羰基還原酶基因、酶、載體、工程菌及其在不對(duì)稱(chēng)還原前手性羰基化合物中的應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】嚴(yán)基還原酶基因、酶、載體、工程菌及其在不對(duì)稱(chēng)還原前手 性嚴(yán)基化合物中的應(yīng)用 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)源于唐營(yíng)蒲伯克霍爾德氏菌 炬urldiolderia gladioli)ZJB-12126的撰基還原酶、基因、含有該基因的重組載體、該重組 載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌W及在催化不對(duì)稱(chēng)還原前手性撰基化合物制備手性醇中 的應(yīng)用。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 撰基還原酶（Carbonyl reducatase, E. C. 1. 1. 1. X)屬于氧化還原酶系，是一類(lèi)能 夠催化醇和酵/麗之間雙向可逆氧化還原反應(yīng)的酶類(lèi)，并且需要輔酶NAD (H)(煙醜胺腺嘿 嶺二核巧酸）或NADP(H)(煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸磯酸）作為氨傳遞體。NADH和NADPH 作為電子供體參與其還原反應(yīng)，NA擴(kuò)和NADP+則作為電子受體參與其氧化反應(yīng)。目前根 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的撰基還原酶一般屬于短鏈脫氨酶超家族（Skxrt-chain dehy化ogenase/ reductase, SDR)、中鏈脫氨酶超家族（Medium-chain dehy化ogenase/reductase, MDR)、 酵麗還原酶超家族（Aldo-keto reductase, AKR)等。雖然H者具有相似的催化功能， 但在進(jìn)化和結(jié)構(gòu)上差異較大。撰基還原酶是一類(lèi)非常古老的家族，廣泛分布于自然界 中，在各類(lèi)動(dòng)物、微生物和植物中，由于微生物種類(lèi)繁多、分布廣，是撰基還原酶的主要來(lái) 源，女口：Pichia finlandica、Clostridium ljungdahlii、Vibrio vulnificus、Candida glabrata、Serratia quinivorans>Polygonum minus>Arabidopsis thaliana、Oenococcus oeni、 Serratia marcescens、 Chryseobacterium sp. 、 Rhodococcus erythropolis、 Candida magnoliae、Lactobacillus jensenii 和 Lactobacillus coryniformis 等。此 夕F，極端微生物中也存在嗜極端環(huán)境的撰基還原酶，如來(lái)源于化ermococ州s sibiricus、 Thermococcus guaymasensis、Haloferax volcanii、Thermus thermophilus、Sulfolobus acidocaldarius> Carboxydothermus hydrogenoformans> Thermococcus kodakarensis> Thermotoga maritime、 Koliella Antarctica、 Pyrobaculum calidifontis 和 化lobacterium sp.等極端微生物的撰基還原酶。
[0003] 近年來(lái)，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，基因組和基因序列 數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的基因數(shù)據(jù)的迅速增長(zhǎng)，從大量的數(shù)據(jù)資源中尋找新型的撰基還原酶基因、 挖掘其蘊(yùn)含的生物學(xué)信息，為新型高效生物催化劑的開(kāi)發(fā)服務(wù)已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)?；蛲诰?