專利名稱：一種地西泮人工抗原的制備方法
技術領域：
一種地西泮人工抗原的制備方法，屬于生物化工技術領域。
背景技術：
地西泮(Diazepam)為苯二氮卓類鎮(zhèn)靜安眠藥，化學名稱為l-甲基-5-苯 基-7-氯-l,3-二氫-2H-l,4-苯并二氮卓-2-酮。其曾被用作動物飼料添加劑，作為生 長促進劑，具有使動物嗜睡少動，生長快且有改變肉質的作用。也用在屠宰和動 物檢疫之前，或將動物轉移屠宰之前，起鎮(zhèn)靜作用，以減輕動物緊張狀態(tài)，降低 動物傷害和死亡率。此類藥物常見嗜睡，可見無力、頭痛、暈眩、惡心、便秘，偶 見皮疹、肝損害、骨髓抑制等不良反應。若隨意在詞料中添加此類藥物，蓄積的 藥物通過食物鏈進入人體，將造成巨大的危害。為此許多國家將此類藥物列入禁 用藥物名單。目前，國內外有關地西泮的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、 氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、氣-質聯用法(GC-MS)、液-質聯用法(LC -MS)等，但這些方法不僅需要昂貴的儀器設備，對檢材的要求也比較高，需要 進一步的提純處理才能進行，這已經不能達到現代檢測對快速、方便、準確的 要求。近年來，國外已經開展了關于苯二氮卓類免疫分析方法的研究，但國內 目前在這方面還是一片空白。為了加強對國內肉制品的監(jiān)督力度和保障人民的 身體健康，有必要展開關于苯二氮卓類免疫分析方法的研究，有必要提供一種 有效的地西泮人工抗原的制備方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種地西泮人工抗原的制備方法，所制備的產品可用 于苯二氮卓類免疫分析方法的研究，為今后人們的研究提供了方便的途徑。
本發(fā)明的技術方案 一種地西泮人工抗原的制備方法，第一步為半抗原的 制備及檢測以地西泮，丁二酸酐為原料，利用付-克?；磻诘匚縻?位 苯環(huán)上引入羧基；第二步為人工抗原的制備及檢測利用混合酸酐法使之與牛 血清蛋白結合制備地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白。其反應方程式為
COC^COOH—BSA 地西泮 地西泮-3'-琥珀酸半酯 地西泮-牛血清蛋白工藝步驟為1) 人工半抗原的制備地西泮和丁二酸酐配料摩爾比為1:1,分別稱取無水氯化鋁2.5mmol和丁 二酸酐lmmol于50mL圓底燒瓶中，加入10mL硝基苯，4(TC條件下攪拌至固 體完全溶解；另稱取地西泮lmmol，分3次加入上述的反應液中，反應溫度逐 漸提高至70。C，反應過夜；在劇烈攪拌下，將反應液傾入適量冰水中，靜置分 層后，取有機層進行減壓蒸餾，得到的殘留用少量熱甲醇溶液溶解，低溫析出 沉淀，過濾、干燥得到0.8mmol半抗原備用；反應終點監(jiān)測采用薄層層析法進行監(jiān)測，硅膠薄板下端lcm處作一水平 線，吸取反應液lpL點于線上，點樣結束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析 液為甲苯:乙醚:乙酸:甲醇，體積比為60:30:9:1，展開至薄板0.35-0.4cm處，取 板，吹干溶劑；將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.53 處觀察到顯色點作為反應終點；2) 人工抗原的制備制備A液稱取O.lmmol半抗原于20mL燒杯中，加入5mL 二氧六環(huán)和0.2mL 的三乙胺，冷卻至5t:;然后加入0.15mL氯甲酸異丁酯，低溫下攪拌lh，此液 為A液；制備B液稱取0.003mmo1的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL 二氧六環(huán)的 溶液中，并用1N的氫氧化鈉調節(jié)pH8-9，低溫保存，此液為B液；在4'C低溫攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液，并用1N的氫氧化鈉溶液調 節(jié)pH，使pH保持在8-9; 4'C條件下，攪拌保存過夜，即得到人工抗原混合液; 將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.05M的碳酸氫鈉溶液和2X2L 的去離子水透析4-6天，使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗 原地西泮-牛血清蛋白。3) 地西泮人工抗原的鑒定偶聯比測定估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率(偶聯比率)的方法<formula>formula see original document page 4</formula>
