稻瘟病抗性基因Pi50及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種稻瘟病抗性基因，特別涉及一種稻瘟病抗性基因Pi50及其制備 方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是最重要的糧食作物之一，全球約有一半以上的人口以稻米為主食，而稻瘟 病菌（Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病對水稻的安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重的危害，每年都造成 嚴(yán)重的糧食損失。從農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的觀點(diǎn)來看，選育和利用抗病品種是防治稻瘟病的最 有效、最安全環(huán)保的方法，然而稻瘟病菌群體的多樣性及易變性，以及人們?nèi)狈剐曰?的充分了解和有效利用，導(dǎo)致單一抗病品種抗性的短命化（通常僅2-4年），而成為育種學(xué) 家最為棘手的問題（鄭釗等2009)。因此合理挖掘、克隆和利用廣譜抗病基因，是獲得持久、 廣譜抗病品種的重要途徑，已成為農(nóng)業(yè)科研中優(yōu)先解決的重要問題。
[0003] 迄今，人們已經(jīng)鑒定出80多個(gè)水稻稻瘟病抗性基因（Ballini et al.，2008 ;鄂 志國等2009 Jiang et al.，2012)，至少22個(gè)抗瘟基因已被克隆（Wang et al.，1999; Qu et al.，2006 ;Hayashi et al.，2010 ;Jiang et al.，2012 ;Hua et al.，2012 ;Das et al.，2012)。研宄表明，這些抗瘟基因多數(shù)是具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu) (NBS-LRR)的蛋白質(zhì)，即N-端存在核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding site, NBS)， C_端存在富亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat, LRR)。NBS結(jié)構(gòu)域可能參與信號傳導(dǎo) (Hammond-Kosack&Jones 1997)，NBS具有結(jié)合ATP或GTP以及水解酶的活性，可以激活激酶 或G蛋白（Traut et al.，1994) ;LRR結(jié)構(gòu)域的功能主要涉及到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用 (Jones&Jones, 1996 ;Dangl&Jones, 2001 ;Takken&Tameling, 2009 ;Bernoux, 2011)，推測是 抗病基因產(chǎn)物直接和病原菌無毒基因編碼的產(chǎn)物或間接產(chǎn)物相互作用的部位（Bent, 1996 ; Baker et al.，1997)。Jia et al. (2000))。通過酵母雙雜交證明AVR-Pita編碼的激發(fā)子 與Pita受體LRD區(qū)域的結(jié)合，能激活細(xì)胞內(nèi)Pita介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，直接證明了 LRR結(jié)構(gòu)域 可能就是病原菌識別的區(qū)域。
[0004] NBS-LRR基因有成簇排列的傾向，通常簇內(nèi)基因的同源性很高，與相同抗性途徑的 基因也維持著共遺傳的規(guī)律（Michelmore&Meyers, 1998 ;Leister, 2004)。水稻第6染色 體長臂的Pi2/9基因簇是科學(xué)家的研宄熱點(diǎn)，從該位點(diǎn)區(qū)域已報(bào)道并深入研宄的抗瘟基因 有屮12、？19、？1 8111(〇、？1-2及？12-1他們分布在2-9個(gè)他5-1^1?成員組成的基因簇內(nèi)。人 們證明了 Pi2、Pi9和Pi-z中單個(gè)NBS-LRR基因具有廣譜抗瘟作用（Zhou，2006, 2007 ;Dai， 2010)，其中，Pi2和Piz-t的LRR區(qū)域僅8個(gè)氨基酸殘基的差異就產(chǎn)生了不同的產(chǎn)物及抗 性（Qu et al.，2006 ;Zhou et al.，2006)。而其中更多的NBS-LRR抗病基因正在被進(jìn)一步 的挖掘和利用，該基因簇的應(yīng)用前景可觀。
[0005] 對于該區(qū)域抗病基因的克隆以及充分的認(rèn)識，可以更好地控制和降低稻瘟病菌對 水稻的危害，也是了解水稻抗稻瘟病基因成簇機(jī)制的前提。同時(shí)，可能通過對基因關(guān)鍵位點(diǎn) 的修飾和改造，拓寬植物的抗譜，或者進(jìn)行更精確地靶向育種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種稻瘟病抗性基因 Pi50〇
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述稻瘟病抗性基因Pi50的制備方法與應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述稻瘟病抗性基因Pi50的編碼蛋白。
[0009] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種稻瘟病抗性基因Pi50,其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示：
[0010] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50的長度為3099個(gè)核苷酸，能編碼1032個(gè)氨基酸的蛋 白質(zhì)；
[0011] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50的制備方法，可通過化學(xué)合成方法得到，或是設(shè)計(jì)引 物，以EBZ基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到；
[0012] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50的應(yīng)用，可將其用于選育對稻瘟病具有抗病性的水 稻；具體步驟如下：將稻瘟病抗性基因Pi50轉(zhuǎn)入易感病的水稻中，得到具有抗病性的水 稻；
[0013] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50編碼的蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0014] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50編碼的蛋白序列共計(jì)1032個(gè)氨基酸，包含2個(gè) 主要的結(jié)構(gòu)域：NBS和LRR區(qū)域，其中包括含有保守的AAA kinase結(jié)構(gòu)域的NBS區(qū)域 (170-462aa)，以及C-末端的富亮氨酸的LRR重復(fù)區(qū)域（578-1032aa)，其亮氨酸含量（67of 454)為 14. 8%。
