本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是公開了一種maldi-tofms技術(shù)鑒定臨床感染豬腸球菌的方法。

背景技術(shù)：

腸球菌為革蘭陽性兼性厭氧菌，是動(dòng)物性食品污染的常見菌之一，近來腸球菌對(duì)動(dòng)物致病性的報(bào)道不斷增多，尤其是20～70日齡豬常發(fā)生一種高熱、皮下及實(shí)質(zhì)臟器腫大、出血為主要特征的傳染病，以散養(yǎng)和小規(guī)模豬群多發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于腸球菌對(duì)現(xiàn)有抗生素均產(chǎn)生不同程度的耐藥性，且抗性基因通過食物鏈由動(dòng)物傳播給人或在其他細(xì)菌之間傳遞，這使得腸球菌快速準(zhǔn)確的鑒定顯得尤為重要，并對(duì)感染腸球菌的診斷和治療具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種操作簡便、快速、準(zhǔn)確性高的鑒定臨床感染豬腸球菌的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：maldi-tofms技術(shù)鑒定臨床感染豬腸球菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：采用甲酸提取法對(duì)樣品進(jìn)行處理與點(diǎn)樣；

1)向1.5mlep離心管中加入300μl去離子水；取待測(cè)樣本(一個(gè)菌落)5-10mg至離心管中；充分混勻；加入900μl無水乙醇，充分混勻；

2)13000rpm離心2min，倒去上清。再次離心，用移液槍完全吸取殘余的上清液，整個(gè)過程不觸碰沉淀。室溫下干燥沉淀2-3min。

3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混勻；再加入50μl的純乙腈，充分混勻；13000rpm離心2min，吸取上清置于另一新的離心管中；

4)取上清1μl置于maldi靶板上，室溫晾干，再加1μlhcca基質(zhì)液覆蓋樣品，室溫晾干后上機(jī)；

5)分別取等體積的標(biāo)準(zhǔn)肽溶液與基質(zhì)溶液混合后，取1μl混合液置于maldi靶板上，室溫晾干，待完全干燥后進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品各做三個(gè)平行孔。

步驟二：利用maldibiotyper高通量微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)經(jīng)過步驟一處理的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到質(zhì)譜圖；

放入已點(diǎn)好樣品和校準(zhǔn)品的靶板。打開flexcontrol，校準(zhǔn)儀器，先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系統(tǒng)誤差校正，再進(jìn)行待測(cè)樣本的質(zhì)譜分析，通過biotyper軟件進(jìn)行分析鑒定。

步驟三：使用biotyper軟件，對(duì)得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，得到腸球菌質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)圖譜；

步驟四：將待檢測(cè)的腸球菌用腦心浸液瓊脂培養(yǎng)及分純，并進(jìn)行步驟一和步驟二處理；

步驟五：對(duì)待檢測(cè)的腸球菌質(zhì)譜圖進(jìn)行聚類分析。

所述步驟一具體包括以下步驟：1)向1.5mlep離心管中加入300μl去離子水；取待測(cè)樣本5-10mg至離心管中；充分混勻；加入900μl無水乙醇，充分混勻；

2)13000rpm離心2min，倒去上清；再次離心，用移液槍完全吸取殘余的上清液，整個(gè)過程不觸碰沉淀；室溫下干燥沉淀2-3min；

3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混勻；再加入50μl的純乙腈，充分混勻；13000rpm離心2min，吸取上清置于另一新的離心管中；

4)取上清1μl置于maldi靶板上，室溫晾干，再加1μlhcca基質(zhì)液覆蓋樣品，室溫晾干后上機(jī)；

5)分別取等體積的標(biāo)準(zhǔn)肽溶液與基質(zhì)溶液混合后，取1μl混合液置于maldi靶板上，室溫晾干，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品各做三個(gè)平行孔；所述步驟二具體包括以下步驟：放入已點(diǎn)好樣品和校準(zhǔn)品的靶板；打開flexcontrol，校準(zhǔn)儀器，先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系統(tǒng)誤差校正，再進(jìn)行待測(cè)樣本的質(zhì)譜分析，通過biotyper軟件進(jìn)行分析鑒定。

