抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的生物反應(yīng)器的制備方法以及利用該生物反應(yīng)器制備抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的方法，通過(guò)建立能夠特異性表達(dá)針對(duì)丙型肝炎病毒基因組的干擾核糖核酸(SiRNA)的乳腺生物反應(yīng)器，為治療丙肝的SiRNA藥物的研制和生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎病毒Ofepatitis Cvirus)簡(jiǎn)稱(chēng)丙肝病毒(HCV)，于1978年被發(fā)現(xiàn)，其由外殼和其中的單鏈RNA組成。1989年，HCV基因組序列被首次獲得。HCV主要經(jīng)血源傳播，此外還可以通過(guò)其他方式傳播，如母嬰垂直傳播和性傳播等。HCV感染可引發(fā)丙型肝炎，但發(fā)病機(jī)理仍不十分清楚。臨床觀(guān)察資料表明，人感染HCV后所產(chǎn)生的保護(hù)性免疫力很差，臨床上50 %的丙型肝炎病人可發(fā)展為慢性肝炎，甚至部分病人會(huì)發(fā)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌。
[0003]目前尚無(wú)針對(duì)丙型肝炎的疫苗，唯一的預(yù)防措施是防止血液接觸。被發(fā)現(xiàn)感染HCV后，通常采取的是聚乙二醇干擾素a-2a或a-2b (peginterferon)聯(lián)合病毒唑(ribavirin)治療。這也是迄今為止唯一有效的方案。但是，聚乙二醇干擾素與病毒唑單獨(dú)和/或聯(lián)合使用治療丙型肝炎帶來(lái)的毒副作用不容忽視，其在適宜人群和與其他藥物聯(lián)用方面也面臨諸多限制。
[0004]近年來(lái)出現(xiàn)了多種輔助抗病毒藥物治療的新型技術(shù)，包括核酶技術(shù)、細(xì)胞內(nèi)干擾性多肽或蛋白質(zhì)療法，以及DNA免疫療法等。其中，核酶(ribozyme)技術(shù)是指通過(guò)人工合成具有催化活性的小分子核酶，即有催化活性的單鏈RNA分子，例如發(fā)夾狀核酶，與靶RNA中的互補(bǔ)序列特異性結(jié)合進(jìn)而進(jìn)行切割。在上述新型技術(shù)中，小干擾核糖核酸(smallinterfering RNA,縮寫(xiě)為siRNA)藥物又是一大熱點(diǎn)。RNA干擾(RNA interference,縮寫(xiě)為RNAi)是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過(guò)阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)人與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。此現(xiàn)象可對(duì)外來(lái)基因材料，如轉(zhuǎn)位子、病毒等對(duì)基因組的破壞起到防御作用。通過(guò)RNAi機(jī)制，siRNA可特異性地、有效地沉默靶基因。已有研究證明，siRNA作用于HCV、HBV和HIV，都能表現(xiàn)出抗病毒作用(Nat.B1technol.21(6):639-644(2003) ；S.B.Kapadia, et al.1nterference of hepatitis C virus RNArepli cat1n by short interfering RNAs.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.100 (4):2014-2018(2003) ；J.A.Wilson, et al.RNA interference blocks gene express1n andRNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.100(5):2783-2788(2003) ；A.P.McCaffrey, et al.1nhibit1n ofhepatitis B virus in mice by RNA interference.G.A.Coburn and B.R.Cullen.Potentand specific inhibit1n of human immunodeficiency virus typelreplicat1n by RNAinterference.J.Virol.76(18):9225-9231 (2002))。
[0005]雖然使用siRNA治療丙肝的療效前景樂(lè)觀(guān)，但仍需克服諸多方面的技術(shù)難題，包括siRNA的靶向性有效釋放、siRNA的制備等。目前，制備siRNA的方法主要有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、酶切長(zhǎng)鏈dsRNA法、siRNA表達(dá)載體法和PCR表達(dá)框法。這些方法普遍存在產(chǎn)出率較低、生產(chǎn)成本較高的缺點(diǎn)。
