本發(fā)明涉及一組用于大腸桿菌多重耐藥基因檢測(cè)的液相芯片引物和探針，屬于生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：2010年，隨著“超級(jí)細(xì)菌”這一名詞頻繁地見(jiàn)諸報(bào)端，細(xì)菌多重耐藥、抗生素的合理使用重返人們視線(xiàn)。超級(jí)細(xì)菌其實(shí)并非新事物，它不是一個(gè)細(xì)菌的名稱(chēng)，而是一類(lèi)細(xì)菌的名稱(chēng)，這一類(lèi)細(xì)菌的共性是對(duì)幾乎所有的抗生素都有強(qiáng)勁的耐藥性，它們一直存在并且隨著人類(lèi)濫用抗生素而進(jìn)化出強(qiáng)大耐藥性。細(xì)菌耐藥性，尤其是多重耐藥性(multidrugresistance,mdr)已經(jīng)成為非常嚴(yán)重的醫(yī)療問(wèn)題及社會(huì)問(wèn)題。細(xì)菌耐藥機(jī)理十分復(fù)雜，在抗生素的壓力選擇下，臨床細(xì)菌耐藥狀況的日益惡化。細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)對(duì)于正確的目標(biāo)性抗感染治療以及監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性變遷和耐藥菌感染的流行病學(xué)調(diào)查，制定防控細(xì)菌耐藥性增加的措施至關(guān)重要。然而，目前臨床實(shí)驗(yàn)室多采用耐藥表型的檢測(cè)方法，其檢測(cè)周期長(zhǎng)時(shí)效性差、檢測(cè)通量低、影響因素多是最主要的問(wèn)題，不能滿(mǎn)足目前臨床抗感染治療和醫(yī)院感染控制的要求。液相芯片(又稱(chēng)流式熒光技術(shù)、液態(tài)芯片、懸浮陣列等)是在后基因組時(shí)代發(fā)展起來(lái)的新一代標(biāo)準(zhǔn)化開(kāi)放式高通量技術(shù)平臺(tái)，它有機(jī)地整合了編碼微球、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，具有高通量、高速度、低成本、靈敏度高、重復(fù)性好、線(xiàn)性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體和配體識(shí)別分析等研究，也是目前唯一得到權(quán)威機(jī)構(gòu)和醫(yī)學(xué)界共同認(rèn)可用于臨床診斷的生物芯片平臺(tái)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：利用液相芯片技術(shù)，提供一組使大腸桿菌的7種耐藥基因的pcr產(chǎn)物能在一個(gè)雜交條件下完成特異性雜交的引物組和探針。本發(fā)明提供的一組用于大腸桿菌多重耐藥基因檢測(cè)的液相芯片引物，所述7個(gè)耐藥基因的引物序列為：一組用于大腸桿菌多重耐藥基因檢測(cè)的液相芯片探針，所述7個(gè)耐藥基因的探針序列為：耐藥基因探針序列temte-pf:nh2-ttttttttaatcgtgacgggcaaatagctxct-pr:nh2-tttttttttacgtcctttccaatgaaagcshvsh-pf1:nh2-ttttttttttacgtcccgtctggatagcoxa1ox-pf:nh2-tttttttctgcgagggaatcttattagttampcam-pf1:nh2-ttttttgagggaatctttcttgataagyragy-pf3:nh2-tttttttgcgggattcaagcgttcaaaac3aac3-pf3:nh2-ttttttaacgaagtggatcgttaac本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的是一個(gè)引物和探針的組合，這7組引物和探針之間無(wú)交叉反應(yīng)，形成一個(gè)多重引物組合，不能將其單獨(dú)分開(kāi)。所述的引物和探針組合用于液相芯片，可以同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌多重耐藥基因。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一組用于大腸桿菌多重耐藥基因檢測(cè)的液相芯片引物，所述7個(gè)耐藥基因的引物序列為：一組用于大腸桿菌多重耐藥基因檢測(cè)的液相芯片探針，所述7個(gè)耐藥基因的探針序列為：耐藥基因探針序列temte-pf:nh2-ttttttttaatcgtgacgggcaaatagctxct-pr:nh2-tttttttttacgtcctttccaatgaaagcshvsh-pf1:nh2-ttttttttttacgtcccgtctggatagcoxa1ox-pf:nh2-tttttttctgcgagggaatcttattagttampcam-pf1:nh2-ttttttgagggaatctttcttgataagyragy-pf3:nh2-tttttttgcgggattcaagcgttcaaaac3aac3-pf3:nh2-ttttttaacgaagtggatcgttaac實(shí)施例2特異性驗(yàn)證：1.分別取tem、ctx、shv、oxa1、ampc、gyra、aac3耐藥的大腸桿菌培養(yǎng)液，提取dna。利用上述的引物配制多重pcr反應(yīng)體系(40ul)：2.配制的反應(yīng)體系按下述程序擴(kuò)增：a)第一階段：95℃，10min，1個(gè)循環(huán)。b)第二階段：95℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；40個(gè)循環(huán)。c)第三階段：72℃，10分鐘,1個(gè)循環(huán)。3.