除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，所述基因包括：(a)編碼SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列互補的核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)特別適合在植物中表達(dá)，尤其定位于葉綠體中表達(dá)，可以增強(qiáng)對麥草畏除草劑的耐受性，且應(yīng)用前景廣。
【專利說明】
除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，特別是設(shè)及一種對除草 劑麥草畏具有耐受性的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 雜草可W迅速耗盡±壤中作物和其它目的植物所需要的有價值的養(yǎng)分。盡管目前 可W得到耐受除草劑草甘麟、草下麟、2,4-D和其它除草劑處理的轉(zhuǎn)基因植物，但是還存在 空白區(qū)域，如所控制的雜草范圍、開發(fā)額外的除草劑耐受性作物等。此外，耐受上述除草劑 的雜草的出現(xiàn)(盡管通常是局部的和可變的)造成了對額外或備選的雜草控制措施的需要。
[0003] 已經(jīng)證明耐受除草劑性狀在商業(yè)上是有價值的，因此需要增加耐受其它除草劑的 植物和管理難W控制的雜草種類的選項，W避免過度依賴任何單一除草劑，尤其需要針對 環(huán)境友好的并且在控制雜草方面高度有效的除草劑而開發(fā)除草劑耐受性。麥草畏是有效且 環(huán)境友好的除草劑之一，其已經(jīng)被農(nóng)民使用40多年了，麥草畏可用于控制玉米、高梁、小米、 牧草、干草、牧場、甘薦、蘆算、草皮和草巧作物中一年生和多年生闊葉雜草和幾種窄葉雜 草;與此同時，麥草畏可W傷害許多商業(yè)作物和雙子葉植物，如大豆、棉花、魏豆、馬鈴馨、向 日葵和油菜，上述作物/植物對于低水平的麥草畏都是特別敏感的。盡管如此，麥草畏在控 制雜草生長中仍然是有效的，并且是重要的。
[0004] 已報道從嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltopMlia)分離了編碼麥草畏單加氧 酶(DMO)的基因，其為鐵氧還蛋白依賴型并賦予對麥草畏的耐受性。DMO參與將除草劑麥草 畏(3,6-二氯-鄰-茵香酸)轉(zhuǎn)化為無毒的3,6-二氯水楊酸(DCSA)，表達(dá)DMO基因的植物具有 對麥草畏的耐受性。
[0005] 由于目前發(fā)現(xiàn)的麥草畏耐受型基因均極其相似，所W需要更多新型的麥草畏耐受 型基因W避免過度依賴一種麥草畏耐受型基因，使麥草畏-麥草畏耐受型作物在商業(yè)上具 有更廣闊的應(yīng)用空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，所述MTHFR66蛋 白在植物中對麥草畏除草劑具有較高的耐受性。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基因，包括：
[000引（a)編碼SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核巧酸序列;或
[0009] (b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核巧酸序列互補的核巧酸序列;或
[0010] (C)沈Q ID NO: 1所示的核巧酸序列。
[001 U 所述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC術(shù)樣酸鋼）、0.5%SDS(十二烷基硫酸鋼）溶液中，在 65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1XSSC、0.1%SDS各洗膜1次。
[0012]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控 下的所述基因。
[0013] 進(jìn)一步地，所述調(diào)控序列為葉綠體轉(zhuǎn)運膚，所述葉綠體轉(zhuǎn)運膚與所述基因有效連 接。
[0014] 優(yōu)選地，所述葉綠體轉(zhuǎn)運膚的核巧酸序列具有SEQ ID N0:7所示的核巧酸序列。
[0015] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述基因或所述表達(dá)盒的重組載體。
[0016] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種增加耐受除草劑范圍的方法，包括:將SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)在植物中與至少一種 不同于SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)的第二種 蛋白質(zhì)一起表達(dá)。
[0017] 進(jìn)一步地，所述第二種蛋白質(zhì)為草甘麟耐受性蛋白質(zhì)、草錠麟耐受性蛋白質(zhì)、a酬 戊二酸雙加氧酶、4-徑苯基丙酬酸雙加氧酶、乙酷乳酸合酶、細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)或原化嘟原 氧化酶。
[001引在本發(fā)明中，MTHFR66除草劑抗性蛋白質(zhì)在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可W伴隨著 一個或多個草甘麟耐受性蛋白質(zhì)和/或草錠麟耐受性蛋白質(zhì)的表達(dá)。運種超過一種的除草 劑耐受性蛋白質(zhì)在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可W通過遺傳工程使植物包含并表達(dá)所 需的基因來實現(xiàn)。另外，一種植物(第1親本)可W通過遺傳工程操作表達(dá)MTHFR66除草劑抗 性蛋白質(zhì)，第二種植物(第2親本)可W通過遺傳工程操作表達(dá)草甘麟耐受性蛋白質(zhì)和/或草 錠麟耐受性蛋白質(zhì)。通過第1親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第1親本和第2親本的所有基 因的后代植物。
[0019] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，包括:用所述 基因或所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化多個植物細(xì)胞，并在允許表達(dá)所述基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生 長，而殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的除草劑濃度下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述除草劑 為麥草畏。
[0020] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制雜草的方法，包括:對種植植物的大田 施用有效劑量的麥草畏除草劑，所述植物包含所述基因、所述表達(dá)盒或所述重組載體。
[0021] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方 法，包括:將所述基因、所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保 護(hù)其免受麥草畏損害量的除草劑耐受性蛋白質(zhì)。
[0022] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種賦予植物麥草畏除草劑耐受性的方法，包 括:將所述基因、所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。
[0023] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制草甘麟耐性植物的大田中草甘麟耐受 性雜草的方法，包括:對種植草甘麟耐受性植物的大田施用有效劑量的麥草畏，所述草甘麟 耐受性植物包含所述基因、所述表達(dá)盒或所述重組載體。
[0024] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生麥草畏耐受性植物的方法，包括向所 述植物的基因組中引入所述基因或所述表達(dá)盒，W產(chǎn)生麥草畏耐受性植物。
[0025] 具體地，所述產(chǎn)生麥草畏耐受性植物的方法包括:通過將親本植物自交或與第二 種植物雜交而產(chǎn)生麥草畏耐受性植物，所述親本植物和/或第二種植物包含所述基因或所 述表達(dá)盒，所述麥草畏耐受性植物遺傳了來自所述親本植物和/或第二種植物的所述基因 或所述表達(dá)盒。
[0026] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)對麥草畏除草劑具有耐受性的植物的 方法，包括：
[0027] 種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括所述基因或所述表達(dá)盒；
[0028] 使所述植物種子長成植株；
[0029] 用有效劑量麥草畏除草劑噴灑所述植株，收獲與其他不具有所述基因或所述表達(dá) 盒的植株相比具有減弱的植物損傷的植株。
[0030] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選地，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜 或甘薦。
[0031] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種甲基四氨葉酸還原酶耐受麥草畏除草劑的 用途，所述甲基四氨葉酸還原酶具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0032] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生甲基四氨葉酸還原酶的植物耐受麥草 畏除草劑的用途，所述甲基四氨葉酸還原酶具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0033] 將所述的基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，在本發(fā)明中為將外源 DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將 DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須娃介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0034] 本發(fā)明可W增加植物對于氧化應(yīng)激的耐受性，包括但不限于，向植物群提供麥草 畏或麥草畏單加氧酶所介導(dǎo)代謝的產(chǎn)物或其類似物，W改善植物的除草劑耐受性，例如，通 過將麥草畏代謝為DCSA。
