一種應(yīng)用微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備基因缺失減毒疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種應(yīng)用微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備基因缺失 減毒疫苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單純瘤疹病毒化e巧es simplex virus,服V)是一類嚴(yán)重危害人類健康、引起皮膚 病和性病的常見病原體，HSV- 1最常見的感染部位是口腔和唇，HSV- 2主要通過性傳播。美 國每年有生殖器瘤疹5萬多例，70多萬孕婦為預(yù)防胎兒經(jīng)產(chǎn)道感染HSV而被迫施行剖宮產(chǎn)分 娩。據(jù)WHO估計(jì)，每年生殖器瘤疹的新發(fā)病例約2000萬。臨床上80%HSV感染者表現(xiàn)為無癥狀 感染或癥狀未被識別，運(yùn)是造成HSV感染流行的重要因素。
[0003] 盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物應(yīng)用能縮短生殖器瘤疹感染的病程，并且其治療復(fù)發(fā)性感 染具有一定的效果，但運(yùn)些抗病毒藥物不能有效預(yù)防瘤疹病毒原發(fā)感染W(wǎng)及控制瘤疹病毒 潛伏感染和復(fù)發(fā)性感染。研制和接種HSV疫苗是預(yù)防該病毒感染的理想方法。
[0004] 動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，HSV疫苗能預(yù)防病毒原發(fā)感染，并能有效地控制復(fù)發(fā)性生殖 器瘤疹感染。目前HSV疫苗的研制日益受到人們的重視，研究較多的HSV疫苗主要有滅活病 毒疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗、復(fù)制受限疫苗、活載體疫苗W及DNA疫苗等。
[000引早期的滅活病毒疫苗是利用加熱、化學(xué)處理、紫外線照射等方法將接種在雞胚中 的HSV病毒滅活制備疫苗。現(xiàn)在的滅活疫苗是將在細(xì)胞中培養(yǎng)的病毒滅活并經(jīng)過一系列的 純化過程制成的。但滅活疫苗存在免疫原性弱、不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣泛持久的免疫反應(yīng)、不 能確定是否所有病毒均被滅活、裂解的DNA片段潛在致癌的可能性、生產(chǎn)費(fèi)用高等缺點(diǎn)。
[0006] 近年來，HSV減毒活疫苗的研制主要集中在特異性地造成HSV病毒基因缺失某一區(qū) 段，使HSV的神經(jīng)毒性減弱，建立潛伏感染的能力降低，DNA復(fù)制障礙等，同時保持病毒的增 殖能力和免疫原性運(yùn)一目標(biāo)上。但有報(bào)道指減毒活疫苗隱患較多，一方面，重組的HSV病毒 經(jīng)過反復(fù)的細(xì)胞培養(yǎng)后，仍然不能獲得穩(wěn)定的減毒株，減毒活疫苗可能重新獲得病毒毒性； 另一方面，減毒的病毒可能會潛伏于病人體內(nèi)，有可能會與感染的HSV野生病毒株重組，重 新獲得病毒毒性。此外，某些HSV基因也存在致癌的潛在可能。新型DNA疫苗雖能同時誘導(dǎo)體 液和細(xì)胞免疫，但是其轉(zhuǎn)染效率較低，經(jīng)粘膜免疫誘導(dǎo)有效的粘膜免疫應(yīng)答能力更低。而在 單純瘤疹病毒的免疫應(yīng)答過程中，細(xì)胞免疫和粘膜免疫發(fā)揮著重要的作用，由于上述現(xiàn)有 的幾類疫苗均不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答，因此，到目前為止，尚無可W在臨床 上應(yīng)用的單純瘤疹病毒疫苗上市，單純瘤疹病毒疫苗基本上都處于臨床前或臨床研究階 段?；蛉毕轀p毒疫苗是一種利用基因技術(shù)方法制備得到的疫苗，結(jié)合了減毒活疫苗W及 滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)。制備方法是將病毒復(fù)制必需的基因部分去除后，缺陷性病毒疫苗在經(jīng)過 遺傳改造過的細(xì)胞株里生長，W構(gòu)成性地表達(dá)缺失基因的病毒產(chǎn)物。子代病毒缺乏必需基 因產(chǎn)物，因而沒有傳染性。研究表明，在動物實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)種疫苗具有抗HSV原發(fā)感染作用。
[0007] 傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)病毒疫苗，產(chǎn)量低，純度不高。微載體為單層貼壁細(xì)胞的生長 繁殖提供了一個大的表面區(qū)域，為細(xì)胞生長提供了一個勻質(zhì)的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)。反應(yīng)器微載 體培養(yǎng)系統(tǒng)具有很大的優(yōu)勢：1)比表面積大，Ig微載體提供的表面積約等于15個T75規(guī)格的 細(xì)胞培養(yǎng)瓶提供的表面積，較大的比表面積可有效的節(jié)省空間和培養(yǎng)基W及昂貴的添加劑 如血清、生長因子等的成本，提高了培養(yǎng)基的利用率和單位體積細(xì)胞的產(chǎn)率;2)有利于反應(yīng) 器中高效的氣液傳遞，有效的維持細(xì)胞生長的關(guān)鍵物理、化學(xué)和生物環(huán)境;3)反應(yīng)器微載體 培養(yǎng)系統(tǒng)可用于調(diào)整和檢測細(xì)胞培養(yǎng)所需的抑、P化、剪切力水平、攬拌和營養(yǎng)成分，因此可 實(shí)現(xiàn)更嚴(yán)格的調(diào)整細(xì)胞增殖、分化等不同的生物過程，批次間具有較高的重現(xiàn)性;4)微載體 密度和體積遠(yuǎn)大于細(xì)胞，產(chǎn)物與細(xì)胞可方便的分離，換液簡單，除了作為錯地依賴型細(xì)胞增 殖的基質(zhì)外，微載體也用來提供分化和未分化細(xì)胞的放大培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞的微載體培養(yǎng)系 統(tǒng)被認(rèn)為是今后對抗傳染性疾病大流行的一種關(guān)鍵技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備基因缺失減毒疫苗的 方法。