本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

目前短串聯(lián)重復(fù)序列分型是法醫(yī)學(xué)廣泛采用的分型技術(shù)，單核苷酸多態(tài)性是近些年來應(yīng)用于法醫(yī)領(lǐng)域的遺傳標(biāo)記，它對于處理降解檢材，以及推測嫌疑人個性特征有一定的優(yōu)勢。目前利用法醫(yī)的常規(guī)技術(shù)手段能夠解決案件中大多數(shù)同一認(rèn)定和親子關(guān)系鑒定問題，但對于同卵雙胞胎仍然很難進(jìn)行區(qū)分。由于同卵雙生子是從同一個受精卵發(fā)育而來，他們擁有相同的dna序列，這就給涉及同卵雙胞胎的犯罪案件的偵破帶來很大的困難。英國的樸次茅斯市發(fā)生的汽車盜竊案，在被盜汽車上采集到嫌疑人dna，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)有一對同卵雙胞胎都擁有這份dna數(shù)據(jù)，這就無法認(rèn)定真正的盜竊者。法國馬賽地區(qū)發(fā)生的多次強(qiáng)奸案，警方通過監(jiān)控鎖定了一名送貨司機(jī)，但最終查出的嫌犯是一對同卵雙胞胎兄弟，由于應(yīng)用現(xiàn)有的技術(shù)無法區(qū)分這對兄弟，也只好把兩人無罪釋放。同卵雙胞胎違法犯罪事件同樣在國內(nèi)也有發(fā)生，陜西省岐山縣公安局受理的一起強(qiáng)奸殺人案，dna證據(jù)直指鄰家一對同卵雙胞胎，由于他們具有相同的dna分型，從而給案件的偵破帶來了很大的困難。因此，應(yīng)用分子生物學(xué)的方法對同卵雙生子進(jìn)行鑒別，對案件的偵破將起到很大的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對同卵雙生子之間有著相同或極其相似的基因序列，難以區(qū)分的問題，提供檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒，包括：血液dna提取試劑盒、dna甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒、pcr緩沖溶液、引物、焦磷酸測序試劑盒、磁珠、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、退火緩沖液和變性緩沖液；所述引物包括分別對應(yīng)靶序列igs3、igs4、igs5和igs6，用于pcr擴(kuò)增的上下游引物和測序引物：

（1）對于igs3靶序列：

上游引物：5’-agagggttatttgagtttagtttttt-3’，

下游引物：5’-biotin-aaaatttacaaatttccaatctactatcc-3’，

測序引物：5’-ttttttttttaattttgtaatgagt-3’；

（2）對于igs4靶序列：

上游引物：5’-gtttttggtaggaagagggaaaaat-3’，

下游引物：5’-biotin-attaaccaaaataatcttaatcacctaac-3’，

測序引物：5’-aggaagagggaaaaataatta-3’；

（3）對于igs5靶序列：

上游引物：5’-gtttttgatagggttggtttgtattg-3’，

下游引物：5’-biotin-ccactaaaaaaaacaaaaacaacctaatta-3’，

測序引物：5’-ggttggtttgtattgg-3’；

（4）對于igs6靶序列：

上游引物：5’-gttgggtttatttttgttattgttgg-3’，

下游引物：5’-biotin-actcttccaaaaaacccctaat-3’，

測序引物：5’-atttttgttattgttggaga-3’；

所述下游引物標(biāo)有生物素。

本發(fā)明所述的鑒別同卵雙生子的方法，包括如下步驟：

a）利用所述血液dna提取試劑盒提取同卵雙生子dna，得到dna提取液；

b）利用所述dna甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒對步驟a）中所提取的dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；

c）pcr擴(kuò)增

在pcr緩沖溶液、上下游引物和無核酶水混合溶液中加入步驟b）中經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

d）分別建立相應(yīng)的assay，確定每條序列噴堿基的相應(yīng)順序

對于igs3的序列噴堿基順序：

atcgctgatcgtgtgactgattcgtagttgatatatatgtgtgtagtgtagagaatcgtg；

對于igs4的序列噴堿基順序：

attgactgatcgtgtgctgatcgtgtgatcgtgtattagtattgatgtcgagtgtatatgatcgag；

對于igs5的序列噴堿基順序：

atgctgatcgctagttattagtgtatgtcgtgagtatcgat；

對于igs6的序列噴堿基順序：

atatgtcagtcgctagttggagctattgatcgagtgatagtcgtattgtgtagttcgtatgatcgag；

e）對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈分離和純化

步驟c）中所得的擴(kuò)增產(chǎn)物加入含有結(jié)合緩沖液和磁珠的pcr板孔內(nèi)，恒溫水平震蕩處理后，用樣品吸附器吸附結(jié)合在磁珠上的含生物素的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)純化處理得到純凈的單鏈dna模板；將所述單鏈dna模板轉(zhuǎn)移至含測序引物的退火緩沖液中，恒溫退火，冷卻至室溫待測序；

f）對單鏈dna模板進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)

