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Dna聚合酶及其編碼基因與應(yīng)用

文檔序號(hào):9702991閱讀:899來(lái)源:國(guó)知局
Dna聚合酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種DNA聚合酶及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA聚合酶是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA為復(fù)制模板,將DNA由 5'端點(diǎn)開始復(fù)制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具備模板、引物、 dNTP等的情況下)及其相輔的活性。
[0003] 耐熱DNA聚合酶多應(yīng)用在PCR技術(shù)中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活 性,但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除錯(cuò)配,切平末端; 5 ' _3 '外切酶活性可以消除合成障礙。
[0004] 超嗜熱古菌PalaecoccuspacificusDY20341分離自東太平洋洋中脊熱液區(qū),其 基因組測(cè)序已經(jīng)完成。預(yù)測(cè)一共有2001個(gè)開放閱讀框,其中78.11%沒(méi)有確定的生物學(xué)功 能。
[0005] 盡管商業(yè)化的DNA聚合酶多種多樣,針對(duì)不同擴(kuò)增目的片段所需的特異DNA聚合酶 體系仍然是必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種DNA聚合酶。
[0007] 本發(fā)明所提供的DNA聚合酶,其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼DNA聚合酶的基因,其核苷酸序列如序列表 中序列3所示。
[0009] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種重組表達(dá)載體,其多克隆位點(diǎn)上插入有所述的編 碼DNA聚合酶的基因。
[0010] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種重組菌,其含有所述的重組表達(dá)載體。
[0011] 其中,所述重組菌為大腸桿菌。
[0012] 所述的DNA聚合酶可在PCR中應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種獲得目的基因的方法,所述方法包括如下步驟:
[0014] 根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)引物,
[0015]以含有目的基因的DNA片段或基因組DNA為模板,利用所設(shè)計(jì)的引物和所述的DNA聚合酶進(jìn)行PCR,
[0016] 分離PCR產(chǎn)物獲得目的基因。
[0017] 其中,卩〇?的緩沖液包括1^8(口!18.8)2〇111]\1,]\^5〇42111]\1,1((:11〇111]\1,(順4)23〇41〇111]\1, TritonX-100 0.5mg/L,dNTP0.2mM。
[0018] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種PCR反應(yīng)試劑盒,所述試劑盒包括所述的DNA聚合 酶。
[0019] 其中,所述試劑盒還包括PCR的緩沖液,所述PCR的緩沖液包括Tris(pH8 · 8)20mM, MgS〇42mM,KCl 10mM,(NH4)2S04l0mM,TritonX-100 0.5mg/L,dNTP 0.2mM。
[0020] 本發(fā)明的DNA聚合酶,來(lái)自超噬熱廣古菌PalaeococcuspacificusDY20341,具有 DNA聚合酶活性。利用本發(fā)明的DNA聚合酶,成功擴(kuò)增出了古菌Thermococcussp.4557的大 小不同的基因。此外,使用本發(fā)明的DNA聚合酶成功擴(kuò)增出了商業(yè)化的PfuDNA聚合酶所不 能擴(kuò)增的Thermococcussp· 4557的GQS-01815基因。
【附圖說(shuō)明】
[0021 ] 圖1顯示PalaeococcuspacificusDNA聚合酶編碼基因片段敲除示意圖。
[0022] 圖2顯不PalaeococcuspacificusDNA聚合酶基因的克??;
[0023] 其中,M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),1:Ρο1Β-片段1,2:Ρο1Β-片段2,3:PolB基因。
[0024] 圖3顯示SDS-PAGE電泳分析PolB聚合酶純化后的蛋白;
[0025] 其中,M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),l:PolBDNA聚合酶。
[0026] 圖4顯示了利用PolB聚合酶PCR擴(kuò)增出不同的DNA片段。
[0027]圖5顯示了PCR擴(kuò)增Thermococcussp.4557中GQS_01815基因的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 1.獲取目的基因(PolB基因)
[0030] PalaeococcuspacificusDY20341 基因組序列如GenBankAssembly:GCA_ 000725425.1所示。根據(jù)生物信息學(xué)方面的基因組和蛋白組分析,獲得假定的Palaeococcus pacificusDY20341耐熱DNA聚合酶(PolB)序列,如序列表中序列1所示。然而,體外無(wú)法獲 得可溶性的耐熱DNA聚合酶。針對(duì)編碼假定的PalaeococcuspacificusDY20341耐熱DNA聚 合酶的DNA序列(如序列2所示)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該序列可能包含內(nèi)含子。
[0031 ] 因此,針對(duì)編碼假定的PalaeococcuspacificusDY20341耐熱DNA聚合酶的DNA序 列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)缺失突變的方法(如圖1)將內(nèi)含子敲除。
[0032]引物序列如下:
[0033] FI: 5 ' -GATATACATATGATTCTCGACACTGATTAC-3 '(下劃線為Nde頂每切位點(diǎn));
[0034] R1:5 '-CGATTATGGATGGGTAAAGCGACCTGAAATCTAAATAAACG-3 ';
[0035] F2:5 '-CGTTTATTTAGATTTCAGGTCGCTTTACCCATCCATAATCG-3 '
[0036]R2:5 ' -GCTGTAGTCGACACTTTTTGGCTTCAACCAAGC-3 '(下劃線為Sal頂每切位點(diǎn))。
[0037] 首先,以PalaeococcuspacificusDY20341基因組DNA為模板分別使用F1和R1引 物對(duì)以及F2和R2引物對(duì),將被假定的內(nèi)含子隔開的2個(gè)PolB的片段(片段1和片段2)分別擴(kuò) 增出來(lái)。然后將2個(gè)擴(kuò)增出的片段等比例混合作為進(jìn)一步擴(kuò)增的模板,使用F1和R2引物對(duì), 將假定的PolB基因擴(kuò)增出來(lái)。
[0038] ?〇?反應(yīng)體系為5(^1,包括1^8(?!18.8)2〇1111,]\%5〇421111,1((:11〇111]\1,(順4)23〇41〇1111, TritonX-100 0.5mg/L,dNTP0.2mM,上下游引物各50ymol/L,模板DNA100ng,lylPfuDNA 聚合酶ΙμL。
[0039] PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性 94°C3min,變性 94°C30s,退火 55°C30s,延伸 72°Cl_2min,30 個(gè)循環(huán),后延伸72°C10min,4°C終止反應(yīng)。
[0040]瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示,分別獲得了 1241bp的片段1和1131bp的片段2以 及2341bp的PolB基因。
[0041 ] 2.原核重組表達(dá)載體構(gòu)建
[0042]利用酶切連接的方法進(jìn)行重組表達(dá)載體的構(gòu)建,使用NdeI和SalI雙酶切克隆載 體pET-15b(Novagen),參照說(shuō)明書使用T4連接酶在16°C下將NdeI和SalI雙酶切的PolB基 因與線性化的PET-15bΜ連接,構(gòu)建出原核重組表達(dá)載體,將原核重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到 E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中,挑取氨芐抗性篩選為陽(yáng)性的菌落,進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證陽(yáng) 性的結(jié)果送上海美吉生物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如序列表中序列3所示,其編碼的蛋白序列如序列 表中序列4所示。
[0043] 3.重組蛋白的原核表達(dá)及體外純化
[0044]將構(gòu)建的原核重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)性的大腸桿菌體內(nèi),通過(guò)調(diào)節(jié)IPTG濃度 以及表達(dá)溫度對(duì)目的基因
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