本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及作物育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及白葉枯病抗性基因xa21輔助育種分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻白葉枯病菌具有生理小種?；裕贩N的抗性基本上都是受核基因組中的主效抗性基因控制，自世紀(jì)年代日本科學(xué)家利用黃玉和蘭泰耶瑪斯與金南風(fēng)雜交后代分析其對日本菌群抗性反應(yīng)，鑒定并命名2個(gè)顯性抗性基因后，有關(guān)水稻白葉枯病抗性基因的鑒定與發(fā)掘研究就沒停止過。1975年以后，國際水稻研究所用菲律賓生理小種先后鑒定出7個(gè)抗病基因(章琦，2007)。其他國家科研人員也相繼鑒定出一批抗性基因，但由于各國科學(xué)家使用的菌系不同，其鑒定結(jié)果缺乏可比性，在一定程度上影響到該研究領(lǐng)域的進(jìn)展。因此從1982年開始，irri與日本科學(xué)家開始合作進(jìn)行白葉枯病基因鑒定工作，創(chuàng)建了水稻白葉枯病抗性基因鑒別系統(tǒng)，到1987年確認(rèn)了xa1、xa2、xa3、xa4、xa5、xa6、xa7、xa8、xa10、xa11、xa12等11個(gè)抗性基因的存在(ogawaetal.,1987)。隨后有更多的基因被鑒定、定位與克隆。我國科學(xué)家lin等(1996)通過對云南品種扎昌龍的抗性遺傳研究，在第11染色體短臂末端定位一個(gè)新的顯性抗病基因xa22(t)，且該基因表現(xiàn)出廣譜抗性。chen等(2002)對明恢63與珍汕97的雜交后代進(jìn)行抗性遺傳分析，表明明恢對菲律賓菌株的抗性受一對顯性基因控制，并將其抗性基因定位于第12染色體上，命名為xa25(t)。截至到目前，已確認(rèn)和報(bào)道的白葉枯抗性基因有38個(gè)，命名排序至xa38(虞玲錦等，2012；國家水稻數(shù)據(jù)中心)。其中有26個(gè)為顯性基因，其余為隱性基因；已經(jīng)被定位的有26個(gè)，其中有8個(gè)基因已被克隆，分別為xa1、xa5、xa27、xa13、xa3/xa26、xa4、xa21和xa23(王春連，2006；裴慶利等，2011；國家水稻數(shù)據(jù)中心)。目前，育種家們通過分子標(biāo)記輔助選擇(molecularassistedselectoin，mas)，已利用xa4、xa21和xa23選育出了許多抗病恢復(fù)系品種，如ir26、ir28、ir30、ir32、ir36、ir50、ir54等。國內(nèi)大面積種植的雜交稻中大多含有xa4基因，不過長期大面積地使用單一抗源已經(jīng)導(dǎo)致了新致病菌株的進(jìn)化，雜交稻抗病的持久性得不到保證。因此，如何利用新的抗病基因，盡快提高雜交稻的抗病性是育種中急待解決的問題。xa21是第一個(gè)從野生稻中被克隆出來的重要功能基因。khush等報(bào)道其抗性供體為西非長藥野生稻，在水稻分蘗后期抗當(dāng)時(shí)菲律賓的全部6個(gè)小種。經(jīng)雜交導(dǎo)入ir24后，通過回交、自交獲得了bc4f2群體，分析其中兩個(gè)f2群體對菲律賓小種1、2、4和6的抗性遺傳，表明其廣譜抗性由一對顯性基因控制，有別于已鑒定的17個(gè)抗性基因，被命名為xa21，后來進(jìn)一步選育成攜有xa21的近等基因系irbb21。ronald等將xa21定位于第11染色體上，與rapd818、rapd248和rg103標(biāo)記的遺傳圖距都不超過1.2cm。隨后該基因由宋文源等克隆，并迅速廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外水稻抗白葉枯病轉(zhuǎn)基因育種(國家水稻數(shù)據(jù)中心)。因此，利用mas等現(xiàn)代育種技術(shù)，將xa21基因?qū)胫髟缘碾s交稻恢復(fù)系中，有望大大提高我國水稻的抗病性和生產(chǎn)安全。由于xa21基因已經(jīng)被克隆，目前將xa21基因?qū)胨局械难芯恐饕棉D(zhuǎn)基因技術(shù)和應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇。轉(zhuǎn)基因政策在我國尚未放開，轉(zhuǎn)xa21材料無法應(yīng)用在實(shí)際大規(guī)模育種中。輔助選擇中應(yīng)用的標(biāo)記一般為rapd、ssr、aflp、rflp、cap或dcap等標(biāo)記，或基于需要pcr或酶切或兩者結(jié)合，這些都需要繁瑣且存在污染風(fēng)險(xiǎn)的電泳檢測。