[0006]動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究則始于1987年，Gordon等將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的啟動(dòng)子構(gòu)成重組基因，成功地培育出了 37只在乳汁中能表達(dá)tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠。同年，世界上第一只能從乳汁中分泌α 1-抗胰蛋白酶(AAT)的轉(zhuǎn)基因綿羊在英國(guó)羅斯林研究所誕生。從此，開(kāi)始了乳腺生物反應(yīng)器的實(shí)用性研究。Simons等(Simons等，1987年)將帶MT啟動(dòng)子的β -乳球蛋白_凝血因子IX(BLG-FIX)、BLG-AAT等重組DNA片段注射到綿羊受精卵中，獲得了在乳汁中有外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因后代。Wilmut等將羊乳球蛋白基因片段與F-1X和AAT-cDNA融合質(zhì)粒注入小鼠及綿羊受精卵中，獲得乳汁中含F(xiàn)-1X和AAT的轉(zhuǎn)基因小鼠及綿羊。Wright等將綿羊BLG基因調(diào)控區(qū)與人AAT基因相連，獲得了 4只轉(zhuǎn)基因綿羊。Velander等利用WAP基因啟動(dòng)子與人蛋白質(zhì)C(hPC) cDNA重組基因獲得轉(zhuǎn)基因豬，重組hPC的表達(dá)量(lg/L)此人血中hPC濃度還高200倍。Ebert等用β-CA基因的啟動(dòng)子引導(dǎo)tPA在山羊乳汁中得到表達(dá)(l_3g/L)。Wilmut等(Wilmut等，1997年)首創(chuàng)體細(xì)胞克隆rl并表達(dá)人F-1X的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。2000年，英國(guó)PPL公司將人類(lèi)AAT基因定點(diǎn)整合到胎兒成纖維細(xì)胞的前膠原基因座上，用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因打靶綿羊(McCreath等，2000年)；2001年，他們又利用基因打靶技術(shù)生產(chǎn)出了AAT、3-GT和朊病毒雙剔除的克隆綿羊。上述研究可以看出，從模式動(dòng)物-小鼠的轉(zhuǎn)基因研究開(kāi)始，研究人員逐步建立起了大動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制備的技術(shù)平臺(tái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]目前，治療HCV感染采用的干擾素和核苷類(lèi)似物普遍存在副作用較大，療效不理想，且?guī)缀醪豢杀苊獬霈F(xiàn)病毒耐藥變異性等缺陷，而自上世紀(jì)90年代興起的RNAi技術(shù)以其對(duì)病毒抑制作用的靶向性、特異性和高效性，為HCV感染的治療帶來(lái)新的希望。但是，現(xiàn)有RNAi技術(shù)所必需的siRNA的制備技術(shù)尚存在產(chǎn)出率低和生產(chǎn)成本高等缺陷，而動(dòng)物乳腺生物發(fā)生器技術(shù)以其天然、高效和低成本的特征，可以克服上述siRNA制備技術(shù)的缺陷。本發(fā)明人將目光鎖定在牛乳腺生物發(fā)生器在生產(chǎn)抗HCV siRNA方面的應(yīng)用前景，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)形成可在牛乳中表達(dá)抗HCV siRNA的乳牛，使其穩(wěn)定而高效地生產(chǎn)抗HCV的siRNA，為HCV的基因藥物研發(fā)提供穩(wěn)定的物質(zhì)基礎(chǔ)。具體來(lái)說(shuō)，將外源目的基因?qū)肴榕；蚪M并定位表達(dá)于牛乳腺中，利用動(dòng)物乳腺天然、高效合成并分泌有機(jī)物的能力，從牛乳中生產(chǎn)出具備抗HCV能力的si RNAs。
[0008]本發(fā)明所述的生物反應(yīng)器是指采用轉(zhuǎn)基因方法將外源性目的基因轉(zhuǎn)入生物，例如乳牛，形成的能夠分泌外源性目的基因產(chǎn)物的生物體，例如乳牛。
[0009]本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的生物反應(yīng)器的制備方法，該制備方法包括以下步驟:
[0010](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；具體來(lái)說(shuō)，所述抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸為能夠?qū)е卤透窝撞《净蚪M發(fā)生特異性降解的小干擾核糖核酸；
[0011](2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，所述受體細(xì)胞為乳牛受精卵細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或早期胚胎；
[0012](3)利用步驟(2)制得的受體細(xì)胞通過(guò)假孕乳牛發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。
[0013]在上述生物反應(yīng)器中，載體還可以包含一種或多種選自半乳糖基因啟動(dòng)子、酪蛋白啟動(dòng)子、乳球蛋白啟動(dòng)子、S1-酪蛋白基因啟動(dòng)子、乳清酸蛋白啟動(dòng)子和乳清蛋白基因啟動(dòng)子的基因序列。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，上述生物反應(yīng)器的制備方法采用顯微注射法，具體包括以下步驟:
