一種腈水合酶基因、編碼酶、載體、工程菌及其制備酰胺化合物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效水合芳香腈的腈水合酶基因和一種高效表達(dá)該重組酶的基 因工程菌的構(gòu)建，以及該基因工程菌在制備酰胺化合物中的應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 腈化合物是一類(lèi)含有氰基（-CN)的有機(jī)化合物。在化工領(lǐng)域，腈化合物可以作為 重要的化工原料及中間體，廣泛應(yīng)用于化學(xué)品酰胺和羧酸及其衍生物的有機(jī)合成中。然而， 采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化腈化合物通常需要強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和高壓等條件，勢(shì)必對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。 與化學(xué)水解法相比，生物催化法反應(yīng)條件溫和（常溫、常壓和中性PH值），同時(shí)對(duì)環(huán)境污染 的壓力較小。更重要的是，由酶介導(dǎo)的生物催化法能實(shí)現(xiàn)化學(xué)、區(qū)域和對(duì)映體選擇性等優(yōu) 點(diǎn)，提高其原子經(jīng)濟(jì)利用率。腈化合物的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中主要涉及到腈水合酶、酰胺酶和腈 水解酶。其中，腈水合酶可以催化腈水合生成酰胺，而酰胺酶進(jìn)一步將酰胺催化水解產(chǎn)生羧 酸化合物；而腈水解酶可以直接將腈化合物轉(zhuǎn)化為羧酸化合物。
[0003] 在自然界中，生產(chǎn)腈水合酶的微生物分布非常廣泛，如紅球菌、假單胞菌、諾卡 氏菌、假諾卡氏菌、產(chǎn)堿桿菌、棒狀桿菌等。其中，一些微生物已經(jīng)用于丙烯酰胺、煙酰胺 等化合物的工業(yè)化生產(chǎn)中，如專(zhuān)利號(hào)為US007405064B2的專(zhuān)利公開(kāi)了一種野生睪丸酮叢 毛單胞菌5-MGAM-4D ;專(zhuān)利號(hào)ZL88106735的專(zhuān)利公開(kāi)了一種野生玫瑰色紅球菌Jl ;專(zhuān) 利號(hào)為ZL86100062的專(zhuān)利公開(kāi)了一種紅球菌S-6、氧化節(jié)桿菌和黃色微桿菌；專(zhuān)利號(hào)為 ZL99106291. 4的專(zhuān)利公開(kāi)了一種野生嗜熱假諾卡氏菌JCM3095。目前，該領(lǐng)域的主要研宄 針對(duì)野生菌株進(jìn)行篩選和培育，以達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求。然而，在腈水合酶的基因簇中往往 同時(shí)含有酰胺酶基因，從而可以轉(zhuǎn)化丙烯酰胺和煙酰胺為丙烯酸和煙酸，嚴(yán)重影響到目標(biāo) 產(chǎn)物的純度和實(shí)際產(chǎn)率。另外，已報(bào)道的腈水合酶具有穩(wěn)定性差、對(duì)底物和產(chǎn)物的耐受性低 等問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，采用基因工程手段構(gòu)建腈水合酶的基因工程菌株，不僅 可以從源頭阻斷酰胺的進(jìn)一步水解，保證酰胺產(chǎn)品的高質(zhì)量；而且可以采用蛋白質(zhì)工程技 術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行定向改造，提高腈水合酶的某些特性，如穩(wěn)定性和底物耐受性等。同時(shí)，腈 水合酶一般具有很強(qiáng)的底物特異性，往往對(duì)體積較大的芳香腈表現(xiàn)出很低的活力，限制了 其在某些藥物中間體的轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)新型的針對(duì)芳香腈的腈水合酶具有較高 的研宄和應(yīng)用價(jià)值。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種可以高效轉(zhuǎn)化芳香腈生產(chǎn)相應(yīng)酰胺的重組腈水合酶及其 催化腈化合物生成酰胺中的應(yīng)用，該酶由α亞基、β亞基和活化元件基因編碼構(gòu)成。其中， α亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示，β亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，活 化元件的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明涉及一種重組腈水合酶基因，所述重組腈水合酶基因由SEQ ID NO. 2所示 α亞基、SEQ ID NO. 3所示β亞基和SEQ ID NO. 4所示活化元件依次連接構(gòu)成。
[0007] 本發(fā)明還涉及一種由所述的腈水合酶基因編碼的重組腈水合酶，具體優(yōu)選所述重 組腈水合酶由SEQ ID NO. 2所示α亞基基因編碼的SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列、SEQ ID NO. 3所示β亞基基因編碼的SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列和SEQ ID NO. 4所示活化元件 編碼的SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列依次連接構(gòu)成。