發(fā)明人通過3000份水稻重測序數(shù)據(jù)庫，通過序列比對，挖掘了在基因連鎖定位區(qū)間內(nèi)，與xa21緊密連鎖的特異性snp分子標(biāo)記，結(jié)合kasp檢測技術(shù)，無需凝膠電泳檢測也不限制于高成本的限制性內(nèi)酶，在xa21遺傳育種中可以高通量、快速、精確的鑒定xa21基因，大大提高基因轉(zhuǎn)育的效率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是開發(fā)出高抗、廣譜、持久的抗白葉枯病基因xa21的分子標(biāo)記，其能用于xa21基因的鑒定及輔助選擇育種。本發(fā)明白葉枯病抗性基因xa21輔助育種分子標(biāo)記的開發(fā)流程見圖1。鑒于xa21基因已被成功克隆，根據(jù)文獻(xiàn)將xa21基因位置確定在水稻11號染色體的21273014-21277323區(qū)間，利用xa21的供體材料與非供體材料的重測序數(shù)據(jù)對此基因區(qū)間及其附近兩側(cè)的snp位點(diǎn)進(jìn)行挖掘。挑選出的snp位點(diǎn)，提取側(cè)翼序列，并利用在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站batchprimer3對其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。針對這些候選snp標(biāo)記，對含有xa21基因的水稻品種華恢1437、華恢1337、irbb21、中恢8015、r66、r104、r108共7份基因供體材料和其它不含xa21的15個(gè)水稻品種進(jìn)行kasp反應(yīng)驗(yàn)證，挑選出與xa21供體材料共分離及擴(kuò)增效果好的snp標(biāo)記rsxa211110。隨后利用約190份材料對所挑選的抗性基因連鎖snp標(biāo)記進(jìn)行自然群體驗(yàn)證，證明本發(fā)明檢測的xa21基因位點(diǎn)為高特異性的抗性位點(diǎn)。利用xa21供體親本中恢8015和受體親本內(nèi)香5a的f2雜交群體進(jìn)行了遺傳位置驗(yàn)證及表型驗(yàn)證，再次驗(yàn)證了本發(fā)明的可行性和準(zhǔn)確性。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供白葉枯病抗性基因xa21輔助育種分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記是與水稻白葉枯病抗性基因xa21共分離的snp標(biāo)記rsxa211110，該snp標(biāo)記檢測水稻第11號染色體20894905位堿基；基于kasp技術(shù)開發(fā)的該snp標(biāo)記的引物，包括特異引物特異引物x、特異引物引物y和通用引物c，引物序列分別如seqidno:1-3所示。本發(fā)明還提供基于kasp技術(shù)開發(fā)的用于鑒定水稻白葉枯病抗性基因xa21的引物，包括特異引物x、特異引物y和通用引物c，引物序列分別如seqidno:1-3所示。本發(fā)明還提供含有上述引物的檢測試劑或試劑盒。本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記、引物、檢測試劑或試劑盒在鑒定水稻白葉枯病抗性基因xa21中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記、引物、檢測試劑或試劑盒在白葉枯病抗性基因xa21輔助育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記、引物、檢測試劑或試劑盒在選育具有白葉枯病抗性的水稻資源中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括以下步驟：1)提取待測水稻樣品的dna；2)取20ng干燥模板dna，100um特異引物x0.005μl，100um特異引物y0.005μl，100um通用引物c0.0125μl，2×kaspmastermix1.4792μl，h2o1.4983μl，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；3)采用熒光檢測儀分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物基因型。步驟2)pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性15分鐘；第一步擴(kuò)增反應(yīng)：94℃變性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8℃；第二步擴(kuò)增反應(yīng)，94℃變性20秒，57℃退火并延伸60秒，26個(gè)循環(huán)。