準(zhǔn)備好焦磷酸測序反應(yīng)所用的酶混合物、底物混合物及dntp，加入試劑艙，將步驟e)所得的單鏈dna模板放入焦磷酸測序儀，根據(jù)步驟c）中的噴堿基順序進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)；

g）分析測序結(jié)果

焦磷酸測序儀自動對測序結(jié)果進(jìn)行判讀并標(biāo)記出每個甲基化位點的甲基化程度及平均甲基化水平，根據(jù)測序結(jié)果獲得的甲基化信息，對同卵雙生子進(jìn)行鑒別：以焦磷酸測序儀靈敏度a為標(biāo)準(zhǔn)，若同卵雙生子之間甲基化水平差值大于a，則認(rèn)為雙生子之間有差異；若同卵雙生子之間甲基化水平差值小于或等于a，則認(rèn)為雙生子之間無差異。

進(jìn)一步地，所述步驟e）中，pcr板孔內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物、結(jié)合緩沖液、磁珠的體積比為37:40:3。

進(jìn)一步地，所述恒溫水平震蕩采用恒溫混勻儀實現(xiàn)，所述恒溫混勻儀為thermomixer。

進(jìn)一步地，所述步驟e）中，純化處理依次包括：用70%乙醇洗滌5秒，變性緩沖液中變性15秒，洗滌緩沖液中洗滌15秒。

進(jìn)一步地，所述步驟e）中，含測序引物的退火緩沖液中退火緩沖液與測序引物體積比為25:1。

進(jìn)一步地，所述步驟e）中，恒溫退火溫度為80℃，時間為5min。

基因序列：gs1序列(genebankaccesionnumber:xm_006726188)位于跨膜通道樣蛋白4（transmembranechannel-like4，tmc4）的外顯子區(qū)，可檢測6個cpg位點，擴(kuò)增片段為85bp；gs3序列(genebankaccesionnumber:nm_001256358)位于酪氨酸蛋白激酶6（proteintyrosinekinase6,ptk6)的外顯子區(qū)，可檢測5個cpg位點，擴(kuò)增片段為129bp；igs1、igs2兩條序列均位于基因間區(qū)，其染色體定位分別為chr3:22416669-22416925、chr3:79754432-79754736，其擴(kuò)增片段長度分別為139bp、164bp，可分別檢測4個、3個cpg位點；line-1序列擴(kuò)增片段為168bp，可檢測3個cpg位點；5條靶序列dna甲基化鑒別同卵雙生子的能力的累積效能為77.5%。

本發(fā)明中所提供的基因序列：igs3、igs4、igs5和igs6四條序列均位于基因間區(qū)，其染色體定位分別為chr1:114870877-114871203、chr12:67213759-67214092、chr11:5539842-5540207、chr1:56877427-56877787，其擴(kuò)增片段長度分別為152bp、141bp、109bp、168bp，可分別檢測4個、5個、3個、4個cpg位點。

采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：

（1）本發(fā)明所提供的檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒，所包含的4條序列igs3、igs4、igs5和igs6在相應(yīng)的cpg位點上甲基化水平存在明顯差異，可以有效的對同卵雙生子進(jìn)行鑒別，與現(xiàn)有的gs1、gs3、igs1、igs2和line-1序列聯(lián)合使用，可以提高對同卵雙生子的鑒別能力，鑒別同卵雙生子的能力的累積效能，從原來的77.5%可以提升到94.2%，更好地為同卵雙生子犯罪案件的偵破提供技術(shù)支持。

（2）本發(fā)明所提供的鑒別同卵雙生子的方法，采用焦磷酸測序技術(shù)，可重復(fù)性和精確性高，成本低，可以大通量、適時、快速、直觀地進(jìn)行同卵雙生子的鑒別。

附圖說明

圖1和圖2是本發(fā)明實施例中同卵雙生子個體的igs3序列甲基化代表性結(jié)果。

圖3和圖4是本發(fā)明實施例中同卵雙生子個體的igs4序列甲基化代表性結(jié)果。

圖5和圖6是本發(fā)明實施例中同卵雙生子個體的igs5序列甲基化代表性結(jié)果。

圖7和圖8是本發(fā)明實施例中同卵雙生子個體的igs6序列甲基化代表性結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒，包括：血液dna提取試劑盒、dna甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒、pcr緩沖溶液、引物、無核酶水、焦磷酸測序試劑盒、磁珠、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、退火緩沖液和變性緩沖液；所述引物包括分別對應(yīng)靶序列igs3、igs4、igs5和igs6，用于pcr擴(kuò)增的上下游引物和測序引物。