[0008] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7所 示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸 序列同源性在90%以上，且具有相同的酶活力，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，屬于本發(fā)明保護(hù)范圍 之列。
[0009] 由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 4所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均可實(shí)現(xiàn)本 發(fā)明目的，屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。
[0010] 本發(fā)明還涉及一種由所述重組腈水合酶基因構(gòu)建的重組載體。
[0011] 本發(fā)明涉及一種由所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
[0012] 本發(fā)明提供一種所述重組腈水合酶基因在制備重組腈水合酶中的應(yīng)用，所述的應(yīng) 用為：將SEQ ID NO. 2所示α亞基、SEQ ID NO. 3所示β亞基和SEQ ID NO. 4所示活化元 件依次連接，合成重組腈水合酶基因，將重組腈水合酶基因與載體連接，構(gòu)建含重組腈水合 酶基因的重組載體，再將重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌，獲得的重組基因工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分 離獲得含重組腈水合酶的菌體細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明提供一種所述的重組腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的應(yīng)用，具體所 述的應(yīng)用為：以含重組腈水合酶基因的重組基因工程經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后獲得的濕菌體為催化 劑，以pH5. 0?8. 0的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，以腈化合物為底物，在25°C下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng) 結(jié)束后，獲得含酰胺的反應(yīng)液，將反應(yīng)液分離純化，獲得酰胺；所述催化劑的用量以濕菌體 的重量計(jì)為10?50g/L緩沖液（優(yōu)選20?30g/l)，所述底物的終濃度為0. 2?I. Omol/L 緩沖液（優(yōu)選〇· 5?0· 8mol/L) 〇
[0014] 本發(fā)明所述的催化劑制備方法為：將含重組腈水合酶基因的重組基因工程接于含 50 μ g/ml Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)10?14h，取培養(yǎng)液以體積濃度 2 %的接種量轉(zhuǎn)接至含50 μ g/ml Kan的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至 〇D_達(dá)到0· 6?L 0時(shí)，加入終濃度0· ImM的IPTG，18?37°C下誘導(dǎo)12?18h，離心，獲得 濕菌體。
[0015] 本發(fā)明所述腈化合物為3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯甲腈、3-甲基苯甲腈或苯乙 腈。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了源自亞硫酸桿菌 E-36中假定腈水合酶基因在大腸桿菌細(xì)胞中的功能表達(dá)，提供了一種高效表達(dá)該酶的基因 工程菌，可以高效轉(zhuǎn)化芳香腈生產(chǎn)相應(yīng)酰胺化合物，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。 (四）【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為實(shí)施例1亞硫酸桿菌E-36中腈水合酶基因的PCR擴(kuò)增電泳圖；M :核酸 Marker ;2?4 :腈水合酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018] 圖2為實(shí)施例2重組質(zhì)粒pET28a(+)-NH_E36的圖譜。
[0019] 圖3為實(shí)施例3基因工程菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH_E36誘導(dǎo)表 達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；M :低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；1 :基因工程菌E. coli BL21(DE3)/ pET28a(+)-NH_E36 誘導(dǎo)后菌體破胞液；2 :基因工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-NH_ E36誘導(dǎo)菌體破胞上清液；3 :基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH_36表達(dá)經(jīng)過(guò)純 化后的重組腈水合酶，箭頭指示重組腈水合酶E36的位置。
