一種調(diào)控1,4-二羥基-2-萘甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶活力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物菌種改造領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控1，4-二羥基-2-萘甲 酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶活力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（UbiA)是細(xì)菌體內(nèi)一種用來催化4-羥基-萘 甲酸和側(cè)鏈聚異戊二烯生成3-聚異戊二烯-4-羥基苯甲酸的酶，該酶活力的提高可以顯著 增強(qiáng)細(xì)菌輔酶Q(Co?的合成能力，并且該酶對(duì)聚異戊二烯焦磷酸的專一性不強(qiáng)，可接受不 同數(shù)目的異戊二烯。將ubiA基因克隆，并裝載于光合細(xì)菌啟動(dòng)子下游，可以實(shí)現(xiàn)其在光合 細(xì)菌中的大量表達(dá)，增強(qiáng)光合細(xì)菌對(duì)羥苯甲酸聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶的活性，使光合細(xì)菌體內(nèi) C〇Q1(l的含量大幅增加。
[0003] 1，4-二羥基-2-萘甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（MenA)是細(xì)菌體內(nèi)一種用來催化 1,4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA)和側(cè)鏈聚異戊二烯生成去甲基維生素1(2的關(guān)鍵酶，有研宄 表明，menA基因的過表達(dá)能將大腸桿菌合成維生素K2的能力提高2倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)過表 達(dá)men家族的其它基因。因此，該酶活力的調(diào)節(jié)對(duì)于細(xì)菌合成維生素K2至關(guān)重要。
[0004] 輔酶Q與維生素1(2擁有共同的側(cè)鏈合成途徑，競(jìng)爭(zhēng)同一個(gè)側(cè)鏈底物。因此，ubiA 基因的表達(dá)不利于菌體內(nèi)維生素K2的合成。然而，ubiA基因的徹底敲除又會(huì)抑制菌體的生 長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種調(diào)控1，4-二羥基-2-萘甲酸-聚異戊 二烯轉(zhuǎn)移酶活力的方法，降低了聚異戊二醇菌體內(nèi)代謝流向輔酶Q的合成，通過調(diào)節(jié)4-羥 苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（UbiA)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響菌體內(nèi)1，4-二羥基-2-萘甲 酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（MenA)的活力。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種調(diào)控1，4-二羥基-2-萘甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn) 移酶活力的方法，包括如下步驟：
[0007] a.將納豆芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0008] b.提取納牙抱桿囷全基因組；
[0009] C.以4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物對(duì)，對(duì)納豆芽孢桿 菌全基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因片段；
[0010] d.將目的基因片段與載體連接構(gòu)建用于抑制1，4-二羥基-2-萘甲酸-聚異戊二 烯轉(zhuǎn)移酶活性的干擾載體；
[0011] e.干擾載體轉(zhuǎn)化納豆芽孢桿菌，并利用載體上的抗性基因篩選轉(zhuǎn)化子，將篩選到 的一株轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上以備檢測(cè)；
[0012] f.從斜面培養(yǎng)基上挑取菌落在種子培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)突變株；
[0013] g.將原納豆芽孢桿菌及突變株分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測(cè)各菌株的生長(zhǎng)情況， 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，測(cè)定發(fā)酵液維生素K2含量，并采用反轉(zhuǎn)錄PCR或熒光定量PCR檢 測(cè)各菌株4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶和1，4-二羥基-2-萘甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶 表達(dá)水平。
[0014] 優(yōu)選的，所述在LB液體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)均處于37°C溫度條件。
[0015] 所述步驟c中目的基因片段兩側(cè)加有限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基序列。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟d中的載體為基因敲除載體或沉默載體。
[0017] 所述步驟e中干擾載體轉(zhuǎn)化納豆芽孢桿菌的方式可以為電激轉(zhuǎn)化、采用聚乙二醇 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、異丙醇轉(zhuǎn)化或二甲基亞砜轉(zhuǎn)化。其中采用聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化和二甲基亞砜轉(zhuǎn)化的方式能夠使維生素1( 2含量得到提高。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟g中菌株的生長(zhǎng)情況采用BioscreenCMBR自動(dòng)微生物生長(zhǎng)分 析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
[0019] 優(yōu)選的，所述步驟g中測(cè)定發(fā)酵液維生素1(2含量采用HPLC進(jìn)行測(cè)量，熒光定量PCR 檢測(cè)采用SYBRGreenReal-TimeqPCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0020] 所述4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶基因是SEQIDNo:1所示的堿基序列。
[0021] 所述1，4_二羥基_2_蔡甲酸-聚異戊二條轉(zhuǎn)移酶基因是SEQIDNo:2所不的喊 基序列。
[0022] 所述步驟c中的引物對(duì)為SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的核苷酸序列。
