一種羰基還原酶基因、編碼酶、載體、工程菌及其應(yīng)用
【專利說明】-種嚴基還原酶基因、編碼酶、載體、工程菌及其應(yīng)用 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于唐營蒲伯克霍爾德氏菌 炬urldiolderia gladioli)ZJB-12126的撰基還原酶基因、編碼酶、含有該基因的重組載體、 該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌W及在催化不對稱還原前手性撰基化合物中的應(yīng) 用。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 撰基還原酶（Carbonyl reducatase, E. C. 1. 1. 1. X)是一類能夠催化醇和酵/麗 之間雙向可逆氧化還原反應(yīng)的酶類，并且需要輔酶NAD(H)(煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸）或 NADP (H)(煙醜胺腺嘿嶺二核巧酸磯酸）作為氨傳遞體。NADH和NADPH作為電子供體參與 其還原反應(yīng)，NAD和NADP則作為電子受體參與其氧化反應(yīng)。目前根據(jù)文獻報道的撰基還 原酶大多屬于短鏈脫氨酶超家族（Sho;rt-chaindehy化ogenase/reductase, SDR)、中鏈醇氨 酶超家族（Medium-chaindehy化ogenase/reductase, MDR)、酵麗還原酶超家族（Aldo-keto re化ctase，AKR)。雖然H者具有相似的催化功能，但在進化和結(jié)構(gòu)上差異較大。撰基還原 酶是一類非常古老的家族，廣泛分布于自然界中，在各類動物、微生物和植物中，由于微生 物種類繁多、分布廣，是撰基還原酶的主要來源。
[0003] 近年來，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，基因組和基因序 列數(shù)據(jù)庫中公布的基因數(shù)據(jù)的迅速增長，從大量的數(shù)據(jù)資源中尋找新型的撰基還原酶基 因、挖掘其蘊含的生物學(xué)信息，為新型高效生物催化劑的開發(fā)服務(wù)已經(jīng)成為現(xiàn)實?；?挖掘技術(shù)是一項新型酶篩選技術(shù)，目前已得到廣泛地應(yīng)用。利用基因挖掘已從Pichia finlandica PfODH、Clostridium 1jungdahlii BDHl、Candida glabrata CgKRUSerratia quinivorans SQ_SDR、Polygonum minus PmADH、Arabidopsis thaliana AtADH、0enococcus oeni Adh3、Chryseobacterium sp. ChKRED20、Candida magnoliae CmCR W及 Acetobacter sp.AcCR等菌株中挖掘了大量的撰基還原酶。其中部分撰基還原酶的基因已在不同的宿主 (Escherichia coli、Pichia pastoris、Arxula adeninivorans 等）中成功表達，獲得產(chǎn)酶 活力和選擇性較高的基因工程菌，并成功應(yīng)用于催化撰基類化合物的不對稱還原反應(yīng)。盡 管如此，許多撰基還原酶具有底物特異性，大大限制了其應(yīng)用范圍。此外，許多酶的催化效 率較低，也限制了其工業(yè)化應(yīng)用。篩選具有較寬底物譜的新型撰基還原酶，研究其可W高效 高選擇性催化的撰基化合物，不僅可W拓寬其應(yīng)用范圍，提升其應(yīng)用潛力，也為實現(xiàn)工業(yè)化 生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0004] 手性醇廣泛應(yīng)用于手性藥物和其他手性精細化學(xué)品的合成。目前手性醇的合成方 法包括物理分離法、拆分法W及不對稱還原法等。其中，利用前手性撰基化合物的不對稱還 原合成手性醇，其理論產(chǎn)率達100%，是目前生產(chǎn)手性醇的一種主要方法。化學(xué)不對稱還原 法主要是利用手性金屬配合物作為催化劑用于撰基的不對稱還原，雖然該化學(xué)方法已部分 用于工業(yè)生產(chǎn)，但是該反應(yīng)條件比較苛刻、手性金屬配合物合成復(fù)雜并且價格昂貴，產(chǎn)物中 有重金屬的殘留導(dǎo)致產(chǎn)物分離困難，環(huán)境污染較大，因此其應(yīng)用受到了一定的限制。生物催 化不對稱還原法不僅具有高度的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，并且反應(yīng)條件溫和，避免了產(chǎn)物 中的重金屬殘留，對環(huán)境友好，彌補了化學(xué)方法的不足，因此，近年來生物催化的撰基不對 稱還原反應(yīng)在手性醇合成中的應(yīng)用越來越受到重視。