[0035] 本發(fā)明"麥草畏"（Dicamba)是指3,6-二氯-鄰-茵香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲 酸及其酸和鹽。其鹽包括異丙胺鹽、二甘醇錠鹽、二甲胺鹽、鐘鹽和鋼鹽。麥草畏的商業(yè)制劑 包括但不限于，Baiwel⑥（作為DMA鹽）、Clarity? (BASF,作為DGA鹽）、VEレ58-cs-ll?和 伯Iiq 地 Sh? (BASF，作為DGA鹽）。
[0036] 目前已經(jīng)報道的含甲氧基芳控化合物脫甲基酶有4種，分別是（1)畑OsUieske非 血紅素型氧化酶），降解麥草畏的DMO(GenBank: AY786443.1)屬于S組份畑0類型的氧化酶； (2)細(xì)胞色素P450，是一類亞鐵血紅素一硫醇鹽蛋白的超家族，它參與內(nèi)源性物質(zhì)和包括藥 物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝，很多含甲氧基芳控化合物脫甲基酶就是運一類 型；（3 )厭氧型四氨葉酸依賴型脫甲基酶，發(fā)現(xiàn)于厭氧細(xì)菌如熱醋穆爾氏菌 (Moorel Iathermoacetica)中，參與木質(zhì)素降解中間產(chǎn)物如下香酸和香草酸的厭氧降解，也 有研究發(fā)現(xiàn)厭氧型四氨葉酸依賴型脫甲基酶也可W厭氧降解麥草畏；（4)好氧型四氨葉酸 依賴型的脫甲基酶（S地ingomonas paucimobilis SYK-6)，參與木質(zhì)素降解中間產(chǎn)物如下 香酸和香草酸的厭氧降解，但目前還沒有運類好氧型四氨葉酸依賴型脫甲基酶能降解麥草 畏的報道。
[0037] MTHFR為5, lO-methylenetetr址y化ofolate reductase,亞甲基四氨葉酸還原酶 蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5,10-亞甲基四氨葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué) 功能的5-甲基四氨葉酸及其逆反應(yīng)。
[0038] 本發(fā)明所述基因用于植物表達(dá)后具有允許在植物中使用麥草畏除草劑的特性，所 述植物中固有耐性不存在或不足W允許使用麥草畏除草劑。此外，本發(fā)明所述MTHFR66基因 可W在天然耐性不足W允許選擇性時在植物中提供對麥草畏除草劑的防護(hù)。向田地使用的 施用量是大約0.0025磅/英畝Qb/a)到大約2(Ub/a麥草畏，更通常從0.25化/a至12化/曰。在 同一大田里(連續(xù)或罐混組合地)組合不同化學(xué)類別和具有不同作用模式和范圍的除草劑 可W提供對大多數(shù)需要除草劑控制的潛在雜草的控制。
[0039] 草甘麟被廣泛地使用，因為它控制非常廣譜的闊葉和禾本科雜草物種。然而，在草 甘麟耐性作物和非作物應(yīng)用中重復(fù)使用草甘麟已經(jīng)(而且仍將繼續(xù))選擇使雜草演替為天 然更具有耐性的物種或草甘麟耐受性生物型。多數(shù)除草劑耐受性管理策略建議使用有效用 量的罐混除草劑伴侶作為延緩出現(xiàn)耐受性雜草的方法，所述除草劑伴侶提供對同一物種的 控制，但具有不同的作用模式。將MTHFR66基因與草甘麟耐性性狀(和/或其他除草劑耐受性 性狀)疊加可通過允許對同一作物選擇性使用草甘麟和麥草畏而實現(xiàn)對草甘麟耐受性作物 中草甘麟耐受性雜草物種(被麥草畏控制的闊葉雜草物種）的控制。運些除草劑的應(yīng)用可W 是在含有不同作用模式的兩種或更多除草劑的罐混合物中同時使用、在連續(xù)使用（如種植 前、出苗前或出苗后）中單個除草劑組合物的單獨使用(使用的間隔時間范圍從2小時到3個 月），或者備選地，可W在任何時間（從種植作物7個月內(nèi)到收獲作物時(或?qū)τ趩蝹€除草劑 為收獲前間隔，取最短者））使用代表可應(yīng)用每種化合類別的任意數(shù)目除草劑的組合。
[0040] 在控制闊葉雜草中具有靈活性是很重要的，即使用時間、單個除草劑用量和控制 頑固或耐受性雜草的能力。作物中與草甘麟耐受性基因/MTHFR66基因疊加的草甘麟應(yīng)用范 圍可W從250至2500g ae/ha;麥草畏可按照從0.25化/a至12化/a。運些應(yīng)用的時間的最佳 組合取決于具體的條件、物種和環(huán)境。
[0041] 除草劑制劑(如醋、酸或鹽配方或可溶濃縮劑、乳化濃縮劑或可溶液體)和罐混添 加劑(如佐劑或相容劑)可顯著影響給定的除草劑或一種或多種除草劑的組合的雜草控制。 任意前述除草劑的任意化學(xué)組合均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0042] 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，兩種或更多作用模式的組合在提高受控雜草譜和/或 天然更具耐受性物種或耐受性雜草物種上的益處還可擴(kuò)展到通過人工（轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基 因）在作物中產(chǎn)生除草甘麟耐性作物外的除草劑耐性的化學(xué)品。事實上，可W單獨或W多重 組合疊加編碼W下耐受性的性狀W提供有效控制或防止雜草演替對任意前述類別的除草 劑的耐受性的能力:草甘麟耐受性(如耐受性植物或細(xì)菌6?5?5、60乂、641')、草錠麟耐受性 (如PAT、Bar )、苯氧基生長素耐受性(如2，4-D、二甲四氯耐受性基因如AAD-I、AAD-12等）乙 酷乳酸合酶(ALS)抑制性除草劑耐受性(如咪挫嘟酬、橫酷脈、S挫喀晚、橫苯胺、喀晚硫代 苯甲酸和其它化學(xué)品耐受性基因如AHAS、Csr 1、SurA等）、漠草臘耐受性(如Bxn )、對HPPD (4- 徑苯基丙酬酸雙加氧酶)酶抑制劑的耐受性、對八氨番茄紅素去飽和酶(PDS)抑制劑的耐受 性、對光系統(tǒng)n抑制性除草劑的耐受性(如PSbA)、對光系統(tǒng)I抑制性除草劑的耐受性、對原 化嘟原氧化酶K(PPO)抑制性除草劑耐受性（如PPO-I )、對苯脈除草劑的耐受性（如 CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶等等。
[0043] 關(guān)于其他除草劑，一些其它優(yōu)選的ALS抑制劑包括S挫喀晚橫苯胺(氯醋橫草胺、 雙氯橫草胺、挫喀橫草胺、橫草挫胺和喀晚并=挫類橫胺）、喀晚硫代苯甲酸和氣挫橫隆。一 些優(yōu)選的HPPD抑制劑包括甲基橫草酬、異惡挫草酬和橫草酬。一些優(yōu)選的PPO抑制劑包括丙 烘氣草胺、氣丙喀草醋、挫草酬、甲橫草胺和二苯酸(如=氣簇草酸、氣橫胺草酸、乳氣禾草 靈和乙氧氣草酸）。
[0044] 此外，可W將MTHFR66基因單獨或與其它除草劑耐受作物特征疊加后再與一種或 多種其它輸入(如昆蟲耐受性、真菌耐受性或脅迫耐性等)或輸出（如提高的產(chǎn)量、改進(jìn)的油 量、提高的纖維品質(zhì)等)性狀疊加。因此，本發(fā)明可用于提供W靈活且經(jīng)濟(jì)地控制任何數(shù)目 的農(nóng)學(xué)害蟲的能力和提高作物品質(zhì)的完整農(nóng)學(xué)解決方案。
[0045] 本發(fā)明MTHFR66基因能降解麥草畏除草劑，是重要的除草劑耐受作物和選擇標(biāo)記 物特征可能性的基礎(chǔ)。
[0046] 本發(fā)明可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，可W控制幾乎所有闊葉雜草的除草劑組合。MTHFR66基 因可作為優(yōu)秀的除草劑耐受作物性狀與例如其它除草劑耐受作物性狀(如草甘麟耐受性、 草錠麟耐受性、苯氧基生長素耐受性、ALS抑制劑(如咪挫嘟酬類、橫酷脈類、=挫并喀晚橫 酷胺類)耐受性、漠草臘耐受性、HPPD抑制劑耐受性、PPO抑制劑耐受性等)和昆蟲耐受性性 狀(CrylAb、CrylF、Vip3、其它蘇云金芽抱桿菌蛋白質(zhì)或非芽抱桿菌屬來源的昆蟲耐受性蛋 白等)疊加。此外，MTHFR66基因可作為選擇標(biāo)記物輔助選擇用另一個基因或基因群遺傳改 造的植物的原代轉(zhuǎn)化體。
[0047] 本發(fā)明的除草劑耐性作物性狀可用在與其它除草劑耐性作物性狀(包括但不限于 草甘麟耐性)的新組合中。由于對除草劑(如草甘麟)的新獲得的耐受性或固有的耐性，運些 性狀組合產(chǎn)生控制雜草物種的新方法。因此，除了除草劑耐性作物性狀，本發(fā)明的范圍包括 使用除草劑控制雜草的新方法，其中通過轉(zhuǎn)基因作物中的所述酶產(chǎn)生對所述除草劑的耐 性。
[0048] 本發(fā)明可應(yīng)用于多種植物中，如擬南芥、煙草、大豆、棉花、稻、玉米和蕓臺。本發(fā)明 還可用于多種其它單子葉（如牧草禾本科或草坪草禾本科)和雙子葉作物(如首猜、=葉草、 喬木物種等）。類似的，麥草畏(或其它MTHFR66底物)可更積極地用于耐性適中的禾本科作 物中，由此性狀得到的提高的耐性將為種植者提供能W更有效的用量和更廣的施用時間來 使用運些除草劑而無作物損傷風(fēng)險的可能性。
[0049] 本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物 細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
[0050] 本發(fā)明中所述"耐受性"和所述"抗性"是可遺傳的，并允許植物在除草劑對給定植 物進(jìn)行一般除草劑有效處理的情況下生長和繁殖。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)可的，即使植 物受到除草劑處理的一定損傷程度明顯，植物仍可被認(rèn)為"耐受性"或"抗性"。本發(fā)明中術(shù) 語"耐性"比術(shù)語"耐受性"更廣泛，并包括"耐受性"，W及特定植物具有的抵抗除草劑誘導(dǎo) 的各種程度損傷的提高的能力，而在同樣的除草劑劑量下一般導(dǎo)致相同基因型野生型植物 損傷。
[0051] 本發(fā)明中所述的多核巧酸和/或核巧酸形成完整"基因"，在所需宿主細(xì)胞中編碼 蛋白質(zhì)或多膚。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識到，可W將本發(fā)明的多核巧酸和/或核巧酸置于 目的宿主中的調(diào)控序列控制下。
[0052] 本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運膚、終止子、增強(qiáng)子、前導(dǎo)序列、 內(nèi)含子W及其它可操作地連接到所述MTHFR66基因的調(diào)節(jié)序列。
[0053] 所述啟動子為植物中可表達(dá)的啟動子，所述的"植物中可表達(dá)的啟動子"是指確保 與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動子。植物中可表達(dá)的啟動子可為組成型 啟動子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動子的示例包括但不限于，來源于花挪菜花葉病毒的 35S啟動子、玉米Ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動子可 為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表 達(dá)水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗進(jìn)行測定），如PEP簇化酶啟動子。備選地， 植物中可表達(dá)的啟動子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)模式 的啟動子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲哨食引起的創(chuàng)傷時，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表 達(dá)較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子的示例包括但不限于，馬鈴馨和西紅柿 的蛋白酶抑制基因（pin巧PpinII)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。