血液dna提取試劑盒可以簡單、方便地從新鮮或長時間存放（超過24小時）的全血中分離高純度基因組dna；該試劑盒將硅膠膜技術(shù)的優(yōu)勢與微量離心形式結(jié)合在一起，同時無需采用昂貴的樹脂、乙醇沉淀，以及諸如苯酚和氯仿等有害化學(xué)成分。

dna甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒在3小時內(nèi)完全轉(zhuǎn)化富含gc的dna，兩次加熱變性的反應(yīng)步驟簡化了由未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的過程，無dna沉淀，并且通過柱層析一步完成dna的純化和脫硫，洗脫的超純dna對于一系列的分子生物分析是非常理想的。

用于pcr擴(kuò)增的上下游引物及測序引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，上游引物均采用的page純化的方法，下游標(biāo)記生物素的引物則采用反向高壓液相層析（hplc）純化的方法合成，所述上下游引物的堿基序列如下表所示。

為了更好的說明本發(fā)明實施例提供的檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法，下面通過實施例做進(jìn)一步的舉例說明。

實施例1

本發(fā)明鑒別同卵雙生子的方法，包括如下步驟：

a)雙生子血樣dna的提取、定量、分裝及保存

應(yīng)用qiagen公司的血液dna提取試劑盒提取2ml血液樣本的dna，應(yīng)用核酸蛋白定量儀對所提取的dna進(jìn)行檢測，并記錄下每個樣本dna的濃度與純度，分裝于-20°c保存。

b)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

1)加入130μl的ct轉(zhuǎn)化試劑于20μldna樣品中(20μl的樣品中dna含量約500ng)；

2)顛倒混勻1)中的試劑，簡短離心并均分到2個200μl的離心管中并離心；

3)把2）中的離心管放入pcr中，98℃變性10分鐘，64℃孵育2.5小時；

4)向zymo-spinic?column純化柱中加600μl的m-bindingbuffer，并把純化柱放到收集管中；

5)將3）中轉(zhuǎn)化后的樣品轉(zhuǎn)移到zymo-spinic?column純化柱中，蓋上蓋子顛倒數(shù)次混勻；

6)室溫全速離心1分鐘，棄掉收集管中的液體，擦干柱子邊緣并放回收集管中；

7)向純化柱中加入200μl的洗滌緩沖溶液，全速離心1分鐘；

8)向純化柱中加入200μl的m-desulphonationbuffer并且在室溫下放置15-20分鐘，全速離心30秒，棄掉收集管中的液體，擦干柱子邊緣并放回收集管中；

9)加200μl的m-washbuffer到純化柱中。全速離心1分鐘；

10）重復(fù)8）步驟一次，棄掉收集管中的液體，擦干柱子邊緣并放到一個新的1.5mll的離心管內(nèi)。

11)直接加10~15μl的m-elutionbuffer到純化柱底部膜上，室溫放置5分鐘，全速離心收集dna到1.5ml離心管內(nèi)。

c）轉(zhuǎn)化后的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增

本實施例采用pcr進(jìn)行擴(kuò)增（polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）。擴(kuò)增體系如下表所示。

pcr擴(kuò)增步驟：在abi9700pcr擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，熱循環(huán)參數(shù)：95°c，5min；（95°c，15sec，x°c，30sec，72°c，15sec）×48，72°c，5min。5條序列的退火溫度分別為gs1序列:58°c，gs3序列:59°c，igs1序列:54°c，igs2序列:54°c，igs3序列:55°c，igs4序列:52°c，igs1序列:54°c，igs2序列:56°c，line-1序列:50°c；，最終保持在4°c，得擴(kuò)增產(chǎn)物。