[0015] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因 Pi50轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物中累加多 個(gè)抗病基因，而不會產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的基因組中不良基因的連鎖問題，并且 可以縮短育種時(shí)間?？共』虻目寺∈强朔鹘y(tǒng)育種中難以在植物種間轉(zhuǎn)移抗病基因的問 題的前提。本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用基于上述DNA片段獲得的抗病的轉(zhuǎn)基因植株和相 應(yīng)的種子，以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種 子?？梢酝ㄟ^有性雜交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其他的植株中。
【附圖說明】
[0016] 圖1是Pi2/9等位基因?qū)Φ疚敛【后w抗譜的比較圖。
[0017] 圖2是水稻稻瘟病抗性基因Pi50的克隆策略圖。
[0018] 圖3是通過PCR鑒定轉(zhuǎn)化體的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，泳道1和12為分子量標(biāo) 記lkb ladder、泳道2為pCambia-Pi50-N4質(zhì)粒為模板得到的PCR產(chǎn)物、泳道3為轉(zhuǎn)化受 體品種日本晴基因組DNA為模板得到的PCR產(chǎn)物、泳道4為EBZ基因組DNA為模板得到的 PCR產(chǎn)物、泳道5-11為不同的I；轉(zhuǎn)化體基因組DNA為模板得到的PCR產(chǎn)物。
[0019] 圖4是水稻對照品種和pCambia-Pi50陽性轉(zhuǎn)化體接種稻瘟病病原菌TY19七天 后的結(jié)果圖；其中，自左向右，第1條葉片是感病品種日本晴、第2條葉片是水稻抗病品種 EBZ，第3~6條葉片是pCambia-Pi50陽性轉(zhuǎn)化個(gè)體，第7條葉片是抗性品種IRBLzt-T，第 8條葉片是抗性品種IRBLz5-CA。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。在 本發(fā)明的實(shí)施例部分，闡述了 Pi50基因的抗性特征、分離克隆、功能特征以及分子鑒定，分 離的Pi50基因能夠與適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入植物體中，使該植物體帶有一定的抗性。
[0021] 本實(shí)驗(yàn)室的前期工作如下（參見 Zhu, et al. The identification of Pi50 (t)，a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9multigene family. Theor Appl Genet,2012(124):1295-1304)：
[0022] (1)抗性基因Pi50的抗性特征
[0023] 為了比較和明確Pi50與Pi2/9位點(diǎn)4個(gè)等位基因（Pi2, Pi9, Piz，Piz-t)的抗譜， 利用從廣東（85個(gè)菌株），福建（40個(gè)），湖南（41個(gè)），貴州（60個(gè)），四川（66個(gè)），遼寧 (108個(gè)），吉林（60個(gè)）和黑龍江（63個(gè)）收集的總計(jì)523個(gè)稻瘟病菌株對上述5個(gè)等位基 因的所持品種（分別是 EBZ、IRBLz5-CA、C101A51、IRBL9-W、IRBLz-Fu、IRBLz-T 和 Toride) 進(jìn)行了抗譜比較分析。結(jié)果表明，Pi50對絕大多數(shù)的廣東、廣西、四川、福建、黑龍江、吉林稻 瘟病菌群體表現(xiàn)較高的抗性（抗譜達(dá)到97. 7% )，由此說明該基因可在上述地區(qū)使用（圖 1)〇
[0024] (2)水稻稻瘟病抗性基因Pi50的克隆策略
[0025] 本實(shí)驗(yàn)室先前的定位研宄表明Pi50基因定位于與Pi2/9簇基因相同的基因組區(qū) 域；Pi50基因中NBS-LRR的成簇排列特性也與Pi2/9簇基因高度相似；進(jìn)一步抗譜分析顯 示Pi50基因與Pi2/9簇4個(gè)等位基因相似，對大部分測試菌株表現(xiàn)出相同的抗性反應(yīng)（Zhu et al.，2012);綜合上述三方面的結(jié)果推斷，Pi50也是Pi2/9的等位基因。值得注意的是， 同樣位于Pi2/9基因簇的Pi50,其對應(yīng)的?；孕》N卻與Pi2、Pi9和Piz-t的明顯不同， Pi50可以抵御Pi2/9簇其他抗病基因的致病菌的侵害，而表現(xiàn)更寬的抗譜（圖1)。圖中方 框表示，各基因型對應(yīng)的菌株為其致病型菌株，數(shù)字表示感病級別，1~3為高抗，4~6為 中感，7~9為高感。因此，本發(fā)明完成了 Pi50目標(biāo)區(qū)域電子物理圖譜的構(gòu)建。亦即，以水 稻參考品種日本晴（Nipponbare)的序列信息為基礎(chǔ)，通過生物信息學(xué)手段，把與Pi50連鎖 的、以及共分離的標(biāo)記與物理位置整合，由此構(gòu)建了目的基因區(qū)域的重疊群圖及電子物理 整合圖（圖2)。
[0026] 然后，申請人通過長片段 PCR 擴(kuò)增（Long Rangement PCR Amplification)、染 色體步移（Chromosome Working)以及同源基因品種參考序列監(jiān)控等方法，獲得了優(yōu)異抗 源品種28 占（EBZ，華南稻區(qū)，已在文獻(xiàn)"Zhu, et al.The identification of Pi50(t), a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9multigene family. Theor Appl Genet, 2012 (124) : 1295-1304"公開）包含Pi50位點(diǎn)區(qū)域的超過lOOkb基因組序列，通過 FGenesh預(yù)測，該區(qū)域包括了 9個(gè)以上編碼NBS-LRR類蛋白的基因（申請人未發(fā)表數(shù)據(jù)）。 依據(jù)該數(shù)據(jù)，本發(fā)明進(jìn)行如下工作。
[0027] 實(shí)施例1稻瘟病抗性基因Pi50的分析和確定
[0028] 一、水稻稻瘟病抗性基因Pi50候選基因的注釋及序列分析
[0029] 為了確定Pi50