一種油菜角果數(shù)主效qtl的分子標記及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于油菜分子育種和生物技術領域，具體涉及一種與甘藍型油菜角果數(shù)主 效QTL位點緊密連鎖的分子標記及其應用。
【背景技術】
[0002] 油菜是我國最重要的油料作物之一，種植面積和總產(chǎn)量都占全世界的三分之一左 右（傅廷棟，2010)。菜籽油占我國國產(chǎn)油料作物產(chǎn)油量的55%以上，是國產(chǎn)食用植物油的 第一大來源，在國家食用油供給安全戰(zhàn)略中地位十分重要（王漢中2006)。近年來，我國國 產(chǎn)植物油年產(chǎn)量僅維持在900-1000萬噸左右，自給率不足40%且有進一步下降的趨勢，這 對我國食用植物油供給安全造成了重大威脅（王漢中，2004)。在城鎮(zhèn)化規(guī)模持續(xù)擴大耕地 面積進一步縮小的形勢下，持續(xù)提高單位面積產(chǎn)油量（=單產(chǎn)X含油量）是主要出路。近 年來，我國油菜品種含油量提高較快而單產(chǎn)增加十分緩慢，這嚴重影響了農(nóng)民種植油菜的 經(jīng)濟效益和積極性。因此，提高油菜單產(chǎn)已經(jīng)成為目前我國油菜生產(chǎn)最為迫切的任務之一， 是事關我國油菜產(chǎn)業(yè)持續(xù)與發(fā)展的根本問題（殷艷，2011)。
[0003] 在同一種植密度條件下，油菜單產(chǎn)取決于單株產(chǎn)量，而單株產(chǎn)量直接決定于全株 角果數(shù)、每角粒數(shù)和粒重三個產(chǎn)量構成因子。其中，角果數(shù)和單株產(chǎn)量的相關性最高（俞琦 英等，2010)，對其貢獻最大。雖然油菜單株產(chǎn)量的三個構成因子（單株角果數(shù)、每角粒數(shù)和 粒重）之間表現(xiàn)不同程度的負相關，但其相關系數(shù)往往不大（Shi et al. 2009)，這表明可以 通過提高單個產(chǎn)量構成因子（如角果數(shù)）來增加產(chǎn)量（Zhang et al. 2007)。研究表明，我 國2001-2010年國家審定冬油菜品種產(chǎn)量構成因子的平均值（如單株角果數(shù)僅有395個） 跟油菜種質資源的最高水平（700個左右）相比還有相當差距（張芳等，2012)，這表明油菜 產(chǎn)量的提高還有很大潛力。
[0004] 隨著分子生物學和分子遺傳學的發(fā)展，育種家們對性狀的選擇正在逐漸實現(xiàn)由 表型選擇向基因型選擇的過渡（Xu et al. 2010)。分子標記輔助育種是將分子遺傳學與傳 統(tǒng)的表型選擇有效結合的一種新的育種手段，其基本原理是在油菜育種過程中直接利用 與目標性狀基因緊密連鎖或共分離的分子標記對選擇個體進行目標區(qū)域以及全基因組篩 選，以達到提高目標性狀選擇效率、縮短育種年限的目的。分子標記輔助選擇育種技術的 關鍵是鑒定與重要農(nóng)藝性狀緊密連鎖的DNA分子標記。近年來，美國等發(fā)達國家都投入巨 資開展這方面的研究工作。伴隨著水稻、玉米、小麥等重要作物農(nóng)藝性狀分子標記的開發(fā)， 利用篩選到的分子標記進行輔助選擇育種已漸趨成熟，目標性狀也從簡單的單基因質量性 狀擴展到復雜的多基因數(shù)量性狀。與發(fā)達國家相比，我國油菜分子育種研究起步較晚還有 較大差距，主要體現(xiàn)在：不能有效地發(fā)掘和利用種質資源中的有利基因，缺乏有自主知識產(chǎn) 權及育種價值的基因和標記等（王漢中等，2010)。
[0005] 大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀（如產(chǎn)量、品質、抗性等）均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點，表 型連續(xù)分布且易受環(huán)境條件的影響，因此基于表型選擇的常規(guī)育種方法對復雜數(shù)量性狀 的選擇效果不好，致使育種效率低下，育種周期延長。由于分子標記技術和數(shù)量遺傳學的 發(fā)展和結合，人們已可將復雜的數(shù)量性狀分解為單個的數(shù)量性狀基因位點（quantitative trait loci，QTL)，然后像研究質量性狀一樣對控制數(shù)量性狀的多個基因進行研究 (Paterson et al. 1988)。QTL定位就是在遺傳分離群體的基礎上，借助分子標記和遺傳圖 譜，利用QTL作圖軟件對分離群體的數(shù)量性狀表型數(shù)據(jù)進行分析，從而確定數(shù)量性狀基因 在染色體上的位置和效應。
