專利名稱：一種檢測酶促降解煙草中纖維素和果膠程度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶促降解水不溶高分子技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種酶促煙草水不溶物質(zhì)降解率的測定方法。
背景技術(shù)：
隨著我國加入WTO和簽署《煙草控制框架公約》，煙草行業(yè)面臨諸多方面的壓力，降低煙葉有害成分、提高煙葉質(zhì)量成為煙草行業(yè)關(guān)注的熱點問題。目前卷煙減害多側(cè)重于工業(yè)減害技術(shù)(如改善過濾和透氣條件)研究。降低煙葉有害成分(主要是有害成分前體物)，減少煙草燃燒后產(chǎn)生的有害物質(zhì)是卷煙減害的另外一條有效途徑，目前正日益受到研究者關(guān)注。纖維素和果膠等都是生物大分子，在燃燒過程中常產(chǎn)生有害成分，它們的降解不 僅有利于降焦減害，同時可提高煙葉品質(zhì)。在研究其降解的過程中不可避免地涉及到降解率的測定。目前利用酶或者微生物對水不溶高分子的降解性能測定評價方法很多，包括檢測降解過程中產(chǎn)生的CO2為度量指標(biāo)，如STURM法；以B0D/C0D為度量指標(biāo)，測定生物降解過程中O2的消耗量，如MITI法；還有測定降解產(chǎn)物中某個指標(biāo)的變換來度量水不溶高分子降解程度。對于水不溶高分子的降解程度的測定而言，上述方法操作復(fù)雜，耗時太長。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)在技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明提供一種檢測酶促降解煙草中纖維素和果膠程度的方法。該方法是一種科學(xué)合理、簡單實用、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的測定酶液對煙草水不溶物質(zhì)降解率的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種檢測酶促降解煙草中纖維素和果膠程度的方法，具體實施步驟如下I)煙草清洗用去離子水充分洗滌煙草，達到除去煙草表面雜質(zhì)及可溶物的目的；2)煙草干燥用干燥設(shè)備在60°C _100°C下將洗滌干凈的煙草干燥至恒重；3)煙草稱重準(zhǔn)確稱量干燥后煙草的質(zhì)量m。；4)噴酶液在干燥并稱重過的煙草上噴灑能達到降解要求的酶液；5)煙草控溫控濕反應(yīng)將噴過酶液的煙草在25°C _65°C溫度范圍內(nèi)保持恒溫，并控制濕度在30%- 80%，根據(jù)降解要求反應(yīng)一定時間；6)煙草漂洗將控溫控濕反應(yīng)后的煙草用去離子水充分漂洗，達到去除酶制劑與反應(yīng)產(chǎn)物的目的；7)干燥將漂洗過的煙草用干燥設(shè)備在60°C _100°C下將洗滌干凈的煙草干燥至
恒重；8)稱重準(zhǔn)確稱量干燥后煙草的質(zhì)量Hi1 ；9)計算降解率利用公式降解度(100%)=[(降解前質(zhì)量Hi0-降解后質(zhì)量Hi1)/降解前質(zhì)量mj X 100%計算出煙草的降解率。上述技術(shù)方案的有益之處在于本發(fā)明采用測定降解高分子樣品的質(zhì)量減少值，通過公式“降解度(100%)=[(降解前質(zhì)量-降解后質(zhì)量)/降解前質(zhì)量]X100%”來計算水不溶高分子的降解率，是一種科學(xué)合理、簡單實用、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的測定酶液對煙草水不溶物質(zhì)降解率的方法。本發(fā)明還可廣泛用于其他水不溶高聚物的酶促降解與微生物降解率測定。


