鈉的酶動(dòng)力學(xué)特性鑒定。5. 權(quán)利要求1所述的纖維素酶基因CCHA333在纖維素降解中的應(yīng)用。
【專利摘要】一種源于極端抗鹽堿曲霉的纖維素酶基因及應(yīng)用屬生物工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開(kāi)的纖維素酶基因CCHA333的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；纖維素酶基因CCHA333的編碼序列如SEQ？ID？NO.2所示；纖維素酶基因CCHA333可在水解羧甲基纖維素鈉的酶動(dòng)力學(xué)特性鑒定中應(yīng)用；纖維素酶最適pH值為6，最適酶反應(yīng)溫度為55℃，在pH范圍4-12，溫度80℃加熱2h，酶活性能保持50％以上。在眾多金屬離子存在環(huán)境下，酶活性明顯提高，如Cu2+，Co2+和Na2+。通過(guò)構(gòu)建重組載體并在畢赤酵母中超量表達(dá)的產(chǎn)物具有高效的水解羧甲基纖維素鈉和玉米秸稈的功能，本發(fā)明的纖維素酶及其編碼基因可廣泛應(yīng)用于纖維素降解。CGMCC602520120420
【IPC分類】C12P19/14, C12N1/19, C12N9/42, C12R1/84, C12N15/81, C12N15/56
【公開(kāi)號(hào)】CN105420259
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610005024
【發(fā)明人】張世宏, 李正群, 魏毅, 陳麗娜, 劉少帥, 周曉陽(yáng), 宋妍悅, 裴雪
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2016年1月6日