專利名稱：壬基酚人工抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種壬基酚人工抗原的合成方法，本發(fā)明利用琥珀酸酐法，將壬基酚上面的羥基進(jìn)行衍生化，以引進(jìn)能夠與蛋白反應(yīng)的功能團。利用改進(jìn)的碳二亞胺法將衍生物NP-HS與蛋白載體反應(yīng)，合成相應(yīng)的人工抗原，為壬基酚抗體制備提供技術(shù)支持。
背景技術(shù)：
壬基酚(Nonylophenol，NP)，是一種重要的精細(xì)化工原料和中間體，主要用于生產(chǎn)表面活性劑、也用于抗氧化劑、紡織印染助劑、潤滑油添加劑、農(nóng)藥乳化劑等領(lǐng)域，由于NP高度疏水性及化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，因此容易在環(huán)境中富集而廣泛分布，同時通過食物鏈對水生生物、動物及人類造成危害。有專家表明，NP具有雌激素效應(yīng)，可導(dǎo)致動物生殖系統(tǒng)的損害，同時對雄性動物的生殖功能也有影響，并對其血清中睪丸酮水平和某些生化指標(biāo)產(chǎn)生影響。為了確保人類安全與健康，建立快速、準(zhǔn)確監(jiān)測壬基酚等有害物質(zhì)的殘留是十分必要的。傳統(tǒng)的殘留分析方法包括氣相色譜法、液相色譜法、質(zhì)譜、薄層層析等，這些方法往往需要很復(fù)雜昂貴的儀器，而且需要經(jīng)過繁瑣的前處理，很難達(dá)到快速、簡便的現(xiàn)場檢測要求。而免疫檢測分析方法由于具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速等優(yōu)點，近年來備受人們的關(guān)注。因此，建立起NP的免疫快速檢測方法，對于實踐中批量化測定樣品中NP殘留意義重大。本試驗制備成功的人工抗原以及由此制備的高效價抗體，可為建立快速檢測NP殘留的免疫試劑盒提供可靠保證。壬基酚是小分子化合物，本身不具備免疫原性，不能直接刺激機體產(chǎn)生抗體，必須與連接到大分子載體上以形成較為理想的免疫原。在本實驗中，用改進(jìn)的碳二亞胺法合成壬基酚人工抗原NP-BSA，并對其進(jìn)行鑒定。然后以此人工抗原免疫balb/c小鼠，制備單克隆抗體，對NP的ELISA檢測方法進(jìn)行研究。為下一步研制壬基酚殘留檢測試劑盒建立很好的技術(shù)平臺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種壬基酚人工抗原的制備方法，該方法合成步驟簡單易操作，副反應(yīng)少，目標(biāo)物純度高。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施—種壬基酚人工抗原的制備方法，其步驟是(I)按摩爾比1:1. 3稱取壬基酚和琥珀酸酐置于500ml反應(yīng)瓶中，加入DMSO作為溶劑，90°C反應(yīng)Ih后冷卻至室溫(20-25°C，以下相同)。將冷卻的反應(yīng)液緩慢的加入到超純水中，邊滴加邊攪拌，溶液瞬間變成乳白色，上面浮著一層淡黃色的油狀物，將上述物質(zhì)進(jìn)行抽濾沉淀，用冰超純水洗滌后抽干，50°C烘干后重結(jié)晶3次，干燥得到的淡黃色油狀物即為NP-HS。
(2)按摩爾比30 :30 :1稱取N-羥基琥珀酰亞胺水溶性碳二亞胺牛血清白蛋白共溶于O. Olmol/IPBS中，4°C下攪拌反應(yīng)過夜。將上述溶液離心(5000r/min, IOmin),所得上清液為A液；按摩爾比30:6. 5的比例稱取NP-HS溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，用移液槍取1/2體積的上清液A，以邊滴加邊攪拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反應(yīng)3-5h。將反應(yīng)后的溶液離心(5000r/min，IOmin),上清液為B，取上清液B，以PBS(pH=7. 4)溶液做透析液，置4°C透析3天，每7-9h換一次透析液，除去未反應(yīng)的DMF、⑶C、NHS、NP等小分子物質(zhì)。將透析好的反應(yīng)液用棕色玻璃小瓶分裝后置于_40°C冰箱中冷凍過夜，然后轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機中進(jìn)行干燥，獲得一種壬基酚人工抗原，于_20°C冰箱保存。