人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0044] 在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個"、"一"和"這個"包括復數(shù)形式。
[0045] 當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據(jù)本技術領域的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0046] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術 領域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技 術及相關領域的常規(guī)技術。這些技術在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION， Third edition， Academic Press， San Diego,1998 ;METH0DS IN ENZYM0L0GY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.) ,Academic Press，San Diego， 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker， ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0047] 實施例1狗牙根'Tifway' Dehydrin基因啟動子的克隆
[0048] 1.植物材料的獲得
[0049] 取狗牙根'Tifway'葉片組織，用于提取DNA ;
[0050] 2. DNA 的抽提
[0051] 取狗牙根葉片組織200mg，液氮充分研磨后將粉末轉移至I. 5ml離心管中；待離心 管中液氮揮發(fā)完，加入60(^10嫩提取8肛€641^812.18/140了4 29.28/1、503 12.58/ 1水溶液，PH值8. 0)，充分混勻（可適當加熱），室溫下抽提10-15min ;加入0. 5倍體積苯 酷，抽提5-10min ;再加入0· 5倍體積氯仿，繼續(xù)抽提l〇-15min ; 12000rpm，室溫離心20min ; 取上清，加入等體積異丙醇，輕柔晃動離心管，使異丙醇與上清充分混勻，可見白色絮狀沉 淀DNA ;將DNA沉淀挑入一新的I. 5ml離心管中，加入70v/v%乙醇水溶液洗滌沉淀；沉淀 干燥后加入0. 5ml ddH20(含終濃度50ug/ml的RNaseA)溶解，37°C消化RNAO. 5-lhr ;等體 積苯酷/氯仿（v:v = 1:1)、氯仿各抽提一次；上清加入1/10體積的3M NaAc(pH5. 2)和 2-2. 5倍體積預冷的無水乙醇，混勻后，于-20°C放置30min，12500rpm，4°C離心15min，棄上 清；70v/v%乙醇水溶液洗滌DNA沉淀，干燥后溶于適量水中；取少量DNA，瓊脂糖凝膠上檢 測其質量，其余DNA樣品-20 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0052] 3.基因啟動子的克隆
[0053] 根據(jù)狗牙根'Tifway'Dehydrin基因 cDNA全長序列設計引物，采用基因步移方法 (基因步移試劑盒Genomic Walker2. 0購自Clontech)進行Dehydrin基因5' -上游啟動 子克?。▓D1)，分三個階段進行：
[0054] (I) PCR獲得基因中間內含子片段
[0055] 利用SDS法提取狗牙根基因組后，利用PCR在'Tifway'中擴增出四段序列引物為 D1-Forward/DI-Reverse/D2-Forward/D2-Reverse/D3-Forward/D3-Reverse/D4-Forward/ D4-Reverse，PCR條件見表1，與pMD18-T克隆載體連接（pMD18-T購自Takara，連接方法 按Takara說明書）、轉化大腸桿菌DH5 α、長出的菌斑通過菌液PCR鑒定（引物和PCR條 件同上），陽性克隆測序得到四段長度分別為200bp、355bp、251bp、298bp，與Dehydrin基 因 cDNA全長序列對比第二段序列增加了 115bp，確定為包含了內含子（intron)。同時， 以 Dl-Forward 和 D4_Reverse 為引物，擴增 Dehydrin 基因的基因組上 ORF (Open reading form，開放閱讀框）全長，并測序；
[0056] Dl-Forward :5，-GGGGATCACCAAAGTTGCAG-3，（SEQ ID NO:5);
[0057] Dl-Reverse:5， -CATGCCCATTCCTCCTGTTC-， （SEQ ID NO:6);