[0023] 本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明通過分子生物學(xué)手段調(diào)控納豆芽孢桿菌ubiA 基因的表達(dá)水平，獲得一株ubiA基因下調(diào)突變株；本發(fā)明獲得的突變株菌體生物量比原始 菌略有下降；進(jìn)入發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后menA轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，維生素1(2產(chǎn)量也有明顯提 高。該方法通過抑制納豆芽孢桿菌中4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（UbiA)的活力，降 低了聚異戊二醇菌體內(nèi)代謝流向輔酶Q的合成。更為重要的是，通過ubiA基因的調(diào)節(jié)，也 影響了菌體內(nèi)1，4-二羥基-2-萘甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（MenA)的活力，從而直接影響 了納豆芽孢桿菌合成維生素K2的能力。本發(fā)明為維生素1(2優(yōu)良菌株的選育提供了一條新 思路，在食品、生物制藥領(lǐng)域具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1為各突變株采用反轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)得ubiA基因的不同表達(dá)水平；
[0025] 圖2為各突變株采用熒光定量PCR測(cè)得ubiA基因的不同表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明做出適當(dāng)?shù)男薷?、變?dòng)，這些修改和變 動(dòng)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
[0027] 實(shí)施例一
[0028] 以納豆芽孢桿菌MH-1為出發(fā)菌株，依次按照下列步驟進(jìn)行操作：
[0029] 1、將納豆芽孢桿菌培養(yǎng)在50mLLB培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)48h。
[0030] 2、收集培養(yǎng)液，離心后收集菌體沉淀，用試劑盒提取基因組DNA后保存于-20°C。
[0031] 3、以4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶基因ubiA為目的基因，設(shè)計(jì)引物對(duì)如下：
[0032]Primer-F5,-ATATACTCGAGATGATCAAGTTCGAGCACAC3,（SEQIDNo:3)
[0033]Primer-R5'-GGCAACCATGGTCATATAAACATATCTCCTA3'（SEQIDNo:4)
[0034] 以基因組DNA為模板，用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段約為834bp。
[0035] 4、將載體pHN678轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后涂布于含氯霉素抗性的平板上，于 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（12-16h)。從轉(zhuǎn)化平板中挑取單菌落，液體培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取 試劑盒提取質(zhì)粒后保存于_20°C。
[0036] 5、分別將載體與目的片段用Ncol酶切后，在T4DNA連接酶作用下連接成干擾載體 pHNU〇
[0037] 6、獲得的干擾載體利用熱激法轉(zhuǎn)化納豆芽孢桿菌，利用30yg/mL氯霉素抗性篩 選轉(zhuǎn)化子。篩選到的一株轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上以備檢測(cè)。
[0038] 7、從斜面培養(yǎng)基上挑取菌落至40mLLB種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，于37°C恒溫培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)48h。
[0039] 8、將原納豆芽孢桿菌及種液分別按5%的接種量接入含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL 錐形瓶中，37°C下220r/min培養(yǎng)6天。培養(yǎng)過程中采用Bioscreen C MBR自動(dòng)微生物生長(zhǎng) 分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)菌株生長(zhǎng)狀況。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（w/v% )成分為：甘油6.96,鹿糖3. 45， K2HP044,蛋白胨2,酵母提取物2. 5, pH7. 3,500mL三角瓶裝液量為50mL，搖床轉(zhuǎn)速為150r/ min，37°C培養(yǎng)72h后菌體生物量能達(dá)到1. 9-3.6g/L。
[0040] 9、發(fā)酵結(jié)束后，HPLC檢測(cè)菌體中維生素K2含量比原始菌降低了 23%，采用SYBR GreenReal-TimeqPCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，測(cè)得該菌株ubiA表達(dá)水平降低了 41 %，menA表達(dá)水平比原始菌降低了 21-25 %，也可以采用反轉(zhuǎn)錄PCR定性的反映菌株ubiA 表達(dá)水平以及menA表達(dá)水平。
[0041] 實(shí)施例二
[0042]以納豆芽孢桿菌MH-1為出發(fā)菌株，依次按照下列步驟進(jìn)行操作：
[0043]1、將納豆芽孢桿菌培養(yǎng)在50mL LB培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)48h。
[0044] 2、收集培養(yǎng)液，離心后收集菌體沉淀，用試劑盒提取基因組DNA后保存于-20°C。
[0045]3、以4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶基因ubiA為目的基因，設(shè)計(jì)引物對(duì)如下：
[0046] Primer-F 5' -ATATA CTCGA GATGA TCAAG TTCGA GCACA C 3' (SEQ IDNo：3)
[0047]Primer-R5'-GGCAACCATGGTCATATAAACATATCTCCTA3'（SEQIDNo:4)
[0048]以基因組DNA為模板，用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段約為834bp。
[0049] 4、將載體pHN678轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后涂布于含氯霉素抗性的平板上，于 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（12-16h)。從轉(zhuǎn)化平板中挑取單菌落，液體培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取 試劑盒提取質(zhì)粒后保存于_20°C。
[0050] 5、分別將載體與目的片段用Ncol酶切后，在T4DNA連接酶作用下連接成干擾載體 pHNU〇
[0051] 6、獲得的干擾載體利用聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化納豆芽孢桿菌，利 用40yg/mL氯霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。篩選到的一株轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上以備檢測(cè)。
[0052] 7、從斜面培養(yǎng)基上挑取菌落至40mLLB種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，于37°C恒溫培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)48h。
[0053] 8、將原納豆芽孢桿菌及種液分別按5%的接種量接入含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL 錐形瓶中，37°C下220r/min培養(yǎng)6天。培養(yǎng)過程