人工抗原的鑒定先根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果測定BSA及NP-BSA的分子量，再采用紫外掃描儀測定得到的壬基酚一牛血清白蛋白的偶聯(lián)比，分別在279 nm、278 n m波長處測定吸光度值，并計算偶聯(lián)比。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果壬基酚的物理化學(xué)性質(zhì)決定了在人工抗原的合成過程中可利用的活性基團僅有羥基，對此我們設(shè)計了對-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、碳二亞胺法、活潑酯法、琥珀酸酐法五種不同的人工抗原合成方法和技術(shù)方案，經(jīng)紫外掃描圖分析對-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、活潑酯法都沒有合成目標(biāo)物，僅碳二亞胺法和琥珀酸酐法合成了目標(biāo)物，但是碳二亞胺法合成的目標(biāo)物太少、得率較低。最后經(jīng)比較分析后確定琥珀酸酐法最優(yōu)，該方法合成步驟簡單易操作，副反應(yīng)少，目標(biāo)物得率高、純度高，所獲得的抗血清效價高。


圖1為一種SDS-PAGE實驗結(jié)果示意圖。電泳結(jié)果顯示新合成的NP-BSA與BSA相比其相對遷移率發(fā)生了改變。圖2為一種BSA(lg/L)紫外掃描示意圖。BSA紫外掃描圖顯示BSA最大特征吸收波長為279nm。圖3為一種NP-BSA (2g/L)紫外掃描示意圖。NP-BSA紫外掃描圖證實NP-BSA較之BSA其最大吸收波長發(fā)生了改變，由279變278，這是與NP-BSA物理化學(xué)性質(zhì)較之BSA發(fā)生了改變相適應(yīng)的。圖4為一種NP-BSA透析液紫外掃描示意圖。NP-BSA透析液紫外掃描圖證實新合成的人工抗原已透析干凈。圖5為一種NP抗血清效價示意圖。從圖5可看出NP抗血清的效價較高，為1. 024X 106。
具體實施例方式一種壬基酚人工抗原的制備方法，其步驟是(I)按摩爾比1:1. 3稱取壬基酚和琥珀酸酐置于500ml反應(yīng)瓶中，加入DMSO作為溶劑，90°C反應(yīng)Ih后冷卻至室溫(20-25°C，以下相同)。將冷卻的反應(yīng)液緩慢的加入到超純水中，邊滴加邊攪拌，溶液瞬間變成乳白色，上面浮著一層淡黃色的油狀物，將上述物質(zhì)進(jìn)行抽濾沉淀，用冰超純水洗滌后抽干，50°C烘干后重結(jié)晶3次，干燥得到的淡黃色油狀物即為壬基酚-琥珀酸半酯(NP-HS)。
(2)按摩爾比30 :30 :1稱取N-羥基琥珀酰亞胺水溶性碳二亞胺牛血清白蛋白共溶于O. Olmol/IPBS中，4°C下攪拌反應(yīng)過夜。將上述溶液離心(5000r/min, IOmin)上清液為A ;按摩爾比30:6. 5的比例稱取NP-HS溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，用移液槍取適量上清液A，以邊滴加邊攪拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反應(yīng)4h。將反應(yīng)后的溶液離心(5000r/min，lOmin)，上清液為B，取上清液B，以PBS (pH=7. 4)溶液做透析液，置4°C透析3天，每8h換一次透析液，除去未反應(yīng)的DMF、⑶C、NHS、NP等小分子物質(zhì)。將透析好的反應(yīng)液用棕色玻璃小瓶分裝后置于-400C冰箱中冷凍過夜,然后轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機中進(jìn)行干燥，于_20°C冰箱保存。2、人工抗原的鑒定 (I)SDS-PAGE 實驗分離膠12%(W/V)聚丙烯酰胺濃縮膠5%(W/V)丙烯酰胺a) 30%(ff/V)丙烯酰胺配方丙烯酰胺29gN-N’ -亞甲叉雙丙烯酰胺Ig加水至100ml，密封保存，不宜過久，pH>7. O時不可用。b ) 10% (ff/V) SDS 溶液SDS IOg蒸懼水溶解后,定容至100mL。c)1. 5mol/L 分離膠 buffer (ρΗ8· 8):Tris 堿18. 17g溶于80ml蒸餾水中用10mol/LHCl 調(diào) pH 至 8. 8，定容至 100ml。d)1. 0mol/L 濃縮膠 buffer (ρΗ6· 8):Tris 堿 12.1lg溶于80ml蒸餾水中用10mol/LHCl 調(diào) pH 至 6. 8,定容至 100ml。e)電極 buffer I&存液(5X , pH8. 3)Tris 喊 15.1g甘氨酸 94g10%SDS 50ml溶于900ml蒸餾水中，調(diào)pH至8· 3，定容至1000ml。f) 10% (ff/V)過硫酸銨(AP,臨用前配制)稱取AP Ig,蒸懼水溶解后定容至IOml。g) 1%(W/V) TEMED :取 TEMED0. 1ml，加蒸餾水定容至 10ml。h) 2 X SDS 凝膠上樣 buffer lOOmmol/L TrisHCI(pH6.H)