[0054] 所述轉(zhuǎn)運膚(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄校┦侵笇?dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器 或細(xì)胞區(qū)室，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運膚可W是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運膚 序列祀向葉綠體，包括但不限于擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)運膚AtCTP2,或者利用'邸EL'保留序列祀 向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP祀向液泡。
[0055] 所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列（腦屯、肌炎病 毒5 '非編碼區(qū)）；馬鈴馨Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV(玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列;人類免疫 球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);首猜花葉病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。
[0056] 所述增強(qiáng)子包含但不限于，花挪菜花葉病毒(CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒(FMV)增 強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(CERV)增強(qiáng)子、木馨脈花葉病毒(CsVMV)增強(qiáng)子、紫萊莉花葉病毒 (MMV)增強(qiáng)子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨巧 草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生稱綠線條花葉病毒(P化SV)增強(qiáng)子。
[0057] 對于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛 素內(nèi)含子、A化內(nèi)含子1、薦糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對于雙子葉植物應(yīng)用而言，所 述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-I內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和"超級泛素"內(nèi)含 子。
[0058] 所述終止子可W為在植物中起作用的適合多聚腺巧酸化信號序列，包括但不限 于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)姻脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺巧酸化 信號序列、來源于蛋白酶抑制劑n (Pinn)基因的多聚腺巧酸化信號序列、來源于魏豆 ssRUBISCO E9基因的多聚腺巧酸化信號序列和來源于a-微管蛋白（a-tubulin)基因的多聚 腺巧酸化信號序列。
[0059] 本發(fā)明中所述"有效連接"表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對 相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述"有效連接"可W為將啟動子與感興趣的序列相 連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且 想要獲得該蛋白的表達(dá)時"有效連接"表示：啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到 的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白 的表達(dá)時，制造運樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始 密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表 達(dá)時，制造運樣的連接，使得5'非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)， 并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀 碼框的。可W "有效連接"的核酸序列包括但不限于:提供基因表達(dá)功能的序列（即基因表達(dá) 元件，例如啟動子、5'非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3'非翻譯區(qū)域、聚腺巧化位點和/ 或轉(zhuǎn)錄終止子）、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列（即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶 識別位點、整合酶識別位點）、提供選擇性功能的序列（即抗生素耐受性標(biāo)記物、生物合成基 因）、提供可計分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列（即多接頭序列、位點 特異性重組序列）和提供復(fù)制功能的序列（即細(xì)菌的復(fù)制起點、自主復(fù)制序列、著絲粒序 列）。
[0060] 本發(fā)明可賦予植物新除草劑耐受性性狀，并且未觀察到對表型包括產(chǎn)量的不良影 響。本發(fā)明中植物能耐受住如至少一種受試除草劑1倍的應(yīng)用水平。運些耐性水平的提高在 本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如可對本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行可預(yù)見到的優(yōu)化和進(jìn)一步發(fā)展， W增加給定基因的表達(dá)。
[0061] 本發(fā)明中，所述除草劑抗性蛋白質(zhì)為MTHFR66氨基酸序列，如序列表中SEQ ID NO: 2所示。所述除草劑抗性基因為MTHFR66核巧酸序列，如序列表中SEQ ID N0:1所示。所述除 草劑抗性基因為用于植物，除了包含由MTHFR66核巧酸序列編碼的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)外，也可 包含其他元件，例如編碼轉(zhuǎn)運膚的編碼區(qū)、編碼選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或賦予昆蟲耐受性的 蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。
[0062] 本發(fā)明中MTHFR66除草劑抗性蛋白質(zhì)對麥草畏除草劑具有耐性。本發(fā)明中的植物， 在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含MTHFR66核巧酸序列，通過表達(dá)有效量的該蛋 白而保護(hù)其免受除草劑的威脅。有效量是指未損傷的或輕微損傷的劑量。同時，植物在形態(tài) 上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)W用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。
[0063] 本發(fā)明提供了一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，具有W下優(yōu)點：
[0064] 1、對除草劑耐受性強(qiáng)。本發(fā)明MTHFR66基因可W降解麥草畏除草劑，優(yōu)化MTHFR66 基因采用玉米和大豆的偏好密碼子，使其特別適合在植物中表達(dá);優(yōu)化MTHFR66基因可W賦 予轉(zhuǎn)基因植物麥草畏除草劑耐受性，且所述優(yōu)化MTHFR66基因定位于葉綠體中表達(dá)可W增 強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對麥草畏除草劑的耐受性。
[0065] 2、應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)MTHFR66為甲基四氨葉酸還原酶，其不 同于已知的麥草畏耐受型基因，因此可W擴(kuò)大麥草畏耐受型在植物上應(yīng)用范圍。
[0066] 下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【附圖說明】
[0067] 圖1為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的MTHFR66基因在表達(dá)宿主菌 BL21 (DE3)中表達(dá)的蛋白SDS-PAGE電泳圖；
[0068] 圖2為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的誘導(dǎo)表達(dá)的MTHFR66蛋白降 解麥草畏的HPLC圖譜；
[0069] 圖3為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的誘導(dǎo)表達(dá)的MTHFR66蛋白在 不同濃度的四氨葉酸條件下降解麥草畏的HPLC圖譜；
[0070] 圖4為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的誘導(dǎo)表達(dá)的MTHFR66蛋白代 謝5-甲基四氨葉酸的HPLC圖譜；
[0071] 圖5為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的誘導(dǎo)表達(dá)的MTHFR66蛋白代 謝5-甲基四氨葉酸的中間產(chǎn)物鑒定一級質(zhì)譜圖；
[0072] 圖6為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有優(yōu)化MTHFR66核巧酸序 列的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；
