專利名稱：利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法。
背景技術(shù)：
在傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物克隆中，首先利用限制性內(nèi)切酶對DNA片段進行消化產(chǎn)生粘性末端或平末端，然后使用DNA連接酶完成連接。這種方法不僅受到插入片段和載體酶切位點的限制，并且在大規(guī)模的基因克隆中消耗時間，效率相對較低?；赥4DNA聚合酶的LIC系統(tǒng)作為一種高效的方法被應(yīng)用于大規(guī)模的基因克隆及載體構(gòu)建。該方法利用T4DNA聚合酶的3’ -5’外切酶活性，使載體和克隆片段末端產(chǎn)生5’ 末端突出的單鏈粘性末端。該方法在設(shè)計PCR擴增引物時需添加特定長度15nt)的與載體末端同源的序列作為重組區(qū)段，這段序列要求不含某個特定堿基，通過在反應(yīng)體系中加入相應(yīng)缺失的dNTP以使T4DNA聚合酶在遇到重組序列以外的該堿基時終止反應(yīng)，從而產(chǎn)生具有特定長度的5’末端突出單鏈。該反應(yīng)產(chǎn)物在退火條件下而不需要連接酶的作用即可通過5’突出的粘性末端發(fā)生較為穩(wěn)定的配對復(fù)性，并借助于宿主大腸桿菌內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)重新環(huán)化成新的質(zhì)粒。該方法的連接原理要求必須使用特定的商業(yè)化線性載體或通過 PCR的方法擴增獲得末端重組區(qū)段不含某個特定堿基的線性化載體。另外，如果這段粘性末端在編碼區(qū)內(nèi)，就會在重組蛋白的氮端出現(xiàn)多余的肽段，這些都在一定程度上限制了該方法的廣泛應(yīng)用。其它利用核酸外切酶III進行克隆的方法需要對載體和PCR片段分別消化，然后利用酚/氯仿抽提的方法終止反應(yīng)并對載體及PCR產(chǎn)物分別純化，方法操作繁瑣，應(yīng)用性不強，因此未得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用核酸外切酶的3’_5’外切酶活性克隆目的DNA的新方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用核酸外切酶的3’ -5’外切酶活性克隆目的DNA的方法，其是通過向含有線性載體和目的DNA片段的體系中加入具有3’ -5’外切酶活性的核酸外切酶，在冰上消化30seC 3min，優(yōu)選消化30seC，使兩者產(chǎn)生具有同源序列的5’末端，然后在70 75 °C下使酶失活，最后退火使線性載體和目的DNA片段重組形成帶有缺刻的環(huán)形質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，質(zhì)粒被修復(fù)成完整的質(zhì)粒，并隨宿主基因組進行復(fù)制。前述方法中，目的DNA片段的兩端帶有與線性載體兩端同源的10 35個堿基，優(yōu)選為15個堿基。前述方法中，退火溫度為(重組區(qū)段Tm值-5) °C。前述方法中，具有3’ -5’外切酶活性的核酸外切酶為核酸外切酶III、T4DNA聚合
3酶、Klenow片段、T7DNA聚合酶等。在用核酸外切酶III進行消化時，所使用的線性化載體一定具有經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的平端或5’突出末端。 前述方法中，線性載體和目的DNA片段以5 1 1 5，優(yōu)選2 1的摩爾比混
口 O 前述方法中，加入的核酸外切酶的酶量為5 15個單位/10 μ L反應(yīng)體系，優(yōu)選10 個單位/10 μ L反應(yīng)體系。本發(fā)明的目的還可以采用以下的技術(shù)措施來進一步實現(xiàn)。首先采用帶有15個同源堿基的引物PCR擴增所需目的DNA片段，并用內(nèi)切酶使載體線性化，所產(chǎn)生的線性化載體兩端與目的DNA片段兩端的15個堿基同源。吸取150ng PCR 產(chǎn)物與線性化載體以2 1的摩爾比混合，冰上加入1 μ 1的IOX緩沖液及1 μ 1稀釋后為 10個單位的核酸外切酶III。