200mmol/L :::硫蘇糖醇(DTT)
4%(W/V)SDS (電泳級)
0.2%(W/V)溴酚藍(lán)
20%(W/V)甘油i)脫色液取甲醇400ml,蒸懼水500ml,冰醋酸100ml。j)染色液稱取考馬斯亮藍(lán)R-250 O. 25g，用脫色液溶解后定容至100ml。k)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
I) 12%(ff/V)分離膠配制(15ml)
蒸餾水4 3 ml
30%(W/V)丙烯酰胺溶液6.0 ml
1.5M Tris (pH8.8)3.8 ml
10%(W/V) SDS150 μ
10%(W/V)過硫酸銨150 μ
l%(W/V)TEMED600 μ 室溫混勻后，倒入垂直玻板之間，之后緩慢加入蒸餾水約Icm高即封閉，待凝。5%(ff/V)濃縮膠(成層膠)配方(5ml)待分離膠凝固后，將蒸餾水倒出，并用濾紙將余下的蒸餾水吸干凈，然后按一下操作配制濃縮膠
蒸餾水2.94 ml
30%(W/V)W烯酰胺溶液0.83 ml1.OM Tris (pH6.8)UCH ml
10% (WZV)SOS50 μ!
10%(W/V) AP50 μ
1%(W/V)TEMED500 μ 室溫混勻后，倒于分離膠之上，迅速插入點樣梳，待凝。操作步驟I)槽的準(zhǔn)備使用前裝好垂直板型電泳槽。2 )封膠用O. 8% w 1. 0% (W/V)瓊脂糖凝膠將玻片與橡膠、橡膠與電泳槽的接縫封好，以防聚丙烯酰胺凝膠及緩沖液的滲漏。3)灌膠灌得不宜過快，以免產(chǎn)生氣泡影響聚合，室溫放置干燥。4)預(yù)電泳凝膠完全凝固后，小心取出點樣梳，加入電極緩沖液，然后接通電源，上槽負(fù)極，下槽正極，80ν預(yù)電泳3 w 5min。5)上樣蛋白樣品1(^1^加上樣131^€61'1(^1^后沸水(100°0煮3^51^11。在低電壓下，用微量上樣器上樣，上樣量為2 μ g。(凝膠從左至右依次為Marker、BSA、BSA-NP)6)電泳樣品在濃縮膠中電泳約lh，待樣品進(jìn)入分離膠后，160v電泳4h左右。
附各泳道依次加入=Marker(分子量依次為 97. 4KD、66. 2KD、43. 0KD、31. OKD、20. 1KD)、BSA、BSA-BSA。7)染色、脫色電泳結(jié)束后，小心剝出凝膠，置染色缸中，用染色液浸泡過夜；次日將凝膠置于脫色液中，每隔2h換一次脫色液，直到背景清晰為止。8)分子量的測定a)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以凝膠的前沿或遷移距離最大的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為參考點，計算每種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率(Mr)Me=蛋白質(zhì)從原點遷移的距離/從原點到參考點的距離
以Mr值為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。b)待測樣品分子量的測定計算出待測蛋白質(zhì)的相對遷移率，查標(biāo)準(zhǔn)曲便可知其分子量。(2)紫外掃描圖譜分析采用紫外掃描儀測定得到的壬基酚-牛血清白蛋白的偶聯(lián)比，分別在279 nm、278 n m波長處測定吸光度值，并然后按照式(1廣(3)計算出NP-BSA的結(jié)合比。