技術(shù)是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型酶篩選技術(shù)，目前已得到廣泛地應(yīng)用，通過(guò)此技術(shù) 已克隆獲得了大量的撰基還原酶，如Pichia finlandica 0DH、Clostridium ljungd址lii BDHl、Candida glabrata KRl、Serratia quinivorans SDR、Polygonum minus ADH、 Arabidopsis thaliana ADH、Oenococcus oeni Adh3、Chryseobacterium sp. KRED20、 Candida ma即oliae CRW及Acetobacter sp. CR等。其中部分撰基還原酶的基因已在不同 的宿主，女口 Escherichia coli、Pichia pastoris、Arxula adeninivorans 等中表達(dá)，獲得 產(chǎn)酶活力和選擇性較高的基因工程菌，并成功應(yīng)用于催化前手性撰基類(lèi)化合物的不對(duì)稱(chēng)還 原反應(yīng)。盡管如此，許多撰基還原酶催化的底物譜較窄，往往是為特定反應(yīng)篩選的最適生物 催化劑，因此大大限制了其應(yīng)用范圍。此外，許多酶的催化效率較低，也限制了其工業(yè)化應(yīng) 用。篩選具有較寬底物譜的新型撰基還原酶，研究其可W高效高選擇性催化的撰基化合物， 不僅可W拓寬其應(yīng)用范圍，提升其應(yīng)用潛力，也為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0004] 手性醇是一類(lèi)手性碳上連有羥基的旋光性化合物，廣泛應(yīng)用于手性藥物和其他手 性精細(xì)化學(xué)品的合成。目前手性醇的合成方法包括物理分離法、拆分法W及不對(duì)稱(chēng)還原法。 其中，利用前手性撰基化合物的不對(duì)稱(chēng)還原合成手性醇的方法是目前生產(chǎn)手性醇的一種重 要方法，其理論產(chǎn)率達(dá)100 %?；瘜W(xué)不對(duì)稱(chēng)還原法主要是利用手性金屬配合物作為催化劑用 于撰基的不對(duì)稱(chēng)還原，盡管該化學(xué)方法已部分用于工業(yè)生產(chǎn)，但是該反應(yīng)過(guò)程需要高壓加 氨、手性金屬配合物合成復(fù)雜并且價(jià)格昂貴，產(chǎn)物中存在重金屬的殘留導(dǎo)致產(chǎn)物分離困難， 環(huán)境污染較大，因此其應(yīng)用受到了一定的限制。生物催化不對(duì)稱(chēng)還原法不僅具有高度的化 學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，并且反應(yīng)條件溫和，避免了產(chǎn)物中的重金屬殘留，對(duì)環(huán)境友好，彌補(bǔ) 了化學(xué)方法的不足，因此，近年來(lái)生物催化的撰基不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)在手性醇合成中的應(yīng)用 越來(lái)越受到重視。
[0005] (2S，3時(shí)-2-苯甲醜氨甲基-3-羥基下酸醋是合成碳青霉帰和青霉帰類(lèi)藥物中 間體4-己醜氧基氮雜環(huán)下麗（4-AA)的手性碩塊。目前獲得（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲 基-3-羥基下酸醋中間體的主要途徑是W手性催化劑（時(shí)-BINAP-Ru或錯(cuò)配合物不對(duì)稱(chēng)催 化2-苯甲醜氨甲基-3-麗下酸醋生成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羥基下酸醋。但由于 該反應(yīng)條件苛刻、金屬釘配合物的價(jià)格比較昂貴并且與產(chǎn)物的分離較為困難等，不利于其 工業(yè)化應(yīng)用。目前生物催化法合成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羥基下酸醋報(bào)道較少。 Saccharomycopsis malanga NBRC 171096催化生成（2S, 3R)構(gòu)型，并具有較商的對(duì)映選擇 性（對(duì)映體過(guò)量值ee〉96. 2%)，但是催化效率低（產(chǎn)率僅4%)。美國(guó)專(zhuān)利US20130034895 研究了來(lái)源于Lactobacillus kefir的撰基還原酶催化合成（2S, 3R)-2-苯甲醜氨甲 基-3-羥基下酸醋，具有較高的對(duì)映選擇性（ee為60-99% )，但在該反應(yīng)過(guò)程中，W異丙醇 作為第二底物實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)利用，由于異丙醇與底物存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，導(dǎo)致最大轉(zhuǎn)化 率受到影響，并且副產(chǎn)物丙麗的生成難W除去并對(duì)酶有一定的損害作用。