圖I是果膠酶試驗中對照樣片煙掃描電鏡照片，放大倍數(shù)為1000倍。圖2是果膠酶試驗中果膠酶處理后片煙掃描電鏡照片，放大倍數(shù)為1000倍。圖3是纖維素酶試驗中對照樣片煙掃描電鏡照片，放大倍數(shù)為1000倍。 圖4是纖維素酶試驗中纖維素酶處理后片煙掃描電鏡照片，放大倍數(shù)為1000倍。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各酶液最適條件進行。實施例I材料I)片煙樣品為2006年津巴布韋片煙煙葉B10T，裝入封口聚乙烯袋中，常溫保存。2)果膠酶液所用菌株為Aspergillus niger A2,100L發(fā)酵罐進行發(fā)酵,所得發(fā)酵液于4 0CuOOOO r/min離心，上清液即為待用果膠酶液。方法稱取6份片煙樣品，每份2. 5kg，分為兩組，每組3份。一組是酶液處理樣，另一組是實驗對照樣。步驟如下I)煙草清洗用去離子水充分洗滌片煙樣品，達到除去煙草表面雜質(zhì)及可溶物的目的。清洗設(shè)備既要能清洗掉煙草表面的雜質(zhì)，又要對煙草的組織結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生二次損傷。2)煙草干燥在80°C烘箱中將洗滌干凈的片煙樣品烘至恒重。3)煙草稱重準(zhǔn)確稱量干燥后片煙樣品的質(zhì)量πν稱重設(shè)備需要能精確到毫克。4)噴酶液以50 ml/min的噴灑量相對均勻的將IOOg果膠酶液噴灑到干燥并稱重過的每份片煙表面，實驗對照樣噴同樣質(zhì)量(IOOg)的去離子水。5)煙草控溫控濕反應(yīng)將噴過酶液和去離子水的片煙樣品控制在溫度條件為50 0C、濕度條件為60%的恒溫恒濕條件，反應(yīng)24 h。6)煙草漂洗將控溫控濕反應(yīng)后的片煙樣品用35°C的去離子水充分漂洗20分鐘，去除酶液及降解物。7)干燥將漂洗過的片煙樣品在80°C烘箱中烘至恒重。8)稱重準(zhǔn)確稱量干燥后片煙樣品的質(zhì)量叫。稱重設(shè)備需要能精確到毫克。9)計算相對降解率利用公式降解度(100%)=[(降解前質(zhì)量Hicr降解后質(zhì)量Hi1)/降解前質(zhì)量mj X 100%計算出煙草的降解率。
驗證方法I)比色法測定片煙中果膠含量取片煙樣品進行切絲，于鼓風(fēng)干燥箱中60°C烘干過夜，用粉碎機粉碎至60目待用，同時測定片煙含水率。準(zhǔn)確稱取上述煙末樣品O. 5 g，標(biāo)記為A(對照樣)、B(酶液處理樣)，分別放入具塞試管。將50 mL熱水分別加入每支試管中，充分振蕩，然后置于沸水中，沸水浴2 h，以去除片煙中可溶性糖(期間不時震蕩試管，混勻樣品，以增強去除效果)。然后對煙樣進行抽濾，潤洗試管，將洗液一同并入抽濾漏斗，同時充分淋洗漏斗中的煙樣，棄去濾液，將抽濾后的煙樣轉(zhuǎn)入對應(yīng)標(biāo)號的三角瓶中，加入50 mL含O. 2 g果膠酶(2.3 U/mg) pH 4. O檸檬酸鈉-檸檬酸的緩沖液中，搖勻，50 °C下振蕩水浴2 h，然后抽濾，取濾液，調(diào)pH> 12，將濾液定容至100 mL，取其中I mL溶液稀釋至10 mL即得待測樣品。取待測樣品2 mL分別加入編號為A、B的具塞比色管，另取一支編號為O具塞比·色管加等量的去離子水，再分別加入2 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴10 min，冷卻，定容至15mL,于550 nm下測0D，根據(jù)D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中D-半乳糖醛酸的量。片煙樣品中果膠含量可由下式計算X= (( ~( X 100%