利用核酸外切酶III將制備好的PCR產(chǎn)物及線性化載體在冰上消化30秒到3分鐘，從而使載體及片段均產(chǎn)生5’末端突出的單鏈序列。設(shè)置PCR程序為70°C 20分鐘，42°C 10分鐘，待PCR儀升溫至70°C后，將消化結(jié)束的反應(yīng)體系置于PCR儀中加熱，使酶熱失活從而終止消化反應(yīng)。于42°C退火，載體與片段重新環(huán)化成不完整的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia后，質(zhì)粒被修復(fù)成完整的質(zhì)粒，并隨宿主基因組進行復(fù)制。技術(shù)路線如圖1所示。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果(一 )本發(fā)明通過控制冰上消化時間來控制5’末端突出單鏈的長度，不用考慮在載體末端添加額外的缺失某個特定堿基的重組序列，重組后利用細菌的修復(fù)機制重新形成完整質(zhì)粒。( 二)與常規(guī)PCR方法相比，由于在引物兩端添加的是載體上的同源序列，這不僅不會影響到PCR效率，反而解決了其它LIC系統(tǒng)編碼多余蛋白，受商業(yè)化特定載體限制等問題，因此本發(fā)明適用于將PCR片段克隆到任何可以通過的酶切或PCR線性化的載體，不需要帶有特定接頭的商業(yè)化載體或通過PCR擴增載體。(三)本發(fā)明通過使酶熱失活而終止消化反應(yīng)，操作簡單易行，同時也繼承了其它 LIC系統(tǒng)陽性率高的優(yōu)勢，因此適用于大規(guī)模的基因克隆及載體構(gòu)建。(四)現(xiàn)有技術(shù)中由于酶的價格，或由于使用商業(yè)化載體使反應(yīng)成本增加，而本發(fā)明僅需要價格低廉的核酸外切酶III，成本遠遠低于in fusion等其它ligase-free技術(shù)， 因此具有獨特的價格優(yōu)勢。


圖1為本發(fā)明利用核酸外切酶III克隆目的DNA片段的技術(shù)路線圖。圖2顯示了目的DNA片段與載體的摩爾比與轉(zhuǎn)化效率及陽性率的關(guān)系。圖3顯示了目的DNA片段濃度與轉(zhuǎn)化效率及陽性率的關(guān)系。圖4顯示了冰上孵育時間與轉(zhuǎn)化效率及陽性率的關(guān)系。圖5為不同熱失活方式下轉(zhuǎn)化效率及陽性率的比較，其中，0:體系放到PCR儀后任其緩慢加熱至70°C ；70 待PCR儀升溫值70°C后，再將體系放到PCR儀上加熱。圖6顯示了退火溫度與轉(zhuǎn)化效率及陽性率的關(guān)系。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1利用核酸外切酶III克隆目的DNA片段的方法設(shè)計并合成擴增目的片段GUS基因所需引物，并分別在兩條引物的5’端添加與載體PUC19線性化位點同源的15個堿基。引物序列分別為⑶S-F 5' -CGGTACCCGGGGATCTT TCGATGCGGTCACTCA-3‘；GUS-R 5' -CGACTCTAGAGGATCCACTTGCGGACGGGTATC-3‘。PCR擴增所需聚合酶為Takara公司的PrimeSTAR HS DNAPolymerase,反應(yīng)程序為熱啟動98°C 10秒，57°C 5秒，72°C 1分鐘，30個循環(huán)后72°C延伸10分鐘，最后25°C反應(yīng)結(jié)束。PCR結(jié)束后，用Axygen公司的凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。載體線性化可以通過PCR擴增，也可以利用常規(guī)酶切。PCR擴增的兩條引物分別為PUC19-F 5‘ -GATCCTCTAGAGTCGACCTGCA-3‘ ；PUC19-R 5' GATCCCCGGGTACCGAGC-3‘。 反應(yīng)程序同上，延伸時間為3分鐘。限制性內(nèi)切酶FastDigest BamH I購自！^ermentas公司，反應(yīng)體系為5μ1 IOX緩沖液，2 μ 1 BamH I，質(zhì)粒2 μ g，補水到50 μ 1。PCR上37°C反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用Axygen公司的凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物。