本發(fā)明提供的應(yīng)用微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備基因缺失減毒疫苗的方法可W大量制備 高質(zhì)量的單純瘤疹病毒I型化5基因缺失減毒疫苗，可W實(shí)現(xiàn)工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)瘤疹病毒疫 苗，同時，本發(fā)明制備的疫苗可W安全有效的激活人體的免疫應(yīng)答，降低瘤疹病毒對人體的 感染。
[0009] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下： 一種應(yīng)用微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備基因缺失減毒疫苗的方法，其特征在于，包括W下 步驟：Sl、敲除單純瘤疹病毒I型的化5基因，制備單純瘤疹病毒I型化5基因缺失質(zhì)粒，即 BAC-HSV-AUL5質(zhì)粒；S2、構(gòu)建PCDNA3.1-UL5真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞，使Vero細(xì)胞 表達(dá)化5蛋白，制備表達(dá)化5蛋白的Vero細(xì)胞;S3、微載體擴(kuò)增培養(yǎng)S2所述的表達(dá)化5蛋白的 Vero細(xì)胞;S4、將Sl所述的BAC-HSV-A化5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至不加微載體常規(guī)培養(yǎng)的表達(dá)化5蛋白 的Vero細(xì)胞中，3-5天后觀察到細(xì)胞有病變并且出現(xiàn)空斑，再收集細(xì)胞反復(fù)凍融獲得病毒懸 液;S5、將S4收集的病毒懸液按病毒感染復(fù)數(shù)MOI為0.001:1的量接種病毒到S3中微載體培 養(yǎng)的表達(dá)化5蛋白的Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中；S6、收集S5中的培養(yǎng)液上清，過濾，得病毒液;S6、病 毒加入凍干保護(hù)劑，制成疫苗； 所述單純瘤疹病毒I型化5基因敲除制備BAC-HSV-A化5質(zhì)粒的方法包括W下步驟：1) 制備UL5同源重組片段UL5-Kam-sacB;2)將UL5-Kam-sacB基因片段轉(zhuǎn)染至含有BAC-服V-I質(zhì) 粒的大腸桿菌中，經(jīng)卡那霉素挑單克隆篩選出插入了化5-Kam-sacB基因片段的大腸桿菌； 3)鑒定化5成功敲除的菌落，提取BAC-服V-A化5質(zhì)粒。
[0010] 優(yōu)選地，所述的化5同源重組片段的制備方法包括W下步驟：1)W抗卡那霉素基因 Kam-sacB為模板，通過PCR擴(kuò)增制備化5C-Kam-sacB片段，所述PCR擴(kuò)增的引物包括上游引物 CBUL5，其序列為5 ' -CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTC AACAAAGCCA-3'（SEQ ID N0.1)和下游引物UL5ab2，其序列為5'-GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC -3' (沈Q ID側(cè).2);2)^化5(：-1(3111-33。8片段為模板，通過?0?擴(kuò)增制備化5同源重組片段，所述 PCR擴(kuò)增的引物包括上游引物ULSabl，其序列為5 ' -GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTA AGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC-3 '（SEQ ID NO. 3)和下游引物UL5ab2，其序列為 5'-GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC -3' (沈Q ID NO.2)。
[0011] 優(yōu)選地，所述的抗卡那霉素基因 Kam-sacB是W Kam-sacB全片段為模板，通過PCR 擴(kuò)增獲得，所述PCR擴(kuò)增的引物包括上游引物Kam-sacB sense,其序列為5'-CGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAA-3 '（ SEQ ID NO . 4)和下游引物Kam-sacB antisense,其序列為5' -GCATCTTGCAAGAATGGCGCTCGTTTAATAG -3'（沈Q ID N0.5)。
[001引優(yōu)選地，所述的PCDNA3.1-UL5真核表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建包括W下步驟：1) WBAC-HSV-I質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增化5基因片段，所述PCR擴(kuò)增引物包括上游引物為化5_F，其 序列為5'-AATTGGATCCGAGCGTGGT-GCGGTCATG -3'（沈Q ID 側(cè).6)和下游引物化5_1?，其序列 為5'-AAGCTCGAGAGGGGACG-GCGGGTTAATAG -3'（SEQ ID N0.7);2)用BamHI,趾01 雙酶切 PCDNA3.1和擴(kuò)增的化5基因片段，再用T4連接酶連接PCDNA3.1和化