擴(kuò)增后的pcr產(chǎn)物利用液相芯片分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，步驟如下：a.根據(jù)pcr反應(yīng)的管數(shù)，用剪刀剪取相應(yīng)大小的微孔雜交板。打開(kāi)液相芯片分析系統(tǒng)預(yù)熱，并將儀器上微孔板適配銅板的溫度設(shè)定在48℃。b.將微球雜交液試劑瓶置于渦旋儀上振蕩30秒，使微球充分混懸在溶液中。并在每一個(gè)雜交孔中加入22μl；c.每個(gè)樣本吸取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物3μl，并依次加入到相應(yīng)的上述雜交孔中，并抽吸幾次加以混勻；d.剪取相應(yīng)大小的封板紙，將微孔雜交板覆蓋封口。請(qǐng)用指壓封口數(shù)次，確保封嚴(yán)，以防在高溫變性和雜交時(shí)溶液蒸發(fā)；e.將雜交板置于金屬恒溫浴(可以用pcr儀代替)，把儀器的蓋子壓緊已封口的雜交板，以防封板膜在加熱后張開(kāi)，導(dǎo)致液體蒸發(fā)。變性和雜交過(guò)程運(yùn)行如下程序：95℃5分鐘變性48℃30分鐘雜交f.小心將封板紙撕下，每孔加入熒光素sa-pe75μl，并抽吸幾次加以混勻。加完后將封板紙重新粘好，繼續(xù)在48℃下孵育15分鐘；g.將微孔雜交板快速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的液相芯片分析系統(tǒng)上進(jìn)行閱讀，得到檢測(cè)結(jié)果。4.tem、ctx、shv、oxa1、ampc、gyra、aac3耐藥大腸桿菌雜交檢測(cè)結(jié)果如下表，結(jié)果表明設(shè)計(jì)的引物和檢測(cè)探針具有良好的特異性。實(shí)施例3靈敏度驗(yàn)證分別取tem、ctx、shv、oxa1、ampc、gyra、aac3耐藥的大腸桿菌培養(yǎng)液，菌落計(jì)數(shù)后，統(tǒng)一稀釋到1000/ml,然后梯度稀釋并提取dna，按實(shí)施例2中的步驟進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如下表，表明設(shè)計(jì)的引物和檢測(cè)探針均能檢出125/ml的菌。sequencelisting<110><120>一組用于大腸桿菌多重耐藥基因檢測(cè)的液相芯片引物和探針<160>21<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1atgagtattcaacatttccg20<210>2<211>17<212>dna<213>人工序列<400>2ttactgtcatgccatcc17<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列<400>3ttttttttaatcgtgacgggcaaatag27<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4gtgacaaagagagtgcaagcc21<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5atgattctcgccgctgaagcc21<210>6<211>29<212>dna<213>人工序列<400>6tttttttttacgtcctttccaatgaaagc29<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7gccgggttattcttatttgtcgc23<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<400>8tctttccgatgccgccgccagtca24<210>9<211>28<212>dna<213>人工序列<400>9ttttttttttacgtcccgtctggatagc28<210>10<211>15<212>dna<213>人工序列<400>10ccaaagacgtggatg15<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11gttaaattcgaccccaagtt20<210>12<211>29<212>dna<213>人工序列<400>12tttttttctgcgagggaatcttattagtt29<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13gatcgttctgccgctgtg18<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14gggcagcaaatgtggagcaa20<210>15<211>26<212>dna<213>人工序列<400>15ttttttgagggaatctttcttgataa26<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16acgtactaggcaatgactgg20<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列<400>17agaagtcgccgtcgatagaac21<210>18<211>26<212>dna<213>人工序列<400>18tttttttgcgggattcaagcgttcaa26<210>19<211>18<212>dna<213>人工序列<400>19gttacaccggaccttgga18<210>20<211>18<212>dna<213>人工序列<400>20aacggcattgagcgtcag18<210>21<211>25<212>dna<213>人工序列<400>21ttttttaacgaagtggatcgttaac25當(dāng)前第1頁(yè)12