一種制備漆酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地涉及利用一株虎皮香燕(Lentinus tigrinus)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅 藍(lán)蛋白屬銅藍(lán)氧化酶(blue copper oxidases)家族中的同一小族。漆酶按其來源可以分 為漆樹漆酶(rhus laccase)和真菌漆酶(fungal laccase)兩大類,植物漆酶與木質(zhì)素的 生物合成密切相關(guān),真菌漆酶具有多種生理生化功能,如形態(tài)發(fā)生,真菌與植物寄主相互作 用,應(yīng)激防御以及木質(zhì)素降解等。據(jù)統(tǒng)計(jì)漆酶的催化底物多達(dá)250多種,主要有酚類、芳胺、 羧酸、金屬有機(jī)化合物以及一些留類激素和生物色素。由于作用底物廣泛,漆酶在食品工 業(yè)、廢水處理、紙漿漂白、土壤凈化、染料脫色、有機(jī)合成、木材加工、免疫檢測等諸多領(lǐng)域有 廣泛應(yīng)用。
[0003] 己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了有多種產(chǎn)漆酶的側(cè)耳類真菌,如糙皮側(cè)耳、刺芹側(cè)耳、環(huán)柄側(cè)耳等, 但漆酶酶活普遍不高。發(fā)明專利申請(qǐng)CN200910083514. 7 "一種漆酶及其制備方法與 專用生產(chǎn)菌株",其生產(chǎn)菌株為血紅密孔菌,漆酶發(fā)酵酶活為300U/mL;發(fā)明專利申請(qǐng) CN101942421B"一種竹黃菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法",漆酶發(fā)酵酶活為500U/mL;發(fā)明專利申請(qǐng) CN200810198678.X"一種產(chǎn)漆酶的靈芝菌株",漆酶發(fā)酵酶活為8620U/mL,是目前酶活較高 的菌株。上述發(fā)明的菌種不屬于食用菌。
[0004] 虎皮香菇,屬傘菌目,側(cè)耳科,香菇屬,生于闊葉樹腐木上,易于進(jìn)行固體栽培和液 體深層發(fā)酵培養(yǎng),具有生長迅速,產(chǎn)物產(chǎn)量高,是一種食用真菌。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用食用菌制備漆酶的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0007] -種制備漆酶的方法,包括如下步驟:
[0008] (1)將接種虎皮香燕(Lentinustigrinus)保藏編號(hào):CGMCCNo.8301的斜面培養(yǎng) 基的固體菌種接種至液體種子培養(yǎng)基,在25~35°C,搖床150~200rpm,培養(yǎng)2~5天,制 備種子液;
[0009] (2)將種子液按體積比為2%~14%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,所述發(fā)酵培養(yǎng)基 是在500mL三角瓶中的裝液量為100~250mL,在25~35°C、搖床150~350rpm培養(yǎng)7~ 20天,得到虎皮香菇菌絲體發(fā)酵液;
[0010] (3)將菌絲體發(fā)酵液于lOOOOXg離心lOmin,取上清液即為漆酶粗酶液。
[0011]步驟(1)優(yōu)選為:將接種虎皮香燕(Lentinustigrinus)保藏編號(hào):CGMCC No. 8301的斜面培養(yǎng)基的固體菌種接種至液體種子培養(yǎng)基,在28~32°C,搖床150~ 200rpm,培養(yǎng)3~4天,制備種子液。
[0012]步驟(2)優(yōu)選為:將種子液按體積比為6%~14%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,所 述發(fā)酵培養(yǎng)基是在500mL三角瓶中的裝液量為150~200mL,在28~32°C,搖床150~ 200rpm,培養(yǎng)9~15天,得到虎皮香燕菌絲體發(fā)酵液。
[0013] 斜面培養(yǎng)基優(yōu)選為:葡萄糖5~40g/L,蛋白胨2. 5~20g/L,酵母粉0? 5~5g/L, 瓊脂10~20g/L,其余為花生殼浸出液;所述的花生殼浸出液的制備方法為:花生殼10~ 200g,水1L,煮沸30~60min,過濾,濾液即是花生殼浸出液。
[0014] 液體種子培養(yǎng)基為:玉米粉10~50g/L、豆柏粉5~35g/L、a-淀粉酶20~80U/ L、KH2P040. 5 ~6g/L、MgS04 ? 7H200. 2 ~5g/L,其余為水,pH自然,0?IMPa滅菌 25min。
[0015] 液體種子培養(yǎng)基較好的是:玉米粉25~35g/L、豆柏粉10~20g/L、a-淀粉酶 30 ~65U/L、KH2P042 ~4g/L、MgS04 *7H201 ~2g/L,其余為水,pH自然,0?IMPa滅菌 25min。
[0016] 發(fā)酵培養(yǎng)基為:碳源20~100g/L,氮源5~60g/L,KH2P041~5g/L, MgS04 ? 7H200. 25 ~3g/L,CuS04 ? 5H200. 5 ~2mmol/L,其余為水。
[0017] 碳源選自以下一種或幾種:葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糊精、麥芽糖或玉米粉。
[0018] 氮源選自以下一種或幾種:酵母浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、低溫黃豆餅粉、磷酸二氫 銨或硫酸銨。
[0019] 最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為:果糖48g/L,玉米粉12g/L,胰蛋白胨9g/L,磷酸二氫銨lg/ L,KH2P042g/L,MgS04 ? 7H200. 25g/L,CuS04 ? 5H201mmol/L,其余為水。
