本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別涉及一種基于亞硫酸氫鹽測(cè)序法的foxp3基因甲基化檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

foxp3是調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(regulatorytcell,treg)的特征性標(biāo)志，在維持免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)研究證實(shí)：foxp3基因的表達(dá)和蛋白功能的發(fā)揮均與表觀遺傳學(xué)(如dna甲基化、翻譯后修飾等)密切相關(guān)。亞硫酸氫鹽測(cè)序法是國(guó)內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)的脫氧核糖核酸(dna)甲基化位點(diǎn)檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，可準(zhǔn)確而靈敏地檢測(cè)出特定dna序列不同胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸(cpg)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，但是受實(shí)驗(yàn)過(guò)程中諸多因素(如樣本保存條件、基因組dna含量及純度、轉(zhuǎn)化后基因組dna含量、pcr反應(yīng)體系、甲基化引物序列、藍(lán)白克隆篩選等試驗(yàn)因素)的影響成功率低下。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明建立了一種基于亞硫酸氫鹽測(cè)序法的foxp3(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor,foxp3)基因甲基化檢測(cè)方法。

作為本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種基于亞硫酸氫鹽測(cè)序法的foxp3基因甲基化檢測(cè)方法，包括：

步驟1，用促凝采血管收集人靜脈血4ml，室溫凝固30min，離心1000g×15min，而后分裝1ml血凝塊進(jìn)1.5mlaxygenpe管，保存于-80℃冰箱中。

步驟2，采用血液基因組dna提取試劑盒提取血凝塊基因組dna。

步驟3，通過(guò)0.8％-1.0％的瓊脂糖凝膠電泳初步確定基因組dna完整性、濃度和純度，并將檢測(cè)合格的dna樣本置于-20℃冰箱備用。

步驟4，采用甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒修飾基因組dna，并將修飾好的dna樣本置于-20℃冰箱備用。

步驟5，在確定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行甲基化pcr擴(kuò)增，通過(guò)2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)鑒定pcr產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，并將回收完畢的目的pcr產(chǎn)物置于-20℃冰箱備用；所述確定的實(shí)驗(yàn)條件是：pcr模板量為10μl轉(zhuǎn)化后的基因組dna，pcr采用50μl反應(yīng)體系和4μl的25mmol/lmgcl2，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為111bp。

步驟6，pcr產(chǎn)物通過(guò)2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)鑒定，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

步驟7，采用dna純化回收試劑盒純化回收步驟5中的18μlpcr產(chǎn)物，通過(guò)載體連接將2μlpcr純化回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入trans1-t1感受態(tài)細(xì)菌中，開(kāi)展藍(lán)白克隆斑篩選，并以通用引物(m13f和m13r)做pcr擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，以鑒定陽(yáng)性克隆。

步驟8，選取步驟7中陽(yáng)性克隆斑中的菌體接種于50μg/ml卡那霉素單抗lb液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫200rpm/min震蕩培養(yǎng)8-12h后，取變渾濁的樣本送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。

優(yōu)選地，所述步驟5中進(jìn)行pcr擴(kuò)增的引物序列為：

f:5’-atttttaggatttgaggttttaata-3’，

r:5’-caaaaaacccactaaaaaactatac-3’。

優(yōu)選地，所述步驟5中進(jìn)行甲基化pcr擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)條件為：

