一種rab7a和egfp基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及到RAB7A基因和EGFP基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋 白慢病毒載體的構(gòu)建，具體涉及一種RAB7A基因和EGFP過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白慢病毒載 體及其構(gòu)建和在細(xì)胞自噬和內(nèi)吞過(guò)程中功能研究。
【背景技術(shù)】
[0002] Rab家族是一類(lèi)RAS相關(guān)的EGTP結(jié)合蛋白，對(duì)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)有重要作用。Rab 蛋白作為囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿娱_(kāi)關(guān)，其功能是與上游調(diào)控子和下游特定的效應(yīng)子相互作用，并 與GTP的結(jié)合和水解過(guò)程相偶聯(lián)，在囊泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、錨定、融合等過(guò)程中起重要作用。
[0003]Rab7 屬Rab蛋白家族（Ras-likprotininratbrain,Rab)，具有介導(dǎo)晚期胞內(nèi) 體與溶酶體的膜融合，參與晚期蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體過(guò)程的特定生物學(xué)功能，Rab7通過(guò)促進(jìn) 溶酶體的運(yùn)輸還可以清除胞內(nèi)病毒，Rab7除了調(diào)控內(nèi)吞過(guò)程的晚期運(yùn)輸外，還參與了受體 的轉(zhuǎn)運(yùn)，如將血管緊張素6受體1A，表皮生長(zhǎng)因子受體轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體降解，受體所在的位 置決定著信號(hào)輸出的結(jié)果。因此，推測(cè)Rab7可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
[0004]Rab蛋白通過(guò)與上游調(diào)控子和下游特定的效應(yīng)子相互作用，它們能夠在GTP結(jié)合 的活性形式和GDP結(jié)合的非活性形式之間轉(zhuǎn)換，從而調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，如囊泡的 形成、運(yùn)動(dòng)、錨著以及融合過(guò)程。Rab蛋白的突變或表達(dá)異常會(huì)引起囊泡運(yùn)輸異常，導(dǎo)致一些 疾病的產(chǎn)生。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，Rab蛋白參與了囊泡運(yùn)輸和釋放及天然免疫應(yīng) 答，還廣泛參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程。另有研究表明，Rab蛋白參與的調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)與其參與 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存在著必然的聯(lián)系，Rab蛋白的定位與它們的功能密切相關(guān)。作為定位在晚期內(nèi) 體或者溶酶體的Rab7,它的功能與內(nèi)吞體的晚期運(yùn)輸密切相關(guān)，盡管許多實(shí)驗(yàn)?zāi)壳岸贾С?Rab7參與了晚期內(nèi)吞過(guò)程，但其中的詳細(xì)機(jī)制還不清楚。目前，Rab7的效應(yīng)分子中研究的 比較透徹的是Rab7相關(guān)溶酶體蛋白（Rab7_intractinglysosomalprotin，RILP)。主要存 在于細(xì)胞內(nèi)晚期內(nèi)體/溶酶體結(jié)構(gòu)。Rab7除了在內(nèi)吞過(guò)程晚期的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮作用外，還 與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡以及抗原遞呈等生理過(guò)程高度相關(guān)。Rab7本身的基因突變可引起遺 傳性疾病。另外，Rab7與病原體逃逸、腫瘤發(fā)生、脂質(zhì)累積癥高度相關(guān)。因此，研究Rab7的 結(jié)構(gòu)及其功能。闡明其在胞內(nèi)發(fā)揮作用的機(jī)理，不僅有助于揭示疾病發(fā)生的機(jī)制，而且可能 為感染性疾病、腫瘤等疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)。
[0005] 慢病毒是一種分子生物學(xué)中對(duì)基因功能研究常見(jiàn)的工具質(zhì)粒，能高效轉(zhuǎn)染原核以 及真核細(xì)胞，使細(xì)胞能夠合成并且表達(dá)目的基因，通過(guò)對(duì)比目的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與否或 者表達(dá)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因在細(xì)胞甚至機(jī)體功能中的作用進(jìn)行驗(yàn)證和分析。因此，慢病毒 在研究基因在細(xì)胞及機(jī)體功能中的應(yīng)用極為廣泛。由于Rab7存在于自噬體和晚內(nèi)吞體膜 上，是自噬體和內(nèi)吞體成熟所必需的共享分子之一，能導(dǎo)引胞內(nèi)貨物沿微管運(yùn)輸，最后參與 自噬體和內(nèi)吞體與溶酶體的融合過(guò)程，目前認(rèn)為該分子是調(diào)控自噬和內(nèi)吞的關(guān)鍵分子。