[0073] 圖7為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有優(yōu)化MTHFR66核巧酸序 列的重組表達(dá)載體DBNl 11101構(gòu)建流程圖；
[0074] 圖8為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有天然MTHFR66核巧酸序 列的重組表達(dá)載體DBNl 11 IOlN結(jié)構(gòu)示意圖；
[0075] 圖9為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因擬南芥Tl植株除草 劑耐受性效果圖；
[0076] 圖10為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有優(yōu)化MTHFR66核巧酸 序列的重組表達(dá)載體DBN-HT130066構(gòu)建流程圖；
[0077] 圖11為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有天然MTHFR66核巧酸 序列的重組表達(dá)載體DBN-HT130066N結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0078] 下面通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的 技術(shù)方案。
[0079] 第一實施例、甲基四氨葉酸還原酶MTHFR66的體外高效表達(dá)及功能鑒定
[0080] 1、細(xì)菌表達(dá)載體的構(gòu)建和重組微生物獲得 [0081 ] (1)MTHFR66 基因的 PCR 擴(kuò)增
[00劇設(shè)計一對引物：
[0083] 引物 1:5-GGAATTCCATATGGGCTCGCCCGTTATGG-3 (下劃線為Nde I酶切位點），如序列 表中沈Q ID NO:4所示；
[0084] 引物2:5-CCGCTCGAGGTGCTTTCGAGCGTAGTCAG-3 (下劃線為趾〇I酶切位點，如序列表 中沈Q ID NO:5所示；
[0085] 用下述PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增MTHFR66基因：
[0086]
12345 模板DNA(即天然MTHFR66核巧酸序列）如序列表中SEQ ID N0:3所示。PCR反應(yīng)條件 為:98°C變性Imin;然后進(jìn)入下列循環(huán):98°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸Imin,共29個 循環(huán);最后72°C延伸lOmin，冷卻至室溫。 2
[008引（2)細(xì)菌表達(dá)載體的構(gòu)建和重組微生物獲得 3 用限制性內(nèi)切酶NdeI和趾Ol分別酶切上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和細(xì)菌表達(dá)載體pET-29a ( + )，將切下的MTHFR66核巧酸序列片段與酶切后的細(xì)菌表達(dá)載體祀T-29a( + )進(jìn)行酶連，將 酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌化21 (DE3)，獲得重組微生物化21 (MTHFR66)。 4 2、MTHFR66蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化 5 所述重組微生物化2UMTHFR66)在IOOmL的LB培養(yǎng)基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物 5g/L，化C110g/L，卡那霉素100mg/L，用化0H調(diào)pH至7.5)中培養(yǎng)至濃度為0D600nm = 0.6- 0.8,加入濃度為0.4mM的異丙基硫代半乳糖巧（IPTG)，在溫度16°C下誘導(dǎo)20小時。離屯、，收 集菌體，用 20ml Tris-HCl buffer(100mM，pH 8.0)重懸菌體，超聲破碎（X0-900D ultrasonic processor ultrasonic processor,30%intensity)lOmin，然后離屯、，收集上 清，用儀離子親和層析柱對MTHFR66蛋白進(jìn)行純化，用SDS-PAGE蛋白電泳檢測純化結(jié)果，條 帶大小和理論預(yù)測的條帶大小(31.79kDa)-致(如圖1所示）。
[0092] 3、測定MTHFR66蛋白的酶活力
[OOW] 酶活反應(yīng)體系（300化）：含有ImM底物（麥草畏）、0.2mg MTHFR66、lmM四氨葉酸 (THF)，緩沖體系為濃度1 OOmM的化iS-肥1 (抑8.0)，溫度30°C下在水浴鍋中反應(yīng)1小時，然 后在沸水中放置Imin，終止反應(yīng)。反應(yīng)液冷凍干燥后加入30化L甲醇溶解凍干物，高效液相 色譜化PLC)檢測麥草畏中間代謝產(chǎn)物3,6-二氯水楊酸(DCSA)的生成量。一個酶活力單位定 義為:在抑8.0、溫度30°C條件下Imin內(nèi)降解麥草畏生成Inmol產(chǎn)物DCSA所需要酶的量，Wu 表不。
[0094] 上述實驗結(jié)果表明：純化后的MT冊R66蛋白能在1小時內(nèi)產(chǎn)生0.15mM的DCSA， MTHFR66蛋白的比酶活為3.7抓/mg(如圖2所示）。
[00M] 4、測定MTHFR66蛋白在微量四氨葉酸存在條件下的麥草畏脫甲基功能
[0096] 酶活反應(yīng)體系（300化）：含有ImM底物(麥草畏）、0.2mg MTHFR66和分別含O.OlmM、 0.02mM、0.OSmM和ImM四氨葉酸(THF)，緩沖體系為濃度IOOmM的Tris-肥KpH 8.0)，溫度30 °C下在水浴鍋中反應(yīng)1小時，然后在沸水中放置Imin，終止反應(yīng)。反應(yīng)液冷凍干燥后加入300 化甲醇溶解凍干物，高效液相色譜化PLC)檢測麥草畏中間代謝產(chǎn)物DCSA的生成量。
[0097] 上述實驗結(jié)果表明：純化后的MTHFR66蛋白在0.0 lmM的四氨葉酸存在時，就能夠?qū)?麥草畏脫甲基形成DCSA，在0.5mM的四氨葉酸存在時能夠?qū)mM的麥草畏全部脫甲基產(chǎn)生 DCSA(如圖3所示）。
[009引第二實施例、甲基四氨葉酸還原酶MTHFR66的水解酶功能鑒定及產(chǎn)物鑒定
[0099] 1、MTHFR66蛋白的水解酶功能測定
[0100] 酶活反應(yīng)體系（300化）：含有0.2mg MTHFR66、lmM 5-甲基四氨葉酸巧-C曲-H4F)，緩 沖體系為濃度IOOmM的化iS-HCl(pH 8.0)，溫度30°C下在水浴鍋中反應(yīng)1小時，然后在沸水 中放置Imin，終止反應(yīng)。反應(yīng)液冷凍干燥，干燥物加入30化L的0.1mol/L的K此P〇4(pH 6.8， 1%抗壞血酸、〇.l%0-琉基乙醇）溶解，用濾膜(孔徑0.22WI1)過濾，采用高效液相色譜進(jìn)行 檢測。液相色譜條件為：流動相為0.05mol/L的K此P〇4(pH 3.0):乙臘（90:10，V/V) ,Zorbax C2180DS S地erex反相柱（5皿，4.6mm X 250mm，Agi lent，USA)，柱溫為23°C，紫外檢測器，測 定波長為298nm，進(jìn)樣量為20化，流速為1. OmL/min。外標(biāo)法按峰面積定量。
[0101] 上述HPLC結(jié)果表明：純化后的MTHFR66蛋白能夠在沒有電子受體NAD+存在的條件 下，將5-甲基四氨葉酸轉(zhuǎn)化成其他的物質(zhì)(如圖4所示）。
[0102] 2、產(chǎn)物鑒定
[0103] 代謝產(chǎn)物通過HPLC-MS(高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用）進(jìn)行鑒定，條件為：流動相為 0.05mol/L的KH2P〇4(pH 3.0):乙臘（90:10，V/V) ,Zorbax XDB-C18，5cmX0.46畑1，1.8mm反相 柱（5皿，4.6mmX250mm，Agilent，USA)，流速為0.25mL/min。MS分析使用ESI模式，檢測器為 Agilent G6410B Triple Quad Mass Spectrometer〇
[0104] 結(jié)果表明：純化后的MTHFR66蛋白能夠在沒有電子受體NAD+的條件下將5-甲基四 氨葉酸水解產(chǎn)生四氨葉酸(如圖5所示）。
[0105] 第=實施例、基因序列的優(yōu)化和合成
[0106] 1、植物優(yōu)化序列的獲得
[0107] 保持所述甲基四氨葉酸還原酶MTHFR66的氨基酸序列（289個氨基酸，如序列表中 SEQ ID NO: 2所示)不改變，對編碼相應(yīng)于所述甲基四氨葉酸還原酶MTHFR66的氨基酸序列 的MTHFR66核巧酸序列(870個核巧酸)進(jìn)行密碼子優(yōu)化改造。
[0108] 密碼子優(yōu)化改造的策略主要包括:依據(jù)單子葉植物玉米和雙子葉植物大豆的偏好 密碼子、不穩(wěn)定序列的改造、G+C含量的提高等。天然基因的G+C含量較低，A巧含量很高，一 方面，如果直接將天然基因序列導(dǎo)入植物基因組中可能會被誤認(rèn)為是植物基因調(diào)控序列， 同時在運些天然基因中會出現(xiàn)A+T富含區(qū)域，類似于基因啟動子中的TATA盒，運些區(qū)域則會 導(dǎo)致基因的異常轉(zhuǎn)錄;另一方面，在轉(zhuǎn)錄的mRNA中聚腺巧酸化信號序列(AAUAAA)、與mRNA剪 接相關(guān)的小RNA互補序列會導(dǎo)致RNA不穩(wěn)定。因此，改造后的基因序列除了有較高的G+C含量 夕h還改變DNA和轉(zhuǎn)錄成mRNA中出現(xiàn)的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而保證蛋白的正常翻譯;再一方面，應(yīng) 用玉米和大豆的偏好密碼子改造天然基因序列，排除酶切位點和一些序列的修飾。
[0109] 基于W上優(yōu)化策略，得到優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列，優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列共含 有870個核巧酸，編碼289個氨基酸，其核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0110] 2、合成優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列
[0111] 優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;合成的所述優(yōu)化 MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID NO: 1)的5'端還連接有SacI酶切位點，所述優(yōu)化MTHFR66核巧 酸序列（SEQ ID NO: 1)的3'端還連接有KasI酶切位點。
[0112] 第四實施例、擬南芥重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0113] 1、構(gòu)建含有優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的擬南芥重組克隆載體