步驟a，94℃預(yù)加熱3min；

步驟b，94℃變性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min；

步驟c，重復(fù)上述步驟b中的循環(huán)35次；

步驟d，72℃保持7min后，4℃保存。

優(yōu)選地，所述步驟5所確定的pcr實(shí)驗(yàn)體系為：4μl的25mmol/lmgcl2。

優(yōu)選地，所述步驟1中的血液采集方法為用促凝采血管收集人靜脈血。

優(yōu)選地，所述步驟1中收集的靜脈血在室溫凝固30min，離心1000g×15min，而后分裝1ml血凝塊進(jìn)1.5mlaxygenpe管。

優(yōu)選地，所述步驟1中的血凝塊保存條件為：-80℃冰箱。

優(yōu)選地，所述步驟2中的dna提取試劑盒為：北京市天根生物有限公司血液基因組dna提取試劑盒(貨號(hào)：dp348)。

優(yōu)選地，所述步驟3中的初步確認(rèn)基因組dna完整性、濃度和純度的方法為：0.8％-1.0％的瓊脂糖凝膠電泳法(130v，40min)。

優(yōu)選地，所述步驟3中檢測(cè)到的基因組dna濃度為：5-20ng/μl。

優(yōu)選地，所述步驟3中基因組dna保存條件為：-20℃冰箱。

優(yōu)選地，所述步驟4中用于轉(zhuǎn)化的基因組dna含量為：100-400ng。

優(yōu)選地，所述步驟4中甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒為美國(guó)天漠公司產(chǎn)品(貨號(hào)：d5006)。

優(yōu)選地，所述步驟4中轉(zhuǎn)化后的基因組dna保存條件為：-20℃冰箱。

優(yōu)選地，所述步驟5的pcr模板量為10μl轉(zhuǎn)化后的基因組dna(即轉(zhuǎn)化后的全部基因組dna)。

優(yōu)選地，所述步驟5的甲基化pcr采用50μl反應(yīng)體系。

優(yōu)選地，所述步驟5的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為111bp。

優(yōu)選地，所述步驟5的pcr產(chǎn)物鑒定方法：2.0％的瓊脂糖凝膠電泳法(130v，40min)。

優(yōu)選地，所述步驟6的用于純化回收試驗(yàn)的pcr產(chǎn)物體積為18μl。

優(yōu)選地，所述步驟6的藍(lán)白克隆斑篩選試驗(yàn)所用的試劑盒為：北京全式金生物科技有限公司ta克隆試劑盒(貨號(hào)：ct101-02)。

優(yōu)選地，所述步驟6的用于藍(lán)白克隆斑篩選試驗(yàn)中的pcr純化回收產(chǎn)物的體積為2μl。

優(yōu)選地，所述步驟6的藍(lán)白克隆斑篩選試驗(yàn)所用的抗生素為卡那霉素。

優(yōu)選地，所述步驟6鑒定陽(yáng)性克隆的方法為：通過(guò)通用引物(m13f和m13r)做pcr擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳法(130v，40min)鑒定。

優(yōu)選地，所述步驟7陽(yáng)性克隆培養(yǎng)條件為：在50μg/ml卡那霉素單抗lb液體培養(yǎng)基中37℃恒溫200rpm/min震蕩培養(yǎng)8-12h。

本發(fā)明通過(guò)完善血液樣本保存條件、基因組dna濃度及純度檢測(cè)方法、轉(zhuǎn)化后基因組dna含量、pcr反應(yīng)體系中不同成分的終濃度、甲基化引物序列特異性、藍(lán)白克隆篩選條件等試驗(yàn)因素，成功地建立基于亞硫酸氫鹽測(cè)序法的foxp3基因甲基化檢測(cè)方法，能成功地檢測(cè)出foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)特定序列5個(gè)cpg位點(diǎn)甲基化的程度，從整體上提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

附圖說(shuō)明

圖1示意性地示出了樣本基因組dna電泳圖；

圖2示意性地示出了甲基化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；

圖3示意性地示出了藍(lán)白克隆斑篩選圖；

圖4示意性地示出了陰性重組子和陽(yáng)性重組子pcr產(chǎn)物電泳圖；

圖5示意性地示出了foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)特定序列測(cè)序圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實(shí)施。