[0005] (2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羥基下酸醋是合成碳青霉帰和青霉帰類藥物中間 體4-己醜氧基氮雜環(huán)下麗（4-AA)的手性碩塊。目前獲得（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-輕 基下酸醋中間體的主要途徑是W手性催化劑（R)-BINAP-Ru配合物不對稱催化2-苯甲醜 氨甲基-3-麗下酸醋生成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羥基下酸醋。但由于該反應(yīng)條 件需要高壓加氨、金屬釘配合物的價格比較昂貴并且與產(chǎn)物的分離較為困難等，不利于其 工業(yè)化應(yīng)用。目前生物催化法合成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羥基下酸醋報道較少。 Saccharomycopsis malanga NBRC 171096 催化生成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羥基 下酸醋，并具有較高的對映選擇性（對映體過量值ee〉96. 2%)，但是催化效率低（產(chǎn)率僅 4% )。美國專利US20130034895研究了來源于Lactobacillus kefir的撰基還原酶催化合 成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羥基下酸醋，具有較高的對映選擇性（ee為60~99 % )， 但在該反應(yīng)過程中，W異丙醇作為第二底物實現(xiàn)輔酶循環(huán)利用，由于異丙醇與底物存在競 爭性抑制作用，導(dǎo)致最大轉(zhuǎn)化率受到影響，并且副產(chǎn)物丙麗的生成對酶有一定的損害作用。
[0006] 6-氯基-(3R，5R)-二羥基己酸叔下醋是HMG-CoA酶抑制劑阿巧伐他汀類藥物 的手性中間體，可W通過化學(xué)合成和生物催化合成的方法獲得。在化學(xué)法合成中需要使 用易燃易爆的正下基裡、測焼，并且需要在<-65°C低溫條件下進行，能耗大，再加6-氯 基-(3R，5R)-二羥基己酸叔下醋非對映誘導(dǎo)不充分，產(chǎn)物的光學(xué)純度難W達到要求。近年 來，利用酶法代替化學(xué)法改善反應(yīng)條件，降低反應(yīng)成本，提高產(chǎn)物的選擇性成為研究的熱 點。目前已篩選到的高立體選擇性催化（時-6-氯基-5-羥基-3-撰基己酸叔下醋生成6-氯 基-(3R, 5R)-二羥基己酸叔了醋的菌株有；Saccharomyces cerevisiae、Pichia angusta、 Pichia haplophila> Beauveria bassiana> Pichia pastoris> Pichia membranefaciens、 Candida humicola、Kluyveromyces drosophilarum、Rhodotorula glutinis 和 Pichia caribbic 等。Codexis 公司專利 US7879585B2 從 Saccharomyces cerevisiae 中克隆了一種 麗還原酶并進行了改造，催化生產(chǎn)6-氯基-(3R，5R)-二羥基己酸叔下醋轉(zhuǎn)化率為99. 7%， de〉99%。
[0007] 貝氣沙通（Befloxatone)化學(xué)名5佩-(甲氧甲基）-3-[4-[4, 4, 4- S氣 基-3 (時-羥基下氧基]苯基]嗯哇焼麗-2,是一種強選擇性可逆性單胺氧化酶A (MA0-A) 抑制劑，與M0-A黃素腺嘿嶺二核巧酸（FAD)輔因子及活性位點的特異氨基酸相互作用， 臨床上用來治療抑郁癥。（時-4, 4, 4- H氣-3-羥基下酸己醋是合成貝氣沙通的手性中間 體。aiang等首先報道了菌株Bacillus pumilus化e-C3中含有NADPH依賴型撰基還原酶 和葡萄糖-6-磯酸脫氨酶佑-6-PDH)，能催化4, 4, 4-H氣己醜己酸己醋生成（時-4, 4, 4-H 氣-3-羥基下酸己醋，底物濃度為60mM時，產(chǎn)率達67%，ee達95%?；热撕Y選到一株 Saccharomyces uvarum SW-58,并利用水-有機溶劑兩相體系催化4, 4, 4-H氣己醜己酸己 醋生成（時-4,4, 4-H氣-3-羥基下酸己醋，底物濃度為0.2mM時，化后轉(zhuǎn)化率達85%，ee 達85. 2%。Kara等人利用商品酶ADH evo-1. 1.200催化該反應(yīng)，底物濃度為5mM，2化后轉(zhuǎn) 化率39. 2%，選擇性有了明顯的提高（ee〉99. 9%)。此外，（S)-4,4, 4-H氣-3-羥基下酸 己醋也是一種重要的手性中間體，其生物催化法不對稱合成未見報道。
[0008] 由此可見，研究該些藥物手性中間體的生物催化工藝具有重要意義，不僅能為該 些化合物的合成提供新的路線，又能為其提供新的酶源。迄今為止，仍未見Bur化olderia gladioli菌株中的撰基還原酶在該些藥物手性中間體不對稱還原中的應(yīng)用。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的是提供一種來源于唐營蒲伯克霍爾德氏菌炬ur化olderia gladioli) ZJB-12126撰基還原酶、基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工 程菌，W及在制備（2S，3R) -2-苯甲醜氨甲基-3-羥基下酸醋、（巧-4-氯-3-羥基下酸己醋、 6-氯基-(3R，5R)-二羥基己酸叔下醋W及4, 4, 4- H氣己醜己酸己醋等手性藥物中間體中 的應(yīng)用。