步驟3)具體為：利用生物學(xué)軟件對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型，等位位點(diǎn)rsxa211110-a為具有白葉枯病抗性優(yōu)異等位類型的水稻植株。利用本發(fā)明提供的snp標(biāo)記rsxa211110，通過檢測某水稻品種是否含有“xa21基因位點(diǎn)”，最終確認(rèn)在被測定水稻品種中是否含有xa21基因。目前由于沒有報(bào)道用于鑒定xa21基因的緊密連鎖的分子標(biāo)記。一般可采用白葉枯病菌的抗譜分析來鑒定xa21基因的存在，但是該方法需要多個(gè)菲律賓生理小種，接菌條件包括水稻的生育時(shí)期、氣候、溫度等也比較嚴(yán)格，不適合大面積鑒定和應(yīng)用。本發(fā)明具有操作簡單、成本低廉、周期短的優(yōu)點(diǎn)，而且該標(biāo)記的穩(wěn)定性好，不受其它基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，可在早代選擇，縮短育種年限，提高育種效率，適于推廣應(yīng)用。本發(fā)明對水稻抗白葉枯的品種改良具有重要意義，適用于xa21基因的輔助選擇育種。附圖說明圖1為本發(fā)明白葉枯病抗性基因xa21輔助育種分子標(biāo)記的開發(fā)流程圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中snp標(biāo)記rsxa211110檢測自然群體分型圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中snp標(biāo)記rsxa211110在水稻第11號染色體上的遺傳位置驗(yàn)證。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。實(shí)施例1水稻白葉枯病抗性基因xa21輔助育種分子標(biāo)記的獲得1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)將xa21基因位置確定在水稻11號染色體的21273014-21277323區(qū)間，利用xa21的供體材料與非供體材料(共3000份水稻材料)的重測序數(shù)據(jù)對此基因區(qū)間及其附近兩側(cè)的snp位點(diǎn)進(jìn)行挖掘。挑選出的snp位點(diǎn)，提取側(cè)翼序列，并利用在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站batchprimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)對其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。每組標(biāo)記有三條引物，在其中兩條特異性引物5’端分別連接fam和hex熒光序列。引物委托invitrogen公司合成?；趉asp反應(yīng)原理及抗感材料的單堿基差異設(shè)計(jì)的標(biāo)記能高通量地對水稻材料進(jìn)行xa21抗性基因檢測，如果樣品中只檢測到fam熒光，則該樣品的堿基為allelex；如果只檢測到hex熒光，則該樣品的堿基為alleley；如果同時(shí)檢測到兩種熒光，則該位點(diǎn)堿基為雜合狀態(tài)(表1)。表12、dna提?。簭乃救~片中提取基因組dna，采用簡化ctab法。①取樣放入2.0mltube中，預(yù)先加入兩粒鋼珠和750ulctab溶液，震蕩勻漿樣品1.5min；②65℃震蕩加熱0.5h(0.5-1h)；③冷卻至室溫，在通風(fēng)櫥中加入750ml氯仿︰異戊醇(24︰1)溶液混勻；④12000rmp離心10min，取上清約500ml轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中；⑤加入等體積異丙醇溶液輕搖混勻，于-20℃沉淀1小時(shí)以上，12000rmp離心10min，去上清；⑥加入1000ml70％乙醇，輕彈沉淀，1000rmp離心3min，去上清；⑦加300ulh2o過夜溶解備用。3、kasp反應(yīng)測試kasp反應(yīng)測試在lgcsnpline基因分型平臺上進(jìn)行。在微孔反應(yīng)板中加入20ngdna樣品，烘干后加入kasp反應(yīng)混合液，反應(yīng)體系見表2。