foxp3是treg細(xì)胞的特征性標(biāo)志，在維持免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn)foxp3基因的表達(dá)和蛋白功能的發(fā)揮均表現(xiàn)為dna序列變異以外的調(diào)控機(jī)制即表觀遺傳學(xué)，包括dna甲基化、組蛋白修飾和翻譯后修飾等。dna甲基化以胞嘧啶甲基化發(fā)生頻率最高。胞嘧啶甲基化是指在dna甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下以s-腺苷蛋氨酸為供體將甲基加在胞嘧啶5’的位置上形成5-甲基胞嘧啶的反應(yīng)。部分位點(diǎn)是胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤以磷酸酯相連而形成的cpg位點(diǎn)。影響基因表達(dá)的cpg位點(diǎn)主要位于基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域。當(dāng)特定基因啟動(dòng)子區(qū)cpg位點(diǎn)高甲基化，可直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合，從而使基因不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄水平降低；相反，cpg位點(diǎn)的低甲基化則會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)疏松，從而增加目的dna序列的易接近性，使得特異性轉(zhuǎn)錄因子更容易與其連接。foxp3基因座含有多個(gè)cpg位點(diǎn)。位于啟動(dòng)子和第一外顯子的cpg位點(diǎn)甲基化程度與foxp3基因的表達(dá)密切相關(guān)，是t細(xì)胞分化過(guò)程中許多因子調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

本發(fā)明摸索foxp3基因亞硫酸氫鹽測(cè)序，成功檢測(cè)出人foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)特定區(qū)域(+2071，+2182)5個(gè)cpg位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

1.材料與方法

1.1材料與試劑

促凝采血管購(gòu)自廣州健福醫(yī)療科技有限公司。

用促凝采血管收集健康工人靜脈血4ml，室溫凝固30min，離心1000g×15min，而后分裝1ml血凝塊進(jìn)1.5mlaxygenpe管，保存于-80℃冰箱中，以防止基因組dna的降解導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

血液基因組dna提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京市天根生物有限公司，卡那霉素和ta克隆試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京市全式金生物科技有限公司；

正常熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自西班牙biowest公司；

taq酶、dna甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別由美國(guó)fermentas公司、美國(guó)天漠公司和美國(guó)omega公司提供；

甲基化pcr引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；

其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)試劑。

1.2甲基化引物設(shè)計(jì)

結(jié)合ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)和ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(http://asia.ensembl.org/index.html)的資料查找foxp3基因啟動(dòng)子序列，使用methprimer在線分析軟件(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，再到bisearch數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bisearch.enzim.hu/index.php？m＝genompsearch)驗(yàn)證引物。引物序列如表1，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1foxp3基因甲基化引物信息

1.3基因組dna的制備：

采用血液基因組dna提取試劑盒提取血凝塊基因組dna，通過(guò)0.8％-1.0％的瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)初步確定基因組dna完整性、濃度和純度，并將檢測(cè)合格的dna樣本置于-20℃冰箱備用。

1.4基因組dna亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

采用甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒修飾100-400ng基因組dna，并將修飾好的dna樣本置于-20℃冰箱備用。

1.5甲基化pcr擴(kuò)增

pcr模板量為10μl轉(zhuǎn)化后的基因組dna(即轉(zhuǎn)化后的全部基因組dna)，pcr采用50μl反應(yīng)體系，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為111bp，引物序列及其它組分終濃度均不變，詳見(jiàn)表2。

pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)加熱3min；94℃變性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min；重復(fù)上述循環(huán)35次。然后，72℃保持7min后，4℃保存。

pcr擴(kuò)展產(chǎn)物均采用2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。也可根據(jù)瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟回收18μl目的pcr產(chǎn)物。將回收完畢的目的pcr產(chǎn)物置于-20℃冰箱待用。

表2甲基化pcr反應(yīng)體系

1.6目的基因的克隆及篩選

2μl(約50ng)pcr純化回收產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化入trans1-t1感受態(tài)細(xì)菌中，采用卡那霉素抗性，開(kāi)展藍(lán)白克隆斑篩選試驗(yàn)；以通用引物m13f和m13r做菌落pcr擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，以鑒定陽(yáng)性克隆。