m x( l-W)式中X——樣品中果膠含量，以D-半乳糖醛酸含量計，單位為質(zhì)量百分數(shù)(100%)；C——測試樣品溶液中D-半乳糖醛酸含量測定值，單位為毫克每升(mg/L)；C0——空白樣品溶液中D-半乳糖醛酸含量測定值，單位為毫克每升(mg/L)；V-----樣品定容體積，單位為升(L)；η-----溶液稀釋倍數(shù)；m-----樣品質(zhì)量，單位為毫克(mg)；W——樣品含水率(參照煙草行業(yè)YC/T31-1996煙草樣品水分的測定標(biāo)準(zhǔn)方法測定)。2)片煙表面結(jié)構(gòu)表征方法利用掃描電鏡觀察煙葉表面的結(jié)構(gòu)變化，了解果膠酶處理煙葉后對煙葉微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響。結(jié)果I)利用本發(fā)明獲得的實驗結(jié)果對照組實驗組
編號1 23 4 56
處理前質(zhì)量2147.31 2175.652193. 53 2154.36 2136.27 2146.72 m0/g處理后質(zhì)量2()92.39 2126.712130.42 1579.30 1550.29 1599.52
mi/g
降解率/%2.56 2. 252.88 26.69 27.43 25.49
平均降解率/%2. 5626.54
酶促降解率％23. 98 2)片煙中果膠含量的檢測結(jié)果經(jīng)果膠酶液處理，果膠含量明顯降低，比色法檢測結(jié)果為果膠含量下降了 25. 50%,用本發(fā)明中的快速方法測得果膠含量下降了 23. 98%。3)片煙表面結(jié)構(gòu)變化將果膠酶液處理的片煙樣品及其對照樣品進行掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖I和圖2，與對照組相比較，果膠酶液處理的片煙煙葉，其細胞皺縮加大，細胞與間隙連接處出現(xiàn)明顯裂痕。據(jù)文獻報道，煙葉中果膠主要存在于細胞間隙中，由此表明，果膠酶液對片煙果膠起到了有效的降解作用。實施例2材料I)片煙樣品為2006年津巴布韋片煙煙葉B10T，裝入封口聚乙烯袋中，常溫保存。2)纖維素酶液所用菌株為Bacillus subtilis C_11，100L發(fā)酵罐進行發(fā)酵，所得發(fā)酵液于4 0CuOOOO r/min離心，上清液即為待用纖維素酶液。方法稱取6份片煙樣品，每份2. 4kg，分為兩組，每組3份。一組是酶液處理樣，另一組是實驗對照樣。步驟如下I)煙草清洗用去離子水充分洗滌片煙樣品，達到除去煙草表面雜質(zhì)及可溶物的目的。清洗設(shè)備既要能清洗掉煙草表面的雜質(zhì)，又要對煙草的組織結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生二次損傷。2)煙草干燥在60°C烘箱中將洗滌干凈的片煙樣品烘至恒重。3)煙草稱重準(zhǔn)確稱量干燥后片煙樣品的質(zhì)量πν稱重設(shè)備需要能精確到毫克。4)噴酶液以50 ml/min的噴灑量相對均勻的將IOOg纖維素酶液噴灑到干燥并稱重過的每份片煙表面，實驗對照樣噴同樣質(zhì)量(IOOg)的去離子水。5)煙草控溫控濕反應(yīng)將噴過酶液和去離子水的片煙樣品控制在溫度條件為30V，濕度條件為40%的恒溫恒濕條件，反應(yīng)24 h。