pcr擴(kuò)增在水浴熱循環(huán)儀中完成，touchdownpcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性15分鐘；第一步擴(kuò)增反應(yīng)，94℃變性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8℃；第二步擴(kuò)增反應(yīng)，94℃變性20秒，57℃退火并延伸60秒，26個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后利用掃描儀pherastar對kasp反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取，熒光掃描的結(jié)果會自動(dòng)轉(zhuǎn)化成圖形。本發(fā)明中使用的lgcsnpline基因分型平臺與其配套試劑耗材均購于英國lgc公司。表2kasp檢測的反應(yīng)體系終濃度體積(μl)100umprimerc0.42um0.0125100umprimerx0.17um0.0050100umprimery0.17um0.00502×kaspmastermix1×1.4792超純水1.4983總體積34、標(biāo)記分型數(shù)據(jù)用標(biāo)記rsxa211110對含有xa21基因的水稻品種華恢1437、華恢1337、irbb21、中恢8015、r66、r104、r108共7份基因供體材料和其它不含xa21的15個(gè)水稻品種進(jìn)行kasp初篩反應(yīng)驗(yàn)證，結(jié)果見表3。含xa21基因的水稻品種在rsxa211110測試位點(diǎn)檢測結(jié)果均為堿基a，除了無擴(kuò)增的3份材料，12份不含xa21水稻品種無論是其他抗白葉枯基因供體還是感病材料均在測試位點(diǎn)檢測出堿基t。表3標(biāo)記rsxa211110初篩分型數(shù)據(jù)實(shí)施例2水稻白葉枯病抗性基因xa21snp標(biāo)記rsxa211110的應(yīng)用為了檢測本發(fā)明snp標(biāo)記rsxa211110的特異性和實(shí)用性，利用188份材料對snp標(biāo)記rsxa211110進(jìn)行自然群體驗(yàn)證。188份材料中包括已知含純合xa21基因的品種，含有其他抗白葉枯供體、普感材料、常見雜交稻和核心水稻育種材料。標(biāo)記在自然群體分型結(jié)果如圖2所示，7份已知含xa21基因的品種檢測為具有白葉枯抗性的純合xa21基因型，含有其他抗白葉枯基因供體、普感材料和除中恢8015外(xa21供體)的核心水稻育種材料均檢測為無白葉枯抗性純合xa21基因型，常見雜交稻中少數(shù)檢測出雜合xa21基因型?？梢姡瑂np標(biāo)記rsxa211110檢測xa21基因位點(diǎn)為高特異性的抗性位點(diǎn)，可便捷高效的用于鑒定水稻品種中是否含有xa21基因。實(shí)施例3與水稻白葉枯病抗性基因xa21共分離的snp標(biāo)記的遺傳定位及表型驗(yàn)證利用xa21供體親本中恢8015和受體親本內(nèi)香5a的f2雜交群體進(jìn)行了遺傳位置驗(yàn)證及表型驗(yàn)證，再次驗(yàn)證了本發(fā)明的可行性和準(zhǔn)確性。1、標(biāo)記遺傳位置驗(yàn)證利用f2群體和10個(gè)在父母本中具有多態(tài)性的snp標(biāo)記以及本發(fā)明中的xa21特異性標(biāo)記rsxa211110進(jìn)行遺傳位置驗(yàn)證，本發(fā)明的標(biāo)記rsxa211110被定位到水稻第11號染色體21.2cm位置(圖3)。2、標(biāo)記表型驗(yàn)證利用中恢8015和受體親本內(nèi)香5a的f2群體對本發(fā)明與基因xa21連鎖標(biāo)記rsxa211110進(jìn)行遺傳表型驗(yàn)證。在水稻孕穗期，對f2群體119個(gè)單株及2個(gè)親本品種接種廣東白葉枯病菌株pxo61，21天后調(diào)查病情，表型數(shù)據(jù)與基因型一致性為97％，再次驗(yàn)證了本發(fā)明的可行性和準(zhǔn)確性。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>華智水稻生物技術(shù)有限公司<120>白葉枯病抗性基因xa21輔助育種分子標(biāo)記及其應(yīng)用<130>khp171113254.5<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1aagatttgatagctgccaagga22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2aagatttgatagctgccaaggt22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3cttgcagccaacagcctatc20當(dāng)前第1頁12