吸取150ng目的DNA片段并按照摩爾比為2 1的比例與線性化載體混合后，冰上加入1 μ 1的IOX緩沖液及1 μ 1用水稀釋10倍的核酸外切酶III (10個單位)。經(jīng)冰上孵育、70°C滅活、下調(diào)溫度退火后，吸取2μ 1反應(yīng)體系直接用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化后，吸取50 μ 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計克隆的個數(shù)，并隨機挑取48個克隆通過PCR方法鑒定陽性克隆率(表1)。核酸外切酶III及大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞分別購自NEB (北京)有限公司和北京全式金生物技術(shù)有限公司。擴增后⑶S片段序列和載體PUC19的核苷酸序列分別如kq IDNo. 1和2所示。實施例2利用T4DNA聚合酶克隆目的DNA片段的方法目的片段⑶S基因、線性化載體PUC19的制備同實施例1。吸取150ng目的DNA 片段并按照摩爾比為2 1的比例與線性化載體混合后，加入1 μ 1的IOX緩沖液及1 μ 1 用水稀釋10倍的T4DNA聚合酶(0. 3個單位)。PCR程序設(shè)置為22°C 30分鐘，70°C分鐘， 42°C10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后，吸取50 μ 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計克隆的個數(shù)，并隨機挑取 48個克隆通過PCR方法鑒定陽性克隆率(表1)。T4DNA聚合酶購自NEB (北京)有限公司。表1核酸外切酶III和T4DNA聚合酶的克隆結(jié)果
核酸外切酶獲得的克隆子總數(shù)重組克隆比例
exoIID104448/48T499546/48由表1可見，由于核酸外切酶III和T4DNA聚合酶都具有3’_5’外切酶活性，因此可采用相似的方法進行目的DNA片段的克隆。但以上結(jié)果表明，利用核酸外切酶III的方法較T4DNA聚合酶具有略高的轉(zhuǎn)化效率和正確率。實施例3目的DNA片段與載體的最佳摩爾比
5
通過保持載體濃度、改變PCR片段的濃度，調(diào)整反應(yīng)體系中PCR片段與載體摩爾數(shù)的比值。結(jié)果如圖2所示。隨著片段與載體摩爾比的降低，總的克隆數(shù)逐漸上升，并在比值為2 1時達到最大值。當片段與載體的摩爾比在1 1時，總的克隆數(shù)依然保持較高值， 而當片段濃度低于載體時，總克隆數(shù)出現(xiàn)了較大幅度的下降，并隨著摩爾比的減低呈急劇下降的趨勢。陽性克隆率一直保持較高水平。說明在片段的摩爾數(shù)等于或大于載體的摩爾數(shù)時，克隆效率較高，并當PCR片段與載體的摩爾數(shù)比等于2 1時，效率最高。實施例4目的DNA片段與載體的最佳濃度在保持片段與載體摩爾比為2 1的條件下，設(shè)置7個PCR片段濃度(圖3)。隨著片段濃度的增加，總的克隆數(shù)首先呈現(xiàn)出直線上升的趨勢，當反應(yīng)體系中片段濃度達到 50ng時即有較高的克隆數(shù)，并在150ng時總克隆數(shù)達到最大值，此時陽性克隆比率也到達到最高，說明該濃度為反應(yīng)的最佳濃度。當體系中PCR片段濃度大于150ng時，總的克隆數(shù)則表現(xiàn)出下降的趨勢，這可能是因為DNA片段過多而反應(yīng)體系小，或DNA片段過多而外切酶切割不充分造成的。實施例5目的DNA片段與載體的最佳濃度保證PCR產(chǎn)物濃度為150ng、片段與載體摩爾比為2 1條件下，改變冰上孵育的時間長度。隨著冰上孵育時間的增加，總的克隆數(shù)表現(xiàn)出了逐漸下降的趨勢，孵育時間越長，下降的幅度則越大。當孵育時長為30秒時，克隆數(shù)最多，轉(zhuǎn)化效率為最高(圖4)。但考慮到操作時間問題，在實際的操作中，冰上孵育時間至多不應(yīng)超過3分鐘。另外，冰上孵育的過程中，應(yīng)將PCR儀預(yù)先升溫至70°C。孵育結(jié)束后立即將反應(yīng)體系放在70°C的PCR儀上加熱20分鐘，使酶失去活性。