[0114] 將合成的優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列連入克隆載體pGEM-T(Promega，Madison，USA， CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T載體說明書進(jìn)行，得到重組克隆載體 DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖6所示(其中，Amp表示氨節(jié)青霉素抗性基因；fl表示隧菌體n的復(fù) 制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；17為T7RNA聚合酶啟動子； mMTHFR66為優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列(SEQ ID N0:1);MCS為多克隆位點）。
[0115] 然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞(Transgen， Bei jing，化ina，CAT:CD501)，其熱激條件為:50化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10化質(zhì)粒DNA(重 組克隆載體DBNOI-T )，42 °C水浴30秒;37 °C振蕩培養(yǎng)1小時（100巧m轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動），在表 面涂有IPTG(異丙基硫代-P-D-半乳糖巧)和X-gal (5-漠-4-氯-3-日引噪-P-D-半乳糖巧）的氨 節(jié)青霉素（lOOmg/L)的LB平板(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/L，化Cl lOg/L，瓊脂15g/L， 用化OH調(diào)抑至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取 物5g/L，化Cl lOg/L，氨節(jié)青霉素lOOmg/L，用化OH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過 夜。堿法提取其質(zhì)粒:將菌液在1200化pm轉(zhuǎn)速下離屯、Imin,去上清液，沉淀菌體用10化1冰預(yù) 冷的溶液I (25mM hiS-HCl，IOmM EDTA(乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，P冊.0)懸浮;加入200 化新配制的溶液II (0.2M化OH，1 % SDS(十二烷基硫酸鋼）），將管子顛倒4次，混合，置冰上 3-5min;加入15化L冰冷的溶液III(3M醋酸鐘，5M醋酸），立即充分混勻，冰上放置5-lOmin; 于溫度4 °C、轉(zhuǎn)速1200化pm條件下離屯、5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫 放置5min;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速120(K)rpm條件下離屯、5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70% 的乙醇洗涂后驚干；加入30化含RNase (20yg/mL)的TE(IOmM IYiS-肥1，ImM EDTA，抑8.0)溶 解沉淀;于溫度37 °C下水浴30min，消化RNA;于溫度-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0116] 提取的質(zhì)粒經(jīng)SacI和KasI酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗證，結(jié)果表明重組 克隆載體DBNOl-T中插入的所述優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 1所示的核 巧酸序列，即優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列正確插入。
[0117] 2、構(gòu)建含有優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的擬南芥重組表達(dá)載體DBNl 11101
[0118] 用限制性內(nèi)切酶Sac巧日KasI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達(dá)載體DBNBC-Ol (載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機(jī)構(gòu)可W提供）），將切下的優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列片段 插到表達(dá)載體DBNBC-Ol的SacI和KasI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN111101，其構(gòu)建流程如圖7所示化an:卡那霉素基 因；RB:右邊界;prAtUbilO:擬南芥Ubiquitin(泛素）10基因啟動子（SEQ ID N0:6);AtCTP2: 擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)運膚(SEQ ID N0:7);mMTHFR66:優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID N0:1); tNos:姻脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO: 8);prCaMV35S:花挪菜花葉病毒35S啟動子 (沈Q ID N0:9);PAT:草下麟乙酷轉(zhuǎn)移酶基因（SEQ ID N0:10);tCaMV35S:花挪菜花葉病毒 35S終止子(SEQ ID N0:11);LB:左邊界）。
[0119] 將重組表達(dá)載體DBN111101用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件 為:5化L大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、1化L質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體DBNl 11101)，42°C水浴30秒； 37°C振蕩培養(yǎng)1小時（10化pm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動）；然后在含50mg/L卡那霉素化anamycin)的LB 固體平板(膜蛋白腺1 Og/L，酵母提取物5g/L，NaCl lOg/L，瓊脂15g/L，用化OH調(diào)抑至7.5)上 于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取 物5g/L，化Cl lOg/L，卡那霉素50mg/L，用化OH調(diào)抑至7.5)中于溫度37°(：條件下培養(yǎng)過夜。 堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacI和KasI酶切后鑒定，并將陽性克隆進(jìn) 行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN111101在SacI和KasI位點間的核巧酸序列為序列 表中SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列，即優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列。
[0120] 3、構(gòu)建含有天然MTHFR66核巧酸序列的擬南芥重組表達(dá)載體DBNl 11 IOlN
[0121] 按照本實施例中1所述的構(gòu)建含有優(yōu)化MT冊R6 6核巧酸序列的重組克隆載體 DBNOl-T的方法，利用天然MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID ^:3)構(gòu)建含有天然^邸366核巧酸 序列的重組克隆載體DBNO1R-T。對陽性克隆進(jìn)行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBNO1R- T中插入的天然MTHFR66核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列，即天然 MTHFR66核巧酸序列正確插入。
[0122] 按照本實施例中2所述的構(gòu)建含有優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的重組表達(dá)載體 DBNl 11101的方法，利用天然MTHFR66核巧酸序列構(gòu)建含有天然MTHFR66核巧酸序列的重組 表達(dá)載體DBN111101N，其載體結(jié)構(gòu)如圖8所示(載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機(jī)構(gòu)可W提 供）；Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；prAt師ilO:擬南芥師iquitin(泛素）10基因啟動子 (沈Q ID N0:6);AtCTP2:擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)運膚（SEQ ID N0:7);MTHFR66:天然MTHFR66核巧 酸序列（SEQ ID N0:3);tNos:姻脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:8);prCaMV35S:花挪 菜花葉病毒35S啟動子（SEQ ID N0:9);PAT:草下麟乙酷轉(zhuǎn)移酶基因（SEQ ID N0:10); t化MV35S:花挪菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID N0:11);LB:左邊界）。對陽性克隆進(jìn)行測序 驗證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBNl 11 IOlN中插入的天然MTHFR66核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO:3所示的核巧酸序列，即天然MTHFR66核巧酸序列正確插入。