所述樣品為16srrna確認(rèn)的臨床株；所述標(biāo)準(zhǔn)品為atcc29212糞腸球菌。

所述步驟三具體包括以下步驟：對(duì)樣品處理與點(diǎn)樣，每個(gè)平行樣品重復(fù)點(diǎn)3個(gè)樣品孔；每個(gè)樣品孔采集8張質(zhì)譜圖；每個(gè)菌株采集24張譜圖，共收集到240張并保存；使用biotyper軟件，分別調(diào)入所采集的每株腸球菌的質(zhì)譜圖，將此質(zhì)譜圖匯總進(jìn)行分析，該圖譜即為腸球菌質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

所述待檢測(cè)的腸球菌為33株腸球菌臨床野生株。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有以下有益效果：

本發(fā)明采用的檢測(cè)方法與傳統(tǒng)和基因型鑒定方法相比，maldi-tofms是基于蛋白指紋圖譜的鑒定方法，操作簡便、快速、準(zhǔn)確性高。本研究從河南不同地區(qū)病豬分離的腸球菌，利用maldi-tofms方法鑒定均為糞腸球菌和屎腸球菌，且親緣關(guān)系較近。而糞腸球菌和屎腸球菌是所有腸球菌感染致病中較為常見的菌株，也是醫(yī)院、食品和豬糞等環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌，由于腸球菌具有較強(qiáng)的獲得性耐藥能力，且在各種環(huán)境中生存能力較強(qiáng)，maldi-tofms方法對(duì)腸球菌的快速鑒定，可避免菌株的傳播和更多耐藥菌株的產(chǎn)生，對(duì)于獸醫(yī)臨床實(shí)踐具有重要的意義。

附圖說明

圖1為腸球菌的主要離子峰圖譜；

圖2為33株腸球菌的可信度分值；

圖3為33株腸球菌指紋圖譜的聚類分析。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述，以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

本實(shí)施例中，10株建庫的腸球菌為16srrna確認(rèn)的臨床株，33株建庫后驗(yàn)證的腸球菌為臨床野生分離株。質(zhì)控菌株atcc29212為糞腸球菌，以上均為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送。

實(shí)驗(yàn)中用到的甲酸、乙腈、三氟乙酸、無水乙醇都是由fisher公司提供的色譜純。bts標(biāo)準(zhǔn)品、基質(zhì)α-氰-4-羥基肉桂酸(hcca)、msp96孔靶由德國bruker公司提供。

革蘭陽性細(xì)菌鑒定卡(gpi；生產(chǎn)批號(hào)：b56k)，購自法國生物梅里埃中國有限公司產(chǎn)品；

腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(bhi)(生產(chǎn)批號(hào)：160220)購自北京陸橋；maldibiotyper高通量微生物鑒定系統(tǒng)，購自德國brukerdahonics公司，參數(shù)設(shè)置：線性操作模式，正離子，基質(zhì)抑制偏轉(zhuǎn)模式。脈沖離子提取時(shí)間：100ns。相對(duì)分子質(zhì)量：2000～20000d；

具體鑒定方法包括如下步驟：

步驟一：采用甲酸提取法對(duì)樣品進(jìn)行處理與點(diǎn)樣；

步驟二：利用maldibiotyper高通量微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)經(jīng)過步驟一處理的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到質(zhì)譜圖；

步驟三：使用biotyper軟件，對(duì)得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，得到腸球菌質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)圖譜；

