一種提高木質(zhì)纖維素降解及纖維素酶、半纖維素酶生產(chǎn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，一種提高真菌降解木質(zhì)纖維素或是生產(chǎn)纖維素酶、半 纖維素酶的方法，涉及5個基因（五個轉(zhuǎn)錄因子基因分別為NCU05064、NCU03699、NCU02576、 NCU06186、NCU08744)。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是自然界中存在最廣泛、最豐富的碳水化合物。隨著地球資源的快速消耗、 環(huán)境污染和能源危機(jī)的日益加劇，纖維素作為潛力巨大、環(huán)境友好的可再生能源成為研究 的重點(diǎn)。作為地球上數(shù)量最大的可再生資源，纖維素的利用效率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于社會發(fā)展的要 求，若能將其高效地轉(zhuǎn)化為可利用的能源、食料和化學(xué)原料等，勢必將會對人類社會的健康 發(fā)展起到關(guān)鍵作用。要利用這些儲量巨大的生物質(zhì)資源，需要糖化和發(fā)酵兩個基本步驟。其 中，如何將生物質(zhì)高效地水解為單體化合物（葡萄糖、木糖等）已成為其利用過程中的一個 迫切需要解決的問題。
[0003] 多種微生物都具有降解、利用纖維素的能力，特別是子囊菌和擔(dān)子菌等絲狀真菌 可以分泌多種木質(zhì)纖維素水解酶，與其它微生物相比，其具有完整的纖維素酶系，這種特性 使其成為研究纖維素利用和纖維素酶生產(chǎn)過程中的熱點(diǎn)。在提高生物質(zhì)降解效率的研究 中，傳統(tǒng)誘變技術(shù)已經(jīng)取得了重大進(jìn)步，提升空間有限。
[0004] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)能夠提高纖維素酶生產(chǎn)從而提供菌株對纖維素利用的 技術(shù)和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種提高木質(zhì)纖維素降解及纖維素酶、半纖維素酶表達(dá)的方 法及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明第一方面，提供了一種提高絲狀真菌纖維素酶和/或半纖維酶的表達(dá)、和/ 或提高絲狀真菌的纖維素降解活性的方法，包括步驟：
[0007] 抑制絲狀真菌的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子或其基因的表達(dá)和/或活性，從而 提高絲狀真菌纖維素和/或半纖維酶的表達(dá)、和/或提高絲狀真菌的纖維素降解活性。
[0008]在另一優(yōu)選例中，所述的絲狀真菌包括：脈孢菌（Neurospora)、或側(cè)孢霉 (Sporotrichum)〇
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述的絲狀真菌還包括曲霉（Aspergillus)、木霉 (Trichoderma)、青霉（Penicillium)、鎌刀霉（Fusarium)、或毀絲酶（Myceliophthora)。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子包括：
[0011] (a)SEQ ID N0. :1、3、5、7、或9所示序列的一種或多種。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子還包括：
[0013] (b)與SEQ ID N0. :1、3、5、7、或9所示序列同源性為50%以上，較佳地為60%以 上，更佳地為65%以上的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述抑制包括敲除和/或下調(diào)所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄 因子的表達(dá)和/或活性。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子至少包括SEQ ID N0. :1所 示的序列。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的絲狀真菌為脈胞菌，較佳地，為粗糙脈胞菌。
[0017] 本發(fā)明第二方面，提供了一種纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子或其基因的抑制劑的 用途，（a)用于提高絲狀真菌纖維素和/或半纖維酶的表達(dá)；和/或（b)用于提高絲狀真菌 的纖維素降解活性。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子包括選自（a)SEQ ID NO. :1、3、5、7、或9所示序列的一種或多種；或（b)與SEQ ID NO. :1、3、5、7、或9所示序列 同源性為50%以上，較佳地為60%以上，更佳地為65%以上的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因 子。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子的NCBI參考序列號 包括：XP_ 6626〇7. 1、XP_659104. 1、CBFS4793. 1(曲霉）；EPS3〇〇56. 1、EPS：31562. 1、 EPS26047. 1 (青霉）；XP_006965567. 1、XP_006967595.、ETS00557. 1 (木霉）；EWZ01503. 1、 ENH63019. 1、EXA00009. 1 (鐮刀霉）；XP_003665650. 1、XP_003662015. 1、XP_003658871. 1、 XP_003662960. 1 (毀絲酶）。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括所述纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子的抗體、 抑制性mRNA、反義RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及鋅指轉(zhuǎn)錄因子的活性抑制劑。