1.7測(cè)序

選取陽(yáng)性克隆斑中的菌體接種于50μg/ml卡那霉素單抗lb液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫200rpm/min震蕩培養(yǎng)8-12h后，取變渾濁的樣本送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。

2.結(jié)果

2.1基因組dna1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

如圖1所示，大部分樣本甬道在dna標(biāo)記物15000bp條帶的上方可見(jiàn)明亮的目的條帶，此條帶即基因組dna，其大小與預(yù)期結(jié)果一致，部分條帶可見(jiàn)拖尾。

其中：

m：dna標(biāo)記物；

1：樣本基因組dna；

2.2甲基化pcr2％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

空白對(duì)照甬道未見(jiàn)條帶，樣本甬道在dna標(biāo)記物100bp-250bp條帶之間出現(xiàn)明亮而清晰的目的條帶，其長(zhǎng)度與foxp3基因甲基化pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度111bp相吻合，見(jiàn)圖2。

其中：

m：dna標(biāo)記物；

1：空白對(duì)照；

2：樣本甲基化pcr產(chǎn)物；

2.3藍(lán)白克隆斑結(jié)果

陰性組未見(jiàn)藍(lán)斑或白斑，樣本組可見(jiàn)白色或藍(lán)色圓形光滑單一菌落。其中，白色菌落為有foxp3基因甲基化pcr產(chǎn)物插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌落(陽(yáng)性重組子)，藍(lán)色菌落為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌落(陰性重組子)，具體詳見(jiàn)圖3。

2.4pcr鑒定陽(yáng)性克隆分析

陽(yáng)性重組子(即陽(yáng)性克隆)的pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為插入的foxp3基因甲基化pcr產(chǎn)物(111bp)和部分t載體(199bp)序列之和，長(zhǎng)度應(yīng)為310bp；陰性重組子(即陰性克隆)的pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為部分t載體序列長(zhǎng)度199bp。2％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，白色菌落甬道在dna標(biāo)記物250bp和500bp條帶之間出現(xiàn)明亮而清晰的目的條帶，而藍(lán)色菌落甬道在dna標(biāo)記物100bp和250bp條帶之間出現(xiàn)目的條帶，見(jiàn)圖4。這證實(shí)白色菌落即陽(yáng)性重組子，而藍(lán)色菌落即陰性重組子。

其中：

m：dna標(biāo)記物；

1：陰性重組子；

2：陽(yáng)性重組子；

3：空白對(duì)照。

2.5克隆的測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果與人foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)特定dna序列(+2071，+2182)比對(duì)，目的片段無(wú)突變，5個(gè)cpg位點(diǎn)的胞嘧啶均未被亞硫酸氫鹽修飾，最后顯示為胞嘧啶，表明該樣本外周血foxp3基因啟動(dòng)子特定區(qū)域所有cpg位點(diǎn)呈現(xiàn)高甲基化，見(jiàn)圖5。

圖5測(cè)序后顯示人foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)特定序列5個(gè)cpg位點(diǎn)高甲基化。

通過(guò)上述驗(yàn)證例可知，本發(fā)明研究設(shè)計(jì)甲基化引物，確定整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的各項(xiàng)條件，建立了基于亞硫酸氫鹽測(cè)序法的foxp3基因甲基化檢測(cè)方法。

發(fā)明人采用本發(fā)明中的方法反復(fù)進(jìn)行了多次試驗(yàn)，均可獲得理想的擴(kuò)增產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果表明，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化完全，樣本外周血foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)特定區(qū)域的5個(gè)cpg位點(diǎn)均為高甲基化。

可見(jiàn)，本發(fā)明建立了亞硫酸氫鹽測(cè)序法的foxp3基因甲基化檢測(cè)方法。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。