[0006] (S)-4-氯-3-羥基下酸己醋和6-氯基-(3R，5R)-二羥基己酸叔下醋是HMG-CoA 酶抑制劑阿巧伐他汀類(lèi)藥物的側(cè)鏈?zhǔn)中灾虚g體，可W通過(guò)化學(xué)合成和生物催化合成的方法 獲得。（S)-4-氯-3-羥基下酸己醋的化學(xué)法合成中也需要使用手性金屬催化劑，生產(chǎn)成本 高；而在6-氯基-(3R，5R)-二羥基己酸叔下醋的化學(xué)法合成中則需要使用易燃易爆的正 下基裡、測(cè)焼，并且需要在<-65 C低溫條件下進(jìn)行，能耗大，再加6-氯基-(3R，5R)-二羥基 己酸叔下醋非對(duì)映誘導(dǎo)不充分，產(chǎn)物的光學(xué)純度難W達(dá)到要求。近年來(lái)，利用酶法代替化學(xué) 法改善反應(yīng)條件，降低反應(yīng)成本，提高產(chǎn)物的選擇性成為關(guān)注的重點(diǎn)。生物法不對(duì)稱(chēng)還原 合成（S)-4-氯-3-羥基下酸己醋的報(bào)道較多，涉及到的酶也較多，具有較高的選擇性和活 性的菌株有：Geotrichum candidum、Pichia stipitis、Candida albicans、Streptomyces coelicolor、Candida parapsilosis ATCC 7330 W及 Steptomyces coelicolor 等。Wang 等研究了 Str巧tomyces coelicolor中的撰基還原酶催化該反應(yīng)，同時(shí)將異丙醇作為輔助 底物形成輔酶循環(huán)體系，并且利用水/甲苯兩相催化體系，最終將底物濃度提高到3. 6M， 2化內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)率達(dá)93%, ee〉99%。You等利用Candida parapsilosis SCR2催化該 反應(yīng)，底物濃度IM時(shí)，轉(zhuǎn)化化后，產(chǎn)率提高到95. 3%，ee為99%?；壤没蛲诰蚣?術(shù)得到了兩種新的還原酶，不對(duì)稱(chēng)還原4-氯己醜己醜己醋生成（S)-4-氯-3-羥基下酸己 醋，底物濃度為3M，產(chǎn)率提高到99%，選擇性也有了進(jìn)一步的提高（ee〉99. 9% )，為實(shí)現(xiàn)工 業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。此外，Codexis公司專(zhuān)利US7807423B2也公開(kāi)了一系列麗還原酶，催 化生產(chǎn)（S)-4-氯-3-羥基下酸己醋，ee〉99%。6-氯基-(3R，5R)-二羥基己酸叔下醋是阿 巧伐他汀的另一種手性中間體，目前高立體選擇性催化（時(shí)-6-氯基-5-羥基-3-撰基己酸 叔了醋生成6-氯基-(3R, 5R)-二羥基己酸叔了醋的菌株有；Saccharomyces cerevisiae、 Pichia angusta> Pichia haplophila> Beauveria bassiana> Pichia pastoris> Pichia membranefaciens、Candida humicola、Kluyveromyces drosophilarum、Rhodotorula glutinis 和 Pichia caribbic 等。Codexis 公司專(zhuān)利 US7879585B2 從 Saccharomyces cerevisiae中克隆了一種麗還原酶并進(jìn)行了改造，催化生產(chǎn)6-氯基-(3R, 5R)-二羥基己酸 叔下醋轉(zhuǎn)化率為99. 7%，de〉99%。
[0007] 依澤替米貝（Ezctimibc，Ezclr〇r )，化學(xué)名l-(4-氣苯基）-(3時(shí)-巧-(4-氣苯 基）-(3巧-羥基丙基]-(4巧-(4-羥基苯基）-2-丙內(nèi)醜胺，是一類(lèi)新型的選擇性膽固醇吸 收抑制劑，由Merk公司研制，2002年首先在德國(guó)上市。該藥物能與腸道中的膽固醇吸收 轉(zhuǎn)運(yùn)載體NPC1L1結(jié)合，從而有效降低密度脂蛋白膽固醇（LDkC)的含量，選擇性抑制食物 W及膽汁中的膽固醇在小腸的吸收。化合物（4巧-3-[巧巧-5-(4-氣苯基）-5-羥基戊醜 基]-4-苯基-1，3-氧氮雜環(huán)戊焼-2