[0123] 4、擬南芥重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0124] 對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBNl 11101和DBNl 11 IOlN用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 GV3101中，其轉(zhuǎn)化條件為：100化農(nóng)桿菌GV310U3化質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體）；置于液氮中10 分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌GV3101接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為 20化pm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB 平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切 DBNl 11101和DBNl 1110 IN后進(jìn)行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBNl 1110 ^roBNllllOlN 結(jié)構(gòu)完全正確。
[0125] 第五實施例、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得
[0126] 將野生型擬南芥種子懸浮于0.1%瓊脂糖溶液中。將懸浮的種子在4°C下保存2天 W完成對休眠的需要W保證種子同步萌發(fā)。用賠石混合馬糞±并用水地下灌概至濕潤，使 ±壤混合物排水24小時。將預(yù)處理后的種子種在±壤混合物上并用保濕罩覆蓋7天。使種子 萌發(fā)并在恒溫(22°C)恒濕(40-50%)光強(qiáng)度為120-150皿ol/m2秒的長日照條件（16小時光 照/8小時黑暗）下在溫室中培養(yǎng)植物。開始用霍格蘭營養(yǎng)液灌概植物，接著用去離子水灌 概，保持±壤潮濕但不濕透。
[0127] 使用花浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥。用選取的農(nóng)桿菌菌落接種一份或多份15-30mL含卡那 霉素（lOOmg/L)和利福平（lOmg/L)的YEP培養(yǎng)液的預(yù)培養(yǎng)物。W 22化pm將培養(yǎng)物在28 °C恒速 搖動解育過夜。每個預(yù)培養(yǎng)物用于接種兩份500ml含卡那霉素（lOOmg/L)和利福平（lOmg/L) 的YEP培養(yǎng)液的培養(yǎng)物并將培養(yǎng)物在28°C持續(xù)搖動解育過夜。室溫W約8700Xg離屯、10分鐘 沉淀細(xì)胞，棄去得到的上清液。將細(xì)胞沉淀輕柔重懸于SOOmL滲透培養(yǎng)基中，所述滲透培養(yǎng) 基含有1/2 XMS鹽/B5維生素、10% (w/v)薦糖、0.044測節(jié)氨基嚷嶺（10化/L( Img/血DMSO中 的原液））和30化L/L SiIvet L-77。將約1月齡的植物在培養(yǎng)基中浸泡15秒，確保浸沒最新 的花序。接著將植物側(cè)面放倒并覆蓋(透明或不透明）24小時，接著用水洗涂并豎直放置。在 22°CW16小時光照/8小時黑暗的光周期培養(yǎng)植物。浸泡約4周后收獲種子。
[012引將新收獲的（優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列和天然MTHFR66核巧酸序列）Tl種子在室溫 干燥7天。將種子種在26.5 X51cm萌發(fā)盤中，每盤接受200mg Tl種子(約10000個種子），所述 種子事先已懸浮于40mL 0.1%瓊脂糖溶液并在4°C下保存2天W完成對休眠的需要W保證 種子同步萌發(fā)。
[0129] 用賠石混合馬糞±并用水地下灌概至濕潤，利用重力排水。用移液管將預(yù)處理后 的種子(每個40mL)均勻地種在±壤混合物上，并用保濕罩覆蓋4-5天。在使用出苗后噴灑草 錠麟(選擇共轉(zhuǎn)化的PAT基因）進(jìn)行最初轉(zhuǎn)化體選擇前1天移去罩。
[0130] 在7個種植天數(shù)后（DAP)并于IlDAP再次使用DeVi化iss壓縮空氣噴嘴WlOmL/盤 (70化Aa)的噴灑體積用Libedy除草劑(200g ai/L的草錠麟）的0.2%溶液噴灑Tl植物(分 別為子葉期和2-4葉期），W提供每次應(yīng)用280g ai Aa有效量的草錠麟。在最后噴灑后4-7天 鑒定存活株(生長活躍的植物），并分別移植到用馬糞上和賠石制備的7cm X 7cm的方盆中 (每盤3-5棵）。用保濕罩覆蓋移植的植物3-4天，并如前置于22 °C培養(yǎng)室中或直接移入溫室。 接著移去罩并在測試MTHFR66基因提供麥草畏除草劑耐受性的能力之前至少I天將植物栽 種到溫室(22 ± 5°C，50 ± 30%RH，14小時光照：10小時黑暗，最小50化E/WV天然+補充光）。
[0131] 第六實施例、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的除草劑耐受性效果檢測
[0132] 用MTHFR66基因進(jìn)行首次擬南芥轉(zhuǎn)化。首先使用草錠麟選擇方案從未轉(zhuǎn)化種子背 景中選擇Tl轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化重組表達(dá)載體DBN111101的為定位于葉綠體的轉(zhuǎn)入優(yōu)化MTHFR66核 巧酸序列的擬南芥植株(At mMTHFR66)，轉(zhuǎn)化重組表達(dá)載體DBN111101N的為定位于葉綠體 的轉(zhuǎn)入天然MTHFR66核巧酸序列的擬南芥植株（At MTHFR66)。篩選了約20000個At mMTHFR66的Tl種子，并鑒定了 197株Tl代陽性轉(zhuǎn)化子(PAT基因），約1.0 %的轉(zhuǎn)化效率;篩選了 約20000個At MTHFR66的Tl種子，并鑒定了 182株Tl代陽性轉(zhuǎn)化子(PAT基因），約0.91 %的轉(zhuǎn) 化效率。將轉(zhuǎn)入優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的擬南芥Tl植株(At-mMTHFR66)、轉(zhuǎn)入天然MTHFR66 核巧酸序列的擬南芥Tl植株(At-MTHFR66)和野生型擬南芥植株(播種后18天)對麥草畏進(jìn) 行除草劑耐受性效果檢測。
[0133] 分別將轉(zhuǎn)入優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的擬南芥Tl植株、轉(zhuǎn)入天然MTHFR66核巧酸序 列的擬南芥Tl植株和野生型擬南芥植株用麥草畏（560gae/ha，l倍大田濃度）和空白溶劑 (水)噴灑。噴施7天和14天后統(tǒng)計植株耐受性情況:7天后生長狀況和空白溶劑(水)一致的 劃為高抗植株，7天后有蓮座葉卷曲的劃為中抗植株，14天后仍不能抽苔的劃為低抗植株， 14天后死亡的劃為不抗植株。由于每株擬南芥Tl植株是獨立的轉(zhuǎn)化事件，可W預(yù)計在給定 劑量內(nèi)個體Tl應(yīng)答的顯著差異。結(jié)果如表1和圖9所示。
[0134] 表1、轉(zhuǎn)基因擬南芥Tl植株除草劑耐受性實驗結(jié)果
[0135]
[0136] 對于擬南芥，560g ae/ha麥草畏是將敏感植物與具有平均耐受性水平的植物區(qū)分 開來的有效劑量。表1和圖9的結(jié)果表明：優(yōu)化MTHFR66基因賦予個體擬南芥植物麥草畏除草 劑耐受性（只有部分植株具有耐受性的原因是由于Tl代植物插入位點是隨機(jī)的，因而耐受 性基因的表達(dá)水平有差異，表現(xiàn)出耐受性水平的差異）；相比于At-MTHFR66的Tl植株，At- mMTHFR66的Tl代擬南芥后代部分能夠產(chǎn)生更高的麥草畏除草劑耐受性，表明所述MTHFR66 基因經(jīng)植物密碼子優(yōu)化可W增強(qiáng)擬南芥植物對麥草畏除草劑的耐受性;而野生型擬南芥則 不具有麥草畏除草劑耐受性。
[0137] 第屯實施例、玉米重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0138] 1、構(gòu)建含有優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的玉米重組表達(dá)載體DBN-HTl 30066
[0139] 用限制性內(nèi)切酶Sac巧日KasI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達(dá)載體DBNBC-02 (載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機(jī)構(gòu)可W提供）），將切下的優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列片段 插到表達(dá)載體DBNBC-02的SacI和KasI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN-HT130066，其構(gòu)建流程如圖10所示化an:卡那霉 素基因；RB:右邊界;prUbi:玉米Ubiquitin(泛素）1基因啟動子(SEQ ID ^:12);41口？2:擬 南芥葉綠體轉(zhuǎn)運膚（SEQ ID NO:7);mMTHFR66:優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID NO:l); tNos:姻脂堿合成酶基因的終止子（SEQ ID NO:8);PMI:憐酸甘露糖異構(gòu)酶基因（SEQ ID N0:13);LB:左邊界）。
[0140] 將重組表達(dá)載體DBN-HT130066用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條 件為：50化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10化質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體DBN-HT130066)，42°C水浴 30秒;37 °C振蕩培養(yǎng)1小時（10化pm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動）；然后在含50mg/L卡那霉素的LB固體平 板(膜蛋白腺1〇旨/1，酵母提取物5旨/1，化(：110旨/1，瓊脂15旨/1，用船0的周抑至7.5)上于溫度 37 °C條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/ L，化Cl lOg/L，卡那霉素50mg/L，用化OH調(diào)抑至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提 取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacI和KasI酶切后鑒定，并將陽性克隆進(jìn)行測序 鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN-HT130066在Sac巧日KasI位點間的核巧酸序列為序列表中 SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列，即優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列。
[0141] 2、構(gòu)建含有天然MTHFR66核巧酸序列的玉米重組表達(dá)載體DBN-HTl 30066N