[0006] 目前對油菜角果數(shù)的QTL定位研究也有一些報道（沈金雄等，2003 ;張書芬等， 2006 ;易斌等，2006 ;高必軍等，2007 ;Radoev et al. 2008 ;Shi et al. 2009 ;王峰等，2010 ; 吳建忠等，2010 ;孫美玉等，2013)，但通常檢測出的QTL效應值較小且重復性不好，較難在 油菜育種中應用。本研究利用在角果數(shù)性狀上有極顯著差異的油菜品種（系）構建的分離 群體進行通過多年QTL定位，旨在分離對油菜角果數(shù)具有穩(wěn)定和較大效應的主效QTL位點， 并開發(fā)出與其緊密連鎖的分子標記用于油菜角果數(shù)性狀的輔助選擇。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明目的是在于提供了一種與甘藍型油菜角果數(shù)主效QTL位點緊密連鎖的分 子標記 CNU400,該分子標記通過引物 CNU400F:5' -CGAGTTTTTGTGTGTACGTATAGTAAT-3' 和 CNU400R :5' -CCAAAGTGCGTAAAGGAAGG-3' 擴增得到。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種與甘藍型油菜角果數(shù)主效QTL位點緊密連 鎖的分子標記的應用?？捎糜诜肿訕擞涊o助選擇、以及該主效QTL的精細定位和圖位克隆。 本發(fā)明為油菜育種提供了新手段，可加速油菜角果數(shù)性狀的改良進程，提高育種的準確性 和選擇效率。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施：
[0010] 一種油菜角果數(shù)性狀主效QTL位點的篩選方法，它包括如下步驟：
[0011] (1)利用油菜中雙11號和73290雜交，雜種F1代自交產(chǎn)生F2和&: 3代分離群體。
[0012] (2)采用CTAB法（Doyle et al. 1987)提取親本中雙11和73290及F2分離群 體的葉片總DNA，過程中所用到的試劑包括提取液（1.4M NaCl，IOOmM Tris，pH 8.0, 20m M EDTA，pH 8. 0,2% CTAB)、氯仿、異戊醇、無水乙醇；
[0013] (3)合成油菜公開（http://www. ukcrop. net/Brassica DB)和自主開發(fā)的 SSRjPI STS 引物（Wang et al. 2012 ;Huang et al. 2013 ;Shi et al. 2014,），并對親本DNA進行PCR 擴增，產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，染色和顯影后對條帶的大小進行判別，篩選多態(tài) 性引物。過程中所用到的主要軟件包括SSRPrimer，BWA和samtools ;主要試劑包括Taq酶、 dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸銀等，
[0014] (4)利用多態(tài)性引物對F2分離群體進行分子標記分析，獲得基因型數(shù)據(jù)。過程中 用到的主要試劑同上；
[0015] (5)把F2分離群體的基因型數(shù)據(jù)輸入Joinmap4. 0軟件，進行遺傳連鎖圖譜的構 建；
[0016] (6) F2群體的基因型數(shù)據(jù)（僅限于定位到遺傳圖譜上的標記）以及F2和F2:3群體 的角果數(shù)性狀數(shù)據(jù)輸入WinQTLcart2. 5軟件進行QTL定位，總共檢測到了十來個控制角果 數(shù)的QTL。其中，位于A6連鎖群上的QTL在兩個群體和三個年份中能重復檢測到，而且效應 值和貢獻率最大。
[0017] 利用上述技術措施，申請人最終獲得了油菜角果數(shù)性狀的主效QTL位點qPN.A6， 該主效QTL位點位于油菜A6染色體，與SSR標記CNU400緊密連鎖，其引物序列為CNU400F :5' -CGAGTTTTTGTGTGTACGTATAGTAAT-3' 和 CNU400R :5' -CCAAAGTGCGTAAAGGAAGG-3'。在中 雙11號和73290中分別可擴增出229和260bp大小的條帶。利用WinQTLCart2. 5軟件分 析測得其對油菜角果數(shù)的平均貢獻率為18. 5%，加性效應為-6. 5,顯性效應