V一式中，ε偶聯(lián)物、ε載體蛋白、ε半抗原分別為偶聯(lián)物、載體蛋白、半抗原在某一波長下的摩爾吸光系數(shù)，N為每摩爾載體蛋白上所偶聯(lián)的半抗原的摩爾數(shù)。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL)=l.45Α280-0· 74A260 ( 2)式中，A28tl、A26tl分別為該蛋白質(zhì)溶液在280、260nm下的吸光度值。A= ε克分子消光系數(shù)Cl(3)式中，A是該物質(zhì)在最大波長處的吸光度值，c是該物質(zhì)的濃度(mol/L)，I是比色杯的直徑(cm)，ε克分子消光系數(shù)是該物質(zhì)的克分子消光系數(shù)[I/(mol/cm)]。3、結(jié)果分析3.1SDS-PAGE 實驗結(jié)果(見圖1):從SDS-PAGE實驗結(jié)果同樣可以看出NP-BSA較之原來的BSA其分子量大小都發(fā)生了變化，NP和BSA發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成了新的物質(zhì)NP-BSA。計算得到NP-BSA的偶聯(lián)比為5:1。3. 2紫外掃描圖譜分析從以上紫外掃描圖可以看出NP-BSA合成成功，且最大吸收峰為278nm，這與BSA的最大吸收峰279nm不同,而且較之BSA的溶解度(本試驗中BSA已經(jīng)達(dá)到了其最大溶解度lg/L)偶聯(lián)的NP-BSA的溶解度有了較大的變化，在本實驗中可以達(dá)到2g/L以上。而且較之原來的BSA新合成的人工抗原其最大紫外吸收峰都發(fā)生了變化，且紫外峰形也發(fā)生了明顯的改變。3. 3小鼠陽性血清抗體效價測定評判標(biāo)準(zhǔn)為P/N 彡 2. 1，Ρ/Ν>0. 2。結(jié)果效價測定結(jié)果顯示效價為1. 024X 106。
權(quán)利要求
1.一種壬基酚人工抗原的制備方法，其步驟是(I)按摩爾比1:1. 3稱取壬基酚和琥珀酸酐置于500ml反應(yīng)瓶中，加入DMSO作為溶劑，90°C反應(yīng)Ih后冷卻至室溫，將冷卻的反應(yīng)液加入到超純水中，邊滴加邊攪拌，溶液變成乳白色，上面浮著一層淡黃色的油狀物，將上述物質(zhì)進(jìn)行抽濾沉淀，用冰超純水洗滌后抽干，50°C烘干后重結(jié)晶3次，干燥得到的淡黃色油狀物為NP-HS;(2)按摩爾比30 30 1稱取N-羥基琥珀酰亞胺水溶性碳二亞胺牛血清白蛋白共溶于O. Olmol/IPBS中，4°C下攪拌反應(yīng)過夜,將上述溶液離心5000r/min, IOmin,所得上清液為A液；按摩爾比30:6. 5的比例稱取NP-HS溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，用移液槍取1/2體積的上清液A，以邊滴加邊攪拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反應(yīng)3-5h，將反應(yīng)后的溶液離心5000r/min，IOmin,上清液為B，取上清液B，以PBS溶液做透析液，置4°C透析3天，每7-9h換一次透析液，除去未反應(yīng)的DMF、CDC、NHS、NP小分子物質(zhì)，將透析的反應(yīng)液用棕色玻璃小瓶分裝后置于_40°C冰箱中冷凍過夜，然后轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機中進(jìn)行干燥，獲得一種壬基酚人工抗原，于_20°C冰箱保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種壬基酚人工抗原的制備方法，其步驟(1)按摩爾比稱取壬基酚和琥珀酸酐置于反應(yīng)瓶中，加入DMSO作為溶劑，反應(yīng)后冷卻至室溫，將冷卻的反應(yīng)液加入到超純水中，邊滴加邊攪拌，溶液變成乳白色，將物質(zhì)進(jìn)行抽濾沉淀，用冰超純水洗滌后抽干，烘干后重結(jié)晶，干燥得到的淡黃色油狀物;(2)按摩爾比稱取N-羥基琥珀酰亞胺水溶性碳二亞胺牛血清白蛋白共溶于lPBS中，反應(yīng)過夜，離心；按摩爾比比例稱取NP-HS溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，溶解后，取上清液，邊滴加邊攪拌的方式加入到NP-HS溶液中，將反應(yīng)后的溶液離心，取上清液，將透析的反應(yīng)液置于冰箱中冷凍過夜，干燥，得壬基酚人工抗原。該方法合成步驟簡單易操作，副反應(yīng)少，目標(biāo)物純度高。
文檔編號C07K14/765GK103012582SQ201210533788
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者甘金華 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所