步驟四：將待檢測(cè)的腸球菌用腦心浸液瓊脂培養(yǎng)及分純，并進(jìn)行步驟一和步驟二處理；

步驟五：對(duì)待檢測(cè)的腸球菌質(zhì)譜圖進(jìn)行聚類分析。

1.2.1樣品處理與點(diǎn)樣采用甲酸提取法

1)向1.5mlep離心管中加入300μl去離子水；取待測(cè)樣本(一個(gè)菌落)5-10mg至離心管中。充分混勻；加入900μl無水乙醇，充分混勻；

2)13000rpm離心2min，倒去上清。再次離心，用移液槍完全吸取殘余的上清液，整個(gè)過程不觸碰沉淀。室溫下干燥沉淀2-3min；

3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混勻；再加入50μl的純乙腈，充分混勻；13000rpm離心2min，吸取上清置于另一新的離心管中；

4)取上清1μl置于maldi靶板上，室溫晾干，再加1μlhcca基質(zhì)液覆蓋樣品，室溫晾干后上機(jī)；

5)分別取等體積的標(biāo)準(zhǔn)肽溶液與基質(zhì)溶液混合后，取1μl混合液置于maldi靶板上，室溫晾干，待完全干燥后進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品各做三個(gè)平行孔；

1.2.2數(shù)據(jù)采集

放入已點(diǎn)好樣品和校準(zhǔn)品的靶板。打開flexcontrol，校準(zhǔn)儀器，先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系統(tǒng)誤差校正，再進(jìn)行待測(cè)樣本的質(zhì)譜分析，通過biotyper軟件進(jìn)行分析鑒定。

1.2.3建立數(shù)據(jù)庫的方法

按1.2.1.1的方法進(jìn)行樣品處理與點(diǎn)樣，每個(gè)平行樣品重復(fù)點(diǎn)3個(gè)樣品孔。每個(gè)樣品孔采集8張質(zhì)譜圖。每個(gè)菌株采集24張譜圖，共收集到240張并保存。使用biotyper軟件，分別調(diào)入所采集的每株腸球菌的質(zhì)譜圖，將此質(zhì)譜圖匯總(已有數(shù)據(jù)庫和新建數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行分析，該圖譜腸球菌質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

1.2.4臨床野生株的鑒定

取33株腸球菌臨床野生株，用腦心浸液瓊脂(bhi)培養(yǎng)及分純，

參照上述建庫時(shí)的處理方法，然后上機(jī)。

1.2.5結(jié)果判斷如表1所示為質(zhì)譜數(shù)據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)

表1

2結(jié)果

2.1建庫

經(jīng)過16srrna確認(rèn)的10株腸球菌臨床株，用于建立maldi-tofms數(shù)據(jù)庫，對(duì)10株菌全部進(jìn)行了數(shù)據(jù)采集與匯總，建立了標(biāo)準(zhǔn)圖譜，最終建成包含10株腸球菌信息的數(shù)據(jù)庫，如圖1所示。這10株腸球菌菌株的主要離子峰一致，峰譜穩(wěn)定；

2.2臨床野生株的鑒定

依次將1-33株腸球菌如圖2所示，分別進(jìn)行鑒定，分析與腸球菌數(shù)據(jù)庫中的匹配結(jié)果。經(jīng)maldi-tofms鑒定，33株腸球菌的匹配分值均大于2.300，表明鑒定結(jié)果的可信度很高。

2.3腸球菌maldi-tofms質(zhì)譜聚類分析結(jié)果

選取33株腸球菌質(zhì)譜圖進(jìn)行聚類分析，采用相似分值構(gòu)建系統(tǒng)樹，33株腸球菌聚類分型樹狀圖如圖3所示。差異程度0-1000表示菌株之間的同源性程度高低，差異程度越接近1000，表示菌株同源性越低，越接近0時(shí)表示菌株同源性越高。經(jīng)maldi-tofms分析33株腸球菌在差異程度為0.8時(shí)分成兩個(gè)主要的類別，用不同的顏色標(biāo)示，其中綠色為糞腸球菌共13株，紅色為屎腸球菌20株,1號(hào)菌株為糞腸球菌atcc29212，與5號(hào)菌株同源性最高，與屎腸球菌相比，糞腸球菌的親緣關(guān)系更近一些。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。