因 此如何直觀(guān)、有效地觀(guān)察RAB7A基因的表達(dá)及其在細(xì)胞自噬與內(nèi)吞的變化顯得極為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：在現(xiàn)有技術(shù)條件下，本發(fā)明第一個(gè)目的在于解決RAB7A基因研究中所 需要的過(guò)表達(dá)載體，并提供EGFP基因和RAB7A基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白的慢病毒載 體；本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供EGFP和RAB7A基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建方法，能通過(guò) EGFP的綠色熒光蛋白來(lái)示蹤RAB7A蛋白的定位及表達(dá)；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供這種 過(guò)表達(dá)載體的應(yīng)用范例。本發(fā)明構(gòu)建的EGFP和RAB7A基因過(guò)表達(dá)的融合綠色熒光慢病毒 載體，解決了RAB7A基因研究中過(guò)表達(dá)載體高效和直觀(guān)等問(wèn)題，該載體以CMV為啟動(dòng)子，能 夠保證真核基因高效表達(dá)，采用EGFP為標(biāo)記物，能夠通過(guò)直觀(guān)觀(guān)察表達(dá)熒光的強(qiáng)弱來(lái)判斷 細(xì)胞發(fā)生自噬和內(nèi)吞的程度以及RAB7A基因在細(xì)胞缺氧過(guò)程中的作用，為研究RAB7A基因 的功能提供了良好的工具，為后續(xù)的RAB7A的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。在本發(fā)明中，RAB7A基因 和EGFP基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光慢病毒載體被轉(zhuǎn)入HK-2細(xì)胞（腎小管上皮細(xì)胞）和293T 細(xì)胞。通過(guò)RAB7A和EGFP的位置以及熒光程度反映在HK-2細(xì)胞自噬和內(nèi)吞的程度。
[0007] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種RAB7A和EGFP 基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體，把EGFP基因和RAB7A基因通過(guò)搭橋PCR的方 法，在EGFP基因和RAB7A基因之間用一段核苷酸序列連接得到EGFP基因片段+ -段核苷 酸序列+RAB7A基因片段，再以慢病毒載體LV11為骨架載體，在LV11的骨架載體中CMV啟 動(dòng)子后面按照5'到3'方向插入EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段即得。 RAB7A基因在細(xì)胞發(fā)生自噬和內(nèi)吞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，觀(guān)察其表達(dá)水平可判斷細(xì)胞發(fā)生 自噬和內(nèi)吞的程度。
[0008] 上述的一段核苷酸序列如SEQIDN0 :1 所示。SEQIDNO:1 :TCCGGACTCAGATCT。 上述的一種RAB7A和EGFP基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括如 下步驟：在EGFP基因的5'端設(shè)計(jì)含有限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物，在RAB7A基因3'端 引入限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)引物，用兩對(duì)引物擴(kuò)增EGFP基因和RAB7A基因，再用EGFP基因 的5'端設(shè)計(jì)含有限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物和在RAB7A基因3'端引入限制性?xún)?nèi)切酶酶 切位點(diǎn)引物，用搭橋PCR方法得到EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，PCR 反應(yīng)完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基 因片段，最后EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段克隆到載體LV11中即得。 [0009] 具體構(gòu)建步驟如下：
[0010] 1)提取人的腎小管上皮細(xì)胞（HK-2)總的RNA，以逆轉(zhuǎn)錄的CDNA為模板，PCR擴(kuò)增 RAB7A基因片段，所用引物：RAB7F:ATGACCTCTAGGAAGAAAG;RAB7R:TCAGCAACTGCAGCTITCT， 將1. 5 %瓊脂糖凝膠回收得到PCR產(chǎn)物導(dǎo)入PMD18-T載體，測(cè)序驗(yàn)證RAB7A基因的核苷酸順 序；
[0011] 測(cè)序結(jié)果與NCBI上的人的RAB7A基因序列進(jìn)行比對(duì)。
[0012] 2)以PEGFP-C1的載體為模板擴(kuò)增EGFP基因，在B1F引物5'端引入BamHI的酶切 位點(diǎn)，擴(kuò)增EGFP基因。1.5%瓊脂糖凝膠回收，所用引物：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種RAB7A和EGFP基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體，其特征在于，把 EGFP基因和RAB7A基因融合通過(guò)搭橋PCR的方法，在EGFP基因和RAB7A基因之間用一段 核苷酸序列連接得到EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，再以慢病毒載體 LV11為骨架載體，在LV11的骨架載體中CMV啟動(dòng)子后面按5'到3'方向插入EGFP基因片 段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段即得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RAB7A和EGFP基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白的慢病毒 