[0015](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；
[0016](2)將步驟⑴構(gòu)建的載體導(dǎo)入乳牛受精卵細(xì)胞；
[0017](3)將步驟(2)制得的乳牛受精卵細(xì)胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。
[0018]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，上述生物反應(yīng)器的制備方法采用逆轉(zhuǎn)錄病毒法，具體包括以下步驟:
[0019](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；優(yōu)選地，編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列連接在逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR下部；更優(yōu)選地，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成高滴度病毒顆粒。
[0020](2)將步驟(I)構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)人乳牛受精卵細(xì)胞；這樣包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因被整合到乳牛受精卵細(xì)胞的基因組。
[0021](3)將步驟(2)制得的乳牛受精卵細(xì)胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。
[0022]在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，上述生物反應(yīng)器的制備方法采用胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES細(xì)胞)法,具體包括以下步驟:
[0023](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；
[0024](2)將步驟⑴構(gòu)建的載體導(dǎo)人乳牛胚胎干細(xì)胞；
[0025](3)將步驟⑵制得的乳牛胚胎干細(xì)胞與乳牛胚囊細(xì)胞混合(例如通過(guò)囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宮中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。優(yōu)選地，可以再利用生殖系嵌合子代設(shè)計(jì)進(jìn)行交配育種獲得純系。
[0026]對(duì)上述技術(shù)方案獲得的轉(zhuǎn)基因乳牛的遺傳性能進(jìn)行觀(guān)察和研究，結(jié)果顯示這些轉(zhuǎn)基因乳牛均可以作為生物反應(yīng)器高效、穩(wěn)定地生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
[0027]本發(fā)明還提供了一種抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的制備方法，該制備方法包括以下步驟:
[0028](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；具體來(lái)說(shuō)，所述抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸為能夠?qū)е卤透窝撞《净蚪M發(fā)生特異性降解的小干擾核糖核酸；
[0029](2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導(dǎo)人乳牛受體細(xì)胞，所述受體細(xì)胞為受精卵細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或早期胚胎；
[0030](3)利用步驟(2)制得的受體細(xì)胞通過(guò)假孕乳牛發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛；
[0031](4)從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
[0032]在上述制備方法中，載體還可以包含一種或多種選自半乳糖基因啟動(dòng)子、β -酪蛋白啟動(dòng)子、乳球蛋白啟動(dòng)子、S1-酪蛋白基因啟動(dòng)子、乳清酸蛋白啟動(dòng)子和乳清蛋白基因啟動(dòng)子的基因序列。
[0033]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，上述制備方法優(yōu)選采用顯微注射法，具體包括以下步驟:
[0034](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；
[0035](2)將步驟⑴構(gòu)建的載體導(dǎo)入乳牛受精卵細(xì)胞；
[0036](3)將步驟⑵制得的乳牛受精