[0021] 本發(fā)明第三方面，提供了一種用于降解纖維素的工程菌，所述工程菌中纖維素降 解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子被敲除或被下調(diào)。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的工程菌不表達(dá)或基本不表達(dá)纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因 子。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的"基本不表達(dá)"指的是與野生型菌株相比，所述工程菌纖 維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量至少降低了 50%，較佳地，至少降低了 60%、70%、 80%、或 90%。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，與野生型菌株相比，所述工程菌纖維素酶和/或半纖維素酶的 表達(dá)量和/或活性至少提高了 20%，較佳地，至少提高了 50-80%，更佳地，至少提高了 100-500%。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子包括選自SEQ ID N0. :1、 3、5、7、或9所示序列的一種或多種。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述工程菌包括改造自以下野生菌的菌株：脈孢菌 (Neurospora)、或側(cè)抱霉（Sporotrichum)、曲霉（Aspergillus)、木霉（Trichoderma)、青霉 (Penicillium)、鎌刀霉（Fusarium)、或毀絲酶（Myceliophthora)。
[0027] 本發(fā)明第四方面，提供了一種生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的方法，在纖維素 原料的存在下，培養(yǎng)本發(fā)明第三方面所述的工程菌，并從培養(yǎng)物中分離提純所述的纖維素 酶和/或半纖維素酶。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的誘導(dǎo)物即纖維素原料包括木質(zhì)纖維素、結(jié)晶纖維素、木聚 糖、木質(zhì)纖維素水解物、木寡糖、纖維寡糖、木糖、或阿拉伯糖。
[0029] 本發(fā)明第五方面，提供了一種降解纖維素并獲得纖維素降解產(chǎn)物的方法，在木質(zhì) 素原料的存在下，培養(yǎng)本發(fā)明第三方面所述的工程菌，從而降解木質(zhì)素并獲得木質(zhì)素降解 產(chǎn)物。
[0030] 本發(fā)明第六方面，提供了本發(fā)明第三方面所述工程菌的用途，用于制備纖維素酶 和/或半纖維素酶、和/或用于提高纖維素的降解。
[0031] 該方法是利用敲除或突變鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因的微生物菌株降解木質(zhì)纖維 素或是生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶的方法，所述微生物為脈孢菌（Neurospora)、曲霉 (Aspergillus)、木霉（Trichoderma)、青霉（Penici Ilium)、鎌刀霉（Fusarium)或側(cè)抱霉 (Sporotrichum)〇
[0032] 所述鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因包括 NCU05064、NCU03699、NCU02576、NCU06186 和 NCU08744,敲除其中的任意轉(zhuǎn)錄因子，或突變?nèi)我庖粋€轉(zhuǎn)錄因子的部分堿基，或是減弱任意 一個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。
[0033] 所述鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU05064的核苷酸序列如序列表中序列2所示，編碼 序列表中序列1所不蛋白；所述鋒指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU03699的核昔酸序列如序列表中 序列4所不，編碼序列表中序列3所不蛋白；所述鋒指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU02576的核昔 酸序列如序列表中序列6所示，編碼序列表中序列5所示蛋白。所述鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子基 因NCU06186的核苷酸序列如序列表中序列8所示，編碼序列表中序列7所示蛋白。所述鋅 指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU08744的核昔酸序列如序列表中序列10所不，編碼序列表中序列 9所示蛋白。
[0034] 具體的，該方法利用以下任一菌株：以脈孢菌（Neurospora)為出發(fā)菌株構(gòu)建的 部分堿基突變或敲除或減弱轉(zhuǎn)錄因子NCU05064基因的菌株；以脈孢菌（Neurospora)為 出發(fā)菌株構(gòu)建的部分堿基突變或敲除或減弱轉(zhuǎn)錄因子NCU03699基因的菌株；以脈孢菌 (Neurospora)為出發(fā)菌株構(gòu)建的部分堿基突變或敲除或減弱轉(zhuǎn)錄因子NCU02576基因的 菌株；以脈孢菌