擴(kuò)增產(chǎn)物在進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)之前，需要用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行簡單驗證。通常情況下，只需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳即可。如果電泳結(jié)果得到較清晰的目的條帶，且非特異性條帶較少，則不影響測序，即可進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)。

d）確定噴堿基順序（dispensationorder）

在進(jìn)行焦磷酸測序之前，需要先獲得dispensationorder。打開pyromarkid軟件，點擊newassay，將引物設(shè)計軟件中所保存的本實驗的待分析序列引入，程序即可自動生成一個dispensationorder和預(yù)期的焦磷酸序列圖（pyrogram）。設(shè)置內(nèi)指控即任意選擇2個由“c”轉(zhuǎn)化過來的“t”，在其前面加噴一個“c”，作為檢測dna序列經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化是否完全的內(nèi)質(zhì)控，保存文件。

e）對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈分離和純化

在pcr板孔內(nèi)加入40μlbingdingbuffer，再加入步驟c）中所得的擴(kuò)增產(chǎn)物37μl，然后震蕩磁珠（beads）使其混合均勻取3μl磁珠放到pcr板相應(yīng)的孔內(nèi)，把pcr板放在thermomixer上常溫水平震蕩30分鐘，使beads與含生物素的產(chǎn)物鏈充分結(jié)合。用samplepreptool吸附被結(jié)合在磁珠上的含生物素的單鏈pcr產(chǎn)物，然后進(jìn)行純化（不關(guān)閉samplepreptool開關(guān)，依次用70%乙醇洗滌5秒、變性緩沖液中變性15秒，洗滌緩沖液中洗滌15秒），從而得到純凈的單鏈dna模板。把純化后的單鏈小心轉(zhuǎn)移至已準(zhǔn)備好的測序板內(nèi)，測序板每孔有40μl含1.6μl測序引物的退火緩沖液，烤箱80℃恒溫退火5min，冷卻至室溫待測序。

f）建立run文件進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)

打開pyromarkid軟件，點擊file主菜單區(qū)下的newruns，輸入runname等反應(yīng)的信息，選擇反應(yīng)孔，輸入相應(yīng)的樣本信息等。在tools菜單中點擊volumeinformation選項，即可顯示本次實驗需要用到的酶混合物、底物混合物和四種dntps的具體用量。向酶以及底物混合物中分別加入620μl無核酶水。將酶和底物以及四類核苷酸(a、t、c、g)按照系統(tǒng)顯示的量分別加入試劑艙指定位置，在軟件界面點擊運行鍵run即可進(jìn)行測序。

g）讀取dna甲基化信息，分析測序結(jié)果

焦磷酸測序儀自動對測序結(jié)果進(jìn)行判讀并標(biāo)記出每個甲基化位點的甲基化程度及平均甲基化水平，根據(jù)測序結(jié)果獲得的甲基化信息，以焦磷酸測序儀靈敏度5%為標(biāo)準(zhǔn)，若同卵雙生子之間甲基化水平差值大于5%，則被認(rèn)為雙生子之間有差異，小于或等于5%的視為無差異，對同卵雙生子進(jìn)行鑒別。

基因序列：igs3、igs4、igs5和igs6四條序列均位于基因間區(qū)，其染色體定位分別為chr1:114870877-114871203、chr12:67213759-67214092、chr11:5539842-5540207、chr1:56877427-56877787，其擴(kuò)增片段長度分別為152bp、141bp、109bp、168bp，可分別檢測4個、5個、3個、4個cpg位點。

如圖1和圖2所示，圖1和圖2為兩個同卵雙生子個體，igs3序列甲基化代表性結(jié)果，在cpg1、cpg2、cpg3位點上兩個體甲基化水平存在差異。

如圖3和圖4所示，圖3和圖4為兩個同卵雙生子個體，igs4序列甲基化代表性結(jié)果，在cpg1、cpg2、cpg3、cpg4、cpg5位點上兩個體甲基化水平存在差異。

如圖5和圖6所示，圖5和圖6為兩個同卵雙生子個體，igs5序列甲基化代表性結(jié)果，在cpg1、cpg2位點上兩個體甲基化水平存在差異。

如圖7和圖8所示，圖7和圖8為兩個同卵雙生子個體，igs6序列甲基化代表性結(jié)果，在cpg1、cpg2位點上兩個體甲基化水平存在差異。

由以上數(shù)據(jù)可得，本發(fā)明檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法，對同卵雙生子可以進(jìn)行鑒別，為同卵雙生子犯罪案件的偵破提供技術(shù)支持。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。

序列表

<110>河北醫(yī)科大學(xué)

<120>檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法

<130>2017

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagggttatttgagtttagtttttt26

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aaaatttacaaatttccaatctactatcc29

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttttttttttaattttgtaatgagt25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gtttttggtaggaagagggaaaaat25

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

attaaccaaaataatcttaatcacctaac29

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

aggaagagggaaaaataatta21

<210>7

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gtttttgatagggttggtttgtattg26

<210>8

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ccactaaaaaaaacaaaaacaacctaatta30

<210>9

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ggttggtttgtattgg16

<210>10

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gttgggtttatttttgttattgttgg26

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

actcttccaaaaaacccctaat22

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

atttttgttattgttggaga20