[0142] 按照本實施例中1所述的構(gòu)建含有優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的重組表達(dá)載體DBN- HT120066的方法，利用本發(fā)明第四實施例中3所述的含有天然MTHFR66核巧酸序列的重組克 隆載體DBNOlR-T，構(gòu)建含有天然MTHFR66核巧酸序列的重組表達(dá)載體DBN-HT130066N，其載 體結(jié)構(gòu)如圖11所示（載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機(jī)構(gòu)可W提供）；Kan:卡那霉素基因； RB:右邊界;prUbi:玉米Ubiquitin(泛素）1基因啟動子（SEQ ID N0:12);AtCTP2:擬南芥葉 綠體轉(zhuǎn)運膚(SEQ ID N0:7);MTHFR66:天然MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID N0:3);tNos:姻脂 堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:8);PMI:憐酸甘露糖異構(gòu)酶基因（SEQ ID N0:13);LB: 左邊界）。對陽性克隆進(jìn)行測序驗證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN-HTl30066N中插入的天然 MTHFR66核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列，即天然MTHFR66核巧酸序 列正確插入。
[0143] 3、玉米重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0144] 對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN-HT130066和DBN-HT130066N用液氮法轉(zhuǎn)化到 農(nóng)桿菌 LBA4404 (Invi 付 gen，Chi cago，USA，CAT: 18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100 化農(nóng)桿菌 LBA4404、3化質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體）；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘;將轉(zhuǎn)化后的 農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為20化pm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/ L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克 隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切DBN-HT130066和DBN-HT130066N后進(jìn)行酶切驗 證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN-HTl 30066和DBN-HTl 30066N結(jié)構(gòu)完全正確。
[0145] 第八實施例、轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲得及驗證
[0146] 按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的玉米品種綜3UZ31)的幼胚與本發(fā) 明第屯實施例中3所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，W將本發(fā)明第屯實施例中1和2構(gòu)建的重組表達(dá)載 體DBN-HT130066和DBN-HT130066N中的T-DNA(包括玉米Ubiquitinl基因的啟動子序列、優(yōu) 化MTHFR66核巧酸序列、天然MTHFR66核巧酸序列、AtCTP2葉綠體轉(zhuǎn)運膚序列、PMI基因和Nos 終止子序列)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了定位于葉綠體的轉(zhuǎn)入優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列 的玉米植株(Zm-mMTHFR66)和轉(zhuǎn)入天然MTHFR66核巧酸序列的玉米植株(Zm-MTHFR66);同時 W野生型玉米植株作為對照。
[0147] 對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮 液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)?yōu)化MTHFR66核巧酸序列和天然MTHFR66核巧酸序列傳遞至 幼胚之一的至少一個細(xì)胞(步驟1:侵染步驟）。在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液 (ODssq = O . 4-0.6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、薦糖68.5g/L、葡萄 糖36g/L、乙酷下香酬(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) Img/L，P冊.3))中W啟動接 種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期（3天）（步驟2:共培養(yǎng)步驟）。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后 在固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、薦糖20g/L、葡萄糖lOg/L、乙酷下香 酬(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)lmg/L、瓊脂8g/L，p冊.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階 段后，可W有一個選擇性的"恢復(fù)"步驟。在"恢復(fù)"步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他 命、干酪素300mg/L、薦糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) Img/L、植物凝膠3g/L，P冊.8)中 至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭抱霉素），不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步 驟3:恢復(fù)步驟）。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，W消除農(nóng)桿 菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選 擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4:選擇步驟）。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基 (MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、薦糖30g/L、甘露糖12.5g/L、2，4-二氯苯氧乙酸 (2，4-D) Img/L、植物凝膠3g/L，P冊.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長。然后，愈傷組織 再生成植物(步驟5:再生步驟），優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培 養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)W再生植物。
[0148] 篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪 素300mg/L、薦糖30g/L、6-芐基腺嚷嶺2mg/L、甘露糖5g/L、植物凝膠3g/L，p冊.8)上，25°C下 培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基（MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素 300mg/L、薦糖30g/L、日引噪-3-乙酸Img/L、植物凝膠3g/L，p冊.8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm 高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時。
[0149] 2、用化qMan驗證轉(zhuǎn)基因玉米植株
[0150] 分別取轉(zhuǎn)入優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入天然MTHFR66核巧酸序列 的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組 DNA，通過化qman探針巧光定量PCR方法檢測PMI基因的拷貝數(shù)來確定轉(zhuǎn)基因玉米植株的拷 貝數(shù)。同時W野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平 均值。
[0151 ]檢測PMI基因拷貝數(shù)的具體方法如下：
[0152] 步驟11、分別取轉(zhuǎn)入優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入天然MTHFR66核巧 酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研鉢中用液氮研成勻漿，每個 樣品取3個重復(fù)；
[0153] 步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具體 方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0154] 步驟13、用NanoDrop 2000(The;rmo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度； [01W] 步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80- 100雌/化；
[0156] 步驟15、采用化qman探針巧光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，W經(jīng)過鑒定已知拷 貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，W野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均 值;巧光定量PCR引物和探針序列分別是：
[0157] W下引物和探針用來檢測PMI基因：