[0020] 圖4為實(shí)施例9中3-氰基吡啶及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高效液相色譜圖。 (五）【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0022] DNA 聚合酶（PrimerSTAR HS，X 2)、DNA Marker、限制性?xún)?nèi)切酶（Nde I、Xho I)和 T4DNA連接酶菌購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（Takara?)。細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì) 粒提取試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒購(gòu)自康寧生命科技有限公司（Axygen?)。E. coli DH5a、Ε· coli BL21(DE3)和質(zhì)粒 pET_28a(+)購(gòu)自 Novagen 公司；低分子量蛋白質(zhì) Marker、 瓊脂糖電泳試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0023] LB培養(yǎng)基（g/L) : 10蛋白胨；10氯化鈉；5酵母粉，pH 7. 0,溶劑為水。
[0024] 實(shí)施例1 :全長(zhǎng)臆水合酶基因的克隆
[0025] 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取亞硫酸桿菌E-36 (Sulfitobacter sp. E-36ATCC BAA-1142)的基因組。再根據(jù)亞硫酸桿菌E-36基因組中假定腈水合酶的核苷酸序列（如 SEQ ID NO. 1)設(shè)計(jì)引物NH_E36-Up和NH_E36-Down，以亞硫酸桿菌E-36基因組為模板，PCR 擴(kuò)增全長(zhǎng)腈水合酶基因，如圖1所示。PCR產(chǎn)物采用DNA凝膠回收純化試劑盒進(jìn)行回收，獲 得的全長(zhǎng)腈水合酶基因由SEQ ID NO. 2所示α亞基（編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO. 5所 示）、SEQ ID NO. 3所示β亞基（編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO. 6所示）和SEQ ID NO. 4 所示活化元件（編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO. 7所示）組成，SEQ ID NO. 2所示α亞基、 SEQ ID NO. 3所示β亞基和SEQ ID NO. 4所示活化元件依次連接構(gòu)成，具體步驟參考該試 劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。上游引物NH_E36-Up (含有Nde I酶切位點(diǎn)）如SEQ ID NO. 8所示，下 游引物NH_E36-Down (含有Hind III酶切位點(diǎn)）如SEQ ID NO. 9所示。
[0026] 上游引物 NH_E36_Up :5' -ggaattccat atgacatccc acgggcatga tc_3'
[0027] 下游引物 NH_E36_Down :5' -ccgctcgagc tacagcgtga tagcttgccc-3'
[0028] PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件：
[0029] PCR擴(kuò)增體系：
[0030] PrimerSTAR DN A 聚介 1?: 25 μ I; 上游引物（lOpmol/μΙ) 2.0 μ?； 下游引物（lOpmol/μΙ) 2.0 μ?； 模板DNA (基因組） 2.0 μ?; 加雙蒸水至 50 μΙ,.
[0031] PCR擴(kuò)增條件：
[0032] 1)預(yù)變性：95°C 2min ;
[0033] 2)變性：95°C IOs ;退火：58°C 15s ;延伸：72°C 15s ;共循環(huán) 30 次；
[0034] 3)延伸：72°C IOmin ;
[0035] 4)4。〇保存2.011。
[0036] 實(shí)施例2 :基因工程菌株E. coli pET28a(+)-NH_E36的構(gòu)建和鑒定
[0037] 為了實(shí)現(xiàn)來(lái)源于亞硫酸桿菌E-36基因組中腈水合酶基因在大腸桿菌BL21 (DE3) 細(xì)胞內(nèi)的高效功能表達(dá)，選擇含有T7啟動(dòng)子的pET28a (+)作為表達(dá)載體。將載體pET28a (+) 和全長(zhǎng)腈水合酶基因經(jīng)Nel I和Xho I雙酶切，采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行酶切產(chǎn)物的 回收。
[0038] 雙酶切體系和反應(yīng)條件：
[0039] 基因或質(zhì)粒 20 μ?; jVe/I 酶 2 μ?; Χ/κ)丨酶 2μΙ; 加雙蒸水至 40 μΙ;
[0040] 37。〇保溫511。
[0041] 采用核酸電泳初步確定兩者的濃度，以基因/質(zhì)粒（mol/mol, 2:1)進(jìn)行混合，加入 T4DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，得到重組質(zhì)粒pET28a (+) -NH_E36 (示意圖如圖2所示）。然后， 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E. coli BL21(DE3)細(xì)胞中。再將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有終濃 度100 μ g/ml卡那霉素（Kanamycin，Kan)的LB平板上，經(jīng)37°C靜止培養(yǎng)，挑取單菌落，由上 海生工進(jìn)行基因序列的測(cè)定，從而驗(yàn)證重組質(zhì)粒pET2