6)煙草漂洗將控溫控濕反應(yīng)后的片煙樣品用35°C的去離子水充分漂洗20分鐘，去除酶液及降解物。7)干燥將漂洗過的片煙樣品在80°C烘箱中烘至恒重。8)稱重準(zhǔn)確稱量干燥后片煙樣品的質(zhì)量叫。稱重設(shè)備需要能精確到毫克。9)計算相對降解率利用公式降解度(100%)=[(降解前質(zhì)量mQ-降解后質(zhì)量Hi1)/降解前質(zhì)量mj X 100%計算出煙草的降解率。驗證方法I)片煙中纖維素含量的檢測方法本試驗采用范氏中性洗滌劑，綜合運用2 mol/L鹽酸水解法、72%濃硫酸水解法測定纖維素含量。稱取I. 0000 g處理后片煙，放入到100 mL三角瓶中，加入70 mL的范氏中 性洗滌劑。在115°C 121°C條件下保溫20 min，取出之后采用三號30 mL砂芯坩鍋(孔徑為30微米)過濾。然后使用無水乙醇和丙酮溶液洗滌。棄掉濾液，用真空干燥器干燥濾渣20 min。將濾渣和坩堝一起放入到100 mL燒杯中，加入70 mL 2mol/L的鹽酸溶液，放入高壓滅菌鍋，100°c條件下保溫50 min,取出之后采用三號30 mL砂芯坩鍋過濾。使用無水乙醇和丙酮溶液洗滌。同樣去掉濾液，將濾渣連同坩堝烘干至恒重，記為I。將烘干至恒重的殘渣和坩堝一起放入150 mL燒杯內(nèi)，加入10 mL 72%硫酸溶液，常溫下降解4 h后加入90mL蒸餾水。放置過夜，并用蒸餾水洗滌。烘干至恒重，記為W2。W1- W2為纖維素的含量。2)片煙表面結(jié)構(gòu)表征方法利用掃描電鏡觀察煙葉表面的結(jié)構(gòu)變化，了解纖維素酶處理煙葉后對煙葉微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響。結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測酶促降解煙草中纖維素和果膠程度的方法，特征在于具體實施步驟如下 1)煙草清洗用去離子水充分洗滌煙草，達到除去煙草表面雜質(zhì)及可溶物的目的； 2)煙草干燥用干燥設(shè)備在60°C_100°C下將洗滌干凈的煙草干燥至恒重； 3)煙草稱重準(zhǔn)確稱量干燥后煙草的質(zhì)量Hltl； 4)噴酶液在干燥并稱重過的煙草上噴灑能達到降解要求的酶液； 5)煙草控溫控濕反應(yīng)將噴過酶液的煙草在25°C_65°C溫度范圍內(nèi)保持恒溫，并控制濕度在30%- 80%，根據(jù)降解要求反應(yīng)一定時間； 6)煙草漂洗將控溫控濕反應(yīng)后的煙草用去離子水充分漂洗，達到去除酶制劑與反應(yīng)產(chǎn)物的目的；7)干燥將漂洗過的煙草用干燥設(shè)備在60°C_100°C下將洗滌干凈的煙草干燥至恒重； 8)稱重準(zhǔn)確稱量干燥后煙草的質(zhì)量Hl1； 9)計算降解率利用公式降解度(100%)=[(降解前質(zhì)量Hi0-降解后質(zhì)量Hl1)/降解前質(zhì)量mj X 100%計算出煙草的降解率。
2.如權(quán)利要求I所述的一種檢測酶促降解煙草中纖維素和果膠程度的方法，特征在于步驟4所述噴酶液涉及的噴酶裝置的噴灑量控制在lOOml/min以下。
3.如權(quán)利要求I或2所述的一種檢測酶促降解煙草中纖維素和果膠程度的方法，特征在于步驟3和步驟8中的稱重設(shè)備需要能精確到毫克。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測酶促降解煙草中纖維素和果膠程度的方法，應(yīng)用于煙草中纖維素、果膠等水不溶高分子的酶促降解率的測定。通過快速水洗方法來測定降解煙草樣品的質(zhì)量減少值，然后通過公式 “降解度(100%)=[(降解前質(zhì)量-降解后質(zhì)量)/降解前質(zhì)量]×100%”來計算煙草中纖維素和果膠相對降解率。
文檔編號G01N5/04GK102890038SQ20121037789
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者范堅強, 王金華, 宋紀真, 包可翔, 鄭湖南, 陳少濱, 龍騰, 陳義強, 崔振偉, 張永安, 黃劍濱, 賴榮華 申請人:福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司