[0020] 本發(fā)明利用一種食用菌虎皮香燕(Lentinustigrinus)保藏編號(hào):CGMCC No. 8301,通過液體深層發(fā)酵高產(chǎn)食品級(jí)的漆酶。本發(fā)明虎皮香菇發(fā)酵液中漆酶的酶活高, 發(fā)酵液中漆酶酶活最高可達(dá)462. 59U/mL。且漆酶反應(yīng)的適應(yīng)條件較廣,在溫度40~60°C 范圍內(nèi)活性穩(wěn)定,在40°C時(shí)酶活最高,最適pH為4. 4~4. 8,酶活均在90%以上,最適pH為 4. 6。
【附圖說明】
[0021] 圖1為虎皮香菇平板培養(yǎng)照片。
[0022] 圖2為虎皮香菇菌絲體照片。
[0023] 圖3為純化后的漆酶電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明,但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
[0025] 試驗(yàn)中所用的主要試劑和儀器如下:玉米粉--梅河口市興達(dá)米業(yè)有限責(zé)任公 司;低溫黃豆餅粉--山東萬得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;淀粉酶--北京索萊寶科技有 限公司;果糖--河北華旭制藥有限責(zé)任公司;胰蛋白胨--北京雙旋微生物培養(yǎng)基制 品廠;2, 2'-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鈉)(ABTS)--SIGMA公司;紫外 可見分光光度計(jì)--TU-1810型,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;低溫恒溫循環(huán)器-- ILB-008-01型,施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司。
[0026] 本發(fā)明所用食用菌虎皮香菇(Lentinustigrinus)于2013年10月9日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào), 中國科學(xué)院微生物研究所,并已存活,建議的分類命名為虎皮香燕(Lentinustigrinus), 保藏編號(hào)CGMCCNo. 8301,虎皮香菇平板培養(yǎng)照片見圖1,虎皮香菇菌絲體照片見圖2。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 斜面培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉2g/L,瓊脂15g/L,其余為花生殼 浸出液;所述的花生殼浸出液的制備方法為:花生殼l〇〇g,水1L,煮沸45min,過濾,濾液即 是花生殼浸出液。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 斜面培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L,蛋白胨20g/L,酵母粉3g/L,瓊脂15g/L,其余為花生殼 浸出液;所述的花生殼浸出液的制備方法為:花生殼l〇g,水1L,煮沸60min,過濾,濾液即是 花生殼浸出液。
[0031] 實(shí)施例3
[0032] 斜面培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L,蛋白胨2. 5g/L,酵母粉5g/L,瓊脂15g/L,其余為花生 殼浸出液;所述的花生殼浸出液的制備方法為:花生殼l〇〇g,水1L,煮沸50min,過濾,濾液 即是花生殼浸出液。
[0033] 實(shí)施例4
[0034] 斜面培養(yǎng)基:葡萄糖25g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉0. 5g/L,瓊脂20g/L,其余為花生 殼浸出液;所述的花生殼浸出液的制備方法為:花生殼150g,水1L,煮沸40min,過濾,濾液 即是花生殼浸出液。
[0035] 實(shí)施例5
[0036] 斜面培養(yǎng)基:葡萄糖40g/L,蛋白胨15g/L,酵母粉2g/L,瓊脂10g/L,其余為花生殼 浸出液;所述的花生殼浸出液的制備方法為:花生殼200g,水1L,煮沸30min,過濾,濾液即 是花生殼浸出液。
[0037] 實(shí)施例6
[0038] 液體種子培養(yǎng)基:玉米粉30g/L、豆柏粉15g/L、a-淀粉酶45U/L、KH2P043g/L、 MgS04 ? 7H201. 5g/L,其余為水,pH自然,0?IMPa滅菌 25min。
[0039] 實(shí)施例7
[0040] 液體種子培養(yǎng)基:玉米粉25g/L、豆柏粉20g/L、a-淀粉酶30U/L、KH2P044g/L、MgS04 ? 7H201g/L,其余為水,pH自然,0?IMPa滅菌 25min。
[0041] 實(shí)施例8
[0042] 液體種子培養(yǎng)基:玉米粉35g/L、豆柏粉10g/L、a-淀粉酶65U/L、KH2P042g/L、 MgS04 ? 7H202g/L,其余為水,pH自然,0?IMPa滅菌 25min。
[0043] 實(shí)施例9
[0044] 液體種子培養(yǎng)基:玉米粉10g/L、豆柏粉35g/L、a-淀粉酶20U/L、KH2P046g/L、 MgS04 ? 7H200. 2g/L,其余為水,pH自然,0?IMPa滅菌 25min。
[0045] 實(shí)施例10
[0046] 液體種子培養(yǎng)基:玉米粉50g/L、豆柏粉5g/L、a-淀粉酶80U/L、KH2P040. 5g/L、 MgS04 ? 7H205g/L,其余為水,pH自然,0?IMPa滅菌 25min。
[0047] 實(shí)施例11
[0048] 發(fā)酵培養(yǎng)基:果糖48g/L,玉米粉12g/L,胰蛋白胨9g/L,磷酸二氫銨lg/L, KH2P042g/L,MgS04 ? 7H200. 25g/L,CuS04 ? 5H201mmol/L,其余為水。
[0049] 實(shí)施例12
[0050] 發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖60g/L,蛋白胨8g/