[0058] D2-Forward :5，-GAACAGGAGGAATGGGCATG-3，（SEQ ID N0:7);
[0059] D2-Reverse :5' -GGAGCTTTTCCTTGATCTTATCCT-3， （SEQ ID N0:8);
[0060] D3-Forward :5' -AGGATAAGATCAAGGAAAAGCTCC-3，（SEQ ID N0:9);
[0061] D3-Reverse :5， -TCCTTGATCTTGTCCATTATGCC-3' (SEQ ID N0:10);
[0062] D4-Forward :5，-GGCATAATGGACAAGATCAAGGA-3，（SEQ ID N0:11);
[0063] D4-Reverse:5， -GACAAAAGACACTTAATATATGTATTTCAGA-3， （SEQ ID N0:12)
[0064] 表1PCR反應條件
[0065]
【主權項】
1. 一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸是： (1) 核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示的多核苷酸； (2) 核苷酸序列與SEQ ID No. 4所示的多核苷酸有80%以上同源性，優(yōu)選為85%以上 同源性，更優(yōu)選為90%以上同源性，且具有SEQ ID No. 4所示的多核苷酸功能的多核苷酸。
2. 如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述（2)中的多核苷酸具體指，SEQ ID No. 4所示的多核苷酸經過取代、缺失或者添加一個或幾個堿基而得到的，且具有SEQ ID No. 4所示的多核苷酸功能的多核苷酸。
3. 如權利要求1-2任一權利要求所述的多核苷酸的用途，用于作為啟動子元件，所述 啟動子元件用于在植物生物反應器中多種蛋白或多肽的表達。
4. 如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述啟動子元件用于在植物生物反應器中 指導多種不同來源的蛋白或多肽的誘導表達。
5. 如權利要求1-2任一權利要求所述的所述多核苷酸用于植物生物反應器的表達載 體的用途。
6. 所述的多核苷酸可作為指導外源蛋白表達的啟動子用于構建或改造植物生物反應 器表達載體，所述待改造植物生物反應器表達載體包括但不限于：pCAMBIA系列載體、pBI 121及pBI系列載體、pPZP系列載體pSN1301 (可轉化雙子葉植物植物）、pUN1301 (可轉化 單子葉植物）PRTL2、pRTL2-GFP、pRTL2-CFP、pRTL2-RFP、pRTL2-YFP。
7. -種植物生物反應器表達載體，所述表達載體含有至少一個如權利要求1-2任一權 利要求所述的多核苷酸，作為啟動子元件，由所述的啟動子來指導外源蛋白的表達。
8. 如權利要求7所述的一種植物生物反應器表達載體，其特征在于，所述表達載體為 將載體PBI 121中的CaMV35S啟動子換為所述的多核苷酸（啟動子）后獲得。
9. 一種宿主細胞，所述細胞含有如權利要求7-8任一權利要求所述的表達載體或基因 組中整合有外源的如權利要求1-2任一權利要求所述的多核苷酸。
10. -種蛋白或多肽的表達方法，包括下列步驟： 1) 采用前述表達載體構建所述多種不同來源的蛋白或多肽的重組表達載體； 2) 將步驟1獲得的重組表達載體轉染宿主，并在合適表達所述蛋白或多肽的條件下培 養(yǎng)所述宿主。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及一種狗牙根Tifway脫水素蛋白Dehydrin基因的啟動子。本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸是：（1）核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的多核苷酸；（2）核苷酸序列與SEQ ID No.4所示的多核苷酸有80%以上同源性，優(yōu)選為85%以上同源性，更優(yōu)選為90%以上同源性，且具有SEQ ID No.4所示的多核苷酸功能的多核苷酸。通過檢測GFP的表達結果證明，該啟動子具有啟動子的活性，并受ABA和干旱脅迫誘導活性增強，由此顯示了該脫水素基因在狗牙根中響應干旱逆境的作用。此外，本發(fā)明啟動子與其他啟動子進行比較，適用于植物中啟動報告基因如綠色熒光蛋白GFP基因的表達，并具有受誘導可調控的活性特征。
【IPC分類】C12N15-113, C12N15-82, C12N5-10
【公開號】CN104805086
【申請?zhí)枴緾N201510253462
【發(fā)明人】周鵬, 安淵, 呂愛敏, 張荻, 蘇連泰, 李強
【申請人】上海交通大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月18日