載體，其特征在于，所述一段核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述的一種RAB7A和EGFP基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白的慢病 毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：在EGFP基因的5'端設(shè)計(jì)含有限制性?xún)?nèi)切 酶酶切位點(diǎn)的引物，在RAB7A基因3'端引入限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)引物，用兩對(duì)引物擴(kuò)增 EGFP基因和RAB7A基因，再用EGFP基因的5'端設(shè)計(jì)含有限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物 和在RAB7A基因3'端引入限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)引物，用搭橋PCR方法得到EGFP基因片 段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，PCR反應(yīng)完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收 EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，最后將EGFP基因片段+ -段核苷酸序 列+RAB7A基因片段克隆到載體LV11中即得。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種RAB7A和EGFP基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白的慢病毒 載體的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 提取人的腎小管上皮細(xì)胞總的RNA，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增RAB7A基因 片段，所用引物：RAB7F: ATGACCTCTAGGAAGAAAG;RAB7R: TCAGCAACTGCAGCITTCT，將 PCR 產(chǎn) 物導(dǎo)入PMD18-T載體，測(cè)序驗(yàn)證RAB7A基因的核苷酸順序； 2) 以PEGFP-C1的載體為模板擴(kuò)增EGFP基因，在B1F引物5'端引入BamHI的酶切位 點(diǎn)，擴(kuò)增EGFP基因； 所用引物： BIF ：GATAGGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG B1R ：AGAGGTCATAGATCTGAGTCCGGACTTGTAC； 3) 以RAB7A基因?yàn)槟０澹瑪U(kuò)增RAB7基因同時(shí)在B2R的引物3'端引入酶切位點(diǎn)EcoRI， 所用引物： B2F ：CTCAGATCTATGACCTCTAGGAAGAAAGTGT ； B2R:GTATGGGATCCTCAGCAACTGCAGCTTTCTGCCGAGGC； 4) 用搭橋PCR的方法擴(kuò)增EGFP+ TCCGGACTCAGATCT+RAB7A序列，用B1F和B2R引物，以 步驟2)和步驟3)所得到的產(chǎn)物為模板擴(kuò)增獲得EGFP+ TCCGGACTCAGATCT+RAB7A的兩個(gè)基 因連接在一起的序列，所用引物： BIF ：GATAGGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG B2R:GTATGGGATCCTCAGCAACTGCAGCTTTCTGCCGAGGC； 5) 通過(guò)BamHI和EcoRI為酶切位點(diǎn)，將EGFP+ TCCGGACTCAGATCT+RAB7A基因的序列連 接到LV11載體上，并通過(guò)驗(yàn)證得到RAB7A和EGFP過(guò)表達(dá)的融合綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒。
5. 權(quán)利要求1所述的一種RAB7A和EGFP基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體 在研究細(xì)胞自噬與內(nèi)吞以及RAB7A基因功能中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種RAB7A基因和EGFP基因過(guò)表達(dá)融合綠色熒光蛋白慢病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明載體以慢病毒載體LV11為骨架載體，在LV11載體的CMV啟動(dòng)子后面按5’到3’方向插入EGFP基因和RAB7A基因片段，本發(fā)明構(gòu)建的EGFP和RAB7A基因過(guò)表達(dá)的融合綠色熒光蛋白慢病毒載體，解決了RAB7A基因研究中過(guò)表達(dá)載體有效和直觀(guān)等問(wèn)題。該載體以CMV為啟動(dòng)子，能夠保證真核基因高效表達(dá)；采用EGFP為標(biāo)記物，能夠通過(guò)直觀(guān)觀(guān)察表達(dá)熒光的強(qiáng)弱來(lái)判斷細(xì)胞發(fā)生自噬和內(nèi)吞的程度以及RAB7A基因在細(xì)胞缺氧過(guò)程中的作用，為研究RAB7A基因的功能提供了良好的工具，為后續(xù)的RAB7A的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】C12N15-867, C12N15-66, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104531762
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410765155
【發(fā)明人】余文敏, 陳平圣, 王智, 丁粉干, 劉靜, 劉蕾
【申請(qǐng)人】東南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月12日