[015引 引物3:01^^^'6441'〔46〔6口'巧日序列表中沈9 10備：14所示；
[0159] 引物4:6〇1^'66〇：1'1764〔46巧日序列表中沈9 10^:15所示；
[0160] 探針1:16〇1；〇：44〔6441'〔4〇1；6如序列表中沈9 10備:16所示；
[0161] PCR反應(yīng)體系為：
[0162]
[0163] 所述50X引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45化，IOOiiM濃度的探針50y L和86化L 1 X TE緩沖液，并且在4°C，膽藏在班巧試管中。
[0164] PCR反應(yīng)條件為：
[01 化]
[0166]
[0167]利用SDS2.3軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。
[016引實驗結(jié)果表明，優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列和天然MTHFR66核巧酸序列均己整合到所 檢測的玉米植株的染色體組中，而且轉(zhuǎn)入優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入天然 MTHFR66核巧酸序列的玉米植株均獲得了含有單拷貝MTHFR66基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株。
[0169] 第九實施例、轉(zhuǎn)基因玉米植株的除草劑抗性效果檢測
[0170] 將轉(zhuǎn)入優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入天然MTHFR66核巧酸序列的玉米 植株和野生型玉米植株(V5-V6時期)分別對麥草畏進(jìn)行除草劑抗性效果檢測。
[0171] 分別取轉(zhuǎn)入優(yōu)化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入天然MTHFR66核巧酸序列的 玉米植株和野生型玉米植株的Tl代雜合植株(V5-V6時期），并用麥草畏除草劑(4480g ae/ ha，8倍大田濃度)和空白溶劑(水)噴灑。噴施21天后統(tǒng)計支撐根發(fā)育情況。Zm-mMTHFR66共3 個株系（S1、S2和S3)，Zm-MTHFR66共2個株系（S4和S5)，野生型的（CK)共1個株系；從每個株 系選10-15株進(jìn)行測試。結(jié)果如表2所示。
[0172] 表2、轉(zhuǎn)基因玉米Tl植株除草劑抗性實驗結(jié)果
[0173]
[0174] 表2的結(jié)果表明：優(yōu)化MTHFR66基因賦予轉(zhuǎn)基因玉米植物麥草畏除草劑的高水平耐 受性（由于單子葉植物本身對麥草畏除草劑具有一定抗性，因而表現(xiàn)出高水平抗性）；相比 于Zm-MTHFR66，Zm-mMTHFR66能夠產(chǎn)生更高的麥草畏除草劑耐受性，表明所述MTHFR66基因 經(jīng)植物密碼子優(yōu)化可W增強(qiáng)玉米植物對麥草畏除草劑的耐受性;而野生型玉米植株則不具 有麥草畏除草劑耐受性。
[0175] 綜上所述，本發(fā)明MTHFR66蛋白可W降解麥草畏除草劑，優(yōu)化MTHFR66基因采用玉 米和大豆的偏好密碼子，使其特別適合在植物中表達(dá);優(yōu)化MTHFR66基因可W賦予轉(zhuǎn)基因植 物更好的麥草畏除草劑耐受性；同時本發(fā)明除草劑耐受性蛋白質(zhì)MTHFR66還具有甲基四氨 葉酸還原酶活性，其不同于已知的麥草畏耐受型基因，因此可W擴(kuò)大麥草畏耐受型在植物 上應(yīng)用范圍。
[0176] 最后所應(yīng)說明的是，W上實施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對本發(fā)明 的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種基因，其特征在于，包括： (a) 編碼SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列;或 (b) 在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列互補的核苷酸序列;或 (c) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。2. -種表達(dá)盒，其特征在于，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的權(quán)利要求1所述基 因。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述表達(dá)盒，其特征在于，所述調(diào)控序列為葉綠體轉(zhuǎn)運肽，所述葉綠 體轉(zhuǎn)運肽與權(quán)利要求1所述基因有效連接。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述表達(dá)盒，其特征在于，所述葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。5. -種包含權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2-4任一項所述表達(dá)盒的重組載體。6. -種增加耐受除草劑范圍的方法，其特征在于，包括:將SEQ ID NO: 2所示的氨基酸 序列組成的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2-4任一項所述表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不 同于SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2-4任一項所述表達(dá)盒編碼 的蛋白質(zhì)的第二種蛋白質(zhì)一起表達(dá)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述增加除草劑耐受性的方法，其特征在于，所述第二種蛋白質(zhì)為草 甘膦耐受性蛋白質(zhì)、草銨膦耐受性蛋白質(zhì)、α酮戊二酸雙加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、 乙酰乳酸合酶、細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)或原卟啉原氧化酶。8. -種選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，其特征在于，包括：用權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利 要求2-4任一項所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化多個植物細(xì)胞，并在允許表達(dá)所述基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn) 化細(xì)胞生長，而殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的除草劑濃度下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所 述除草劑為麥草畏。9. 一種控制雜草的方法，其特征在于，包括:對種植植物的大田施用有效劑量的麥草畏 除草劑，所述植物包含權(quán)利要求1所述基因、權(quán)利要求2-4任一項所述表達(dá)盒或權(quán)利要求5所 述重組載體。10. -種保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1所 述基因、權(quán)利要求2-4任一項所述表達(dá)盒或權(quán)利要求5所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的 植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受麥草畏損害量的除草劑耐受性蛋白質(zhì)。11. 一種賦予植物麥草畏除草劑耐受性的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1所述基 因、權(quán)利要求2-4任一項所述表達(dá)盒或權(quán)利要求5所述重組載體導(dǎo)入植物。12. -種控制草甘膦耐受性植物的大田中草甘膦耐受性雜草的方法，其特征在于，包 括:對種植草甘膦耐受性植物的大田施用有效劑量的麥草畏，所述草甘膦耐受性植物包含 權(quán)利要求1所述基因、權(quán)利要求2-4任一項所述表達(dá)盒或權(quán)利要求5所述重組載體。13. -種產(chǎn)生麥草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因組中引入 權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2-4任一項所述表達(dá)盒，以產(chǎn)生麥草畏耐受性植物。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述產(chǎn)生麥草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括:通過將親 本植物自交或與第二種植物雜交而產(chǎn)生麥草畏耐受性植物，所述親本植物和/或第二種植 物包含權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2-4任一項所述表達(dá)盒，所述麥草畏耐受性植物遺傳 了來自所述親本植物和/或第二種植物的所述基因或所述表達(dá)盒。15. -種培養(yǎng)對麥草畏除草劑具有耐受性的植物的方法，其特征在于，包括： 種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要 求2-4任一項所述表達(dá)盒； 使所述植物種子長成植株； 用有效劑量麥草畏除草劑噴灑所述植株，收獲與其他不具有所述基因或所述表達(dá)盒的 植株相比具有減弱的植物損傷的植株。16. 根據(jù)權(quán)利要求6-15任一項所述方法，其特征在于，所述植物為大豆、棉花、玉米、水 稻、小麥、甜菜或甘蔗。17. -種甲基四氫葉酸還原酶耐受麥草畏除草劑的用途，其特征在于，所述甲基四氫葉 酸還原酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。18. -種產(chǎn)生甲基四氫葉酸還原酶的植物耐受麥草畏除草劑的用途，其特征在于，所述 甲基四氫葉酸還原酶具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
【文檔編號】C12N5/10GK105925590SQ201610440763
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月18日
【發(fā)明人】何健, 姚利, 賈興軍, 謝香庭, 吳業(yè)春, 陶青, 丁德榮
【申請人】北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司, 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)