如果將反應(yīng)體系放到PCR儀后升溫， 則會嚴重影響DNA片段的連接效率，如圖5所示。這可能因為核酸外切酶III在溫度逐漸上升至滅火溫度的過程中，對DNA片段過度切割造成的。實施例6最佳退火溫度70°C滅活20分鐘后，將PCR儀溫度下調(diào)進行退火。圖6的結(jié)果表明，在設(shè)置的6 個不同梯度的退火溫度中，以42°C時總的克隆數(shù)最多，說明此時為最佳的退火溫度。較低的退火溫度并未對總的克隆數(shù)及陽性克隆率造成明顯影響，相反，當退火溫度高于42°C時，總的克隆數(shù)隨著溫度的上升而逐漸下降，說明過高的溫度不利于PCR片段與載體重組。因此， 在設(shè)置退火溫度時應(yīng)避免溫度過高而導(dǎo)致效率的降低。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用核酸外切酶的3’ -5’外切酶活性克隆目的DNA的方法，其特征在于，向含有線性載體和目的DNA片段的體系中加入具有3’ -5’外切酶活性的核酸外切酶，在冰上消化30sec 3min，使兩者產(chǎn)生具有同源序列的5’末端，然后在70 75°C下使酶失活，最后退火使線性載體和目的DNA片段重組形成帶有缺刻的環(huán)形質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中修復(fù)缺刻并隨宿主基因組進行復(fù)制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，目的DNA片段的兩端帶有與線性載體兩端同源的10 35個堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，目的DNA片段的兩端帶有與線性載體兩端同源的15個堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，退火溫度為(重組區(qū)段Tm 值-5) V。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，具有3’-5’外切酶活性的核酸外切酶為核酸外切酶III、T4DNA聚合酶、Klenow片段、T7DNA聚合酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，冰上消化時間為30seC。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，線性載體和目的DNA片段以 5 1 1 5的摩爾比混合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，線性載體和目的DNA片段以2 1的摩爾比混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，加入的核酸外切酶的酶量為5 15個單位/10 μ L反應(yīng)體系。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，加入的核酸外切酶的酶量為10個單位 /10 μ L反應(yīng)體系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法，其是向含有線性載體和目的DNA片段的體系中加入具有3’-5’外切酶活性的核酸外切酶，在冰上消化30sec～3min，使兩者產(chǎn)生具有同源序列的5’末端，然后在70～75℃下使酶失活，最后退火使線性載體和目的DNA片段重組形成帶有缺刻的環(huán)形質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中修復(fù)缺刻并隨宿主基因組進行復(fù)制。本發(fā)明通過使酶熱失活而終止消化反應(yīng)，操作簡單易行，同時也繼承了其它LIC系統(tǒng)陽性率高的優(yōu)勢，因此適用于大規(guī)模的基因克隆及載體構(gòu)建。
文檔編號C12R1/19GK102443596SQ201110393988
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月1日
發(fā)明者劉斌, 李宏宇, 林辰濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所