雖很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量(或相對含量)的原 理建立起來的。分光光度法是利用物質對光的吸收與其濃度呈比例關系的原理 分別測定被偶聯的兩種分子濃度。在大分子與小分子偶聯物中，兩種分子均有 各自不同的紫外掃描光譜，并表現出光譜圖迭加的性質。摩爾吸收系數s:配制地西泮濃度為0， 10， 20， 30 iig'mL-1的20°/。乙醇溶 液，通過紫外掃描可知地西泮的最大吸收波長為253nm，在253nm處測吸光值， 每個濃度做平行樣。摩爾吸光系數計算為「吸光值/摩爾濃度。本發(fā)明計算得 s=8732.44 L，r1偶聯物蛋白濃度測定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200嗎'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30'C水浴 溫熱5分鐘，每個濃度做平行樣，在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光 值，從曲線上得到抗原溶液的相應的蛋白濃度。本發(fā)明計算得抗原溶液的蛋白 濃度為QJSmg'mL^偶聯比測定配制150收mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，將偶聯產物用 20%乙醇稀釋到lSOpg.mL-1,在242nm處測吸光值，以20%乙醇為空白，測出 的吸光值為Al， A2,則偶聯比率為Y: y = ["-4)/f]/(150x10-3/65000)，本發(fā)明 計算得Y"17。其中s為摩爾吸光系數(L'mor1)， 65000為牛血清蛋白的分子量，150xl(T3 為牛血清蛋白濃度(嗎'ml/1)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明合成了地西泮的人工抗原，合成步驟簡潔，有 效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足 國內對其研究的需要。


圖l地西泮人工半抗原的液相色譜圖。 圖2地西泮人工半抗原的質譜圖。 圖3地西泮人工抗原制備前后的紫外掃描圖。
具體實施方式
(1)人工半抗原的制備分別稱取2.5mmo1無水氯化鋁和lmmol 丁二酸酐于50mL圓底燒瓶中，加入 lOmL硝基苯，4(TC條件下攪拌至固體完全溶解。另稱取地西泮lmmol，分3次 加入上述的反應液當中，反應溫度逐漸提高至70°C，反應過夜。在劇烈攪拌下， 將反應液傾入一定量冰水中，靜置分層后，取有機層進行減壓蒸餾，得到的殘 留用少量熱甲醇溶液溶解，低溫析出沉淀，過濾、干燥得到0.8mmo1半抗原備 用。
反應終點監(jiān)測硅膠薄層板的制作，稱取硅膠12g，溶解在40rnL 0.5%質量 濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分攪拌成糊狀，超聲波振蕩l分鐘， 均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105。C的烘箱中活化lh， 最后放入干燥箱中備用。
薄層層析法檢測硅膠薄板下端lcm處作一水平線，吸取反應液lpL點于 線上，點樣結束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為甲苯乙醚乙酸 甲醇，體積比為60 : 30 : 9 : 1，展開至薄板0.35-0.4cm處，取板，吹干溶劑。 將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.53處觀察到顯色點 作為反應終點。
(2) 人工抗原的制備
制備A液稱取O.lmmol半抗原于20mL燒杯中，加入5mL 二氧六環(huán)和0.2mL 的三乙胺，冷卻至5。C。然后加入0.15mL氯甲酸異丁酯，低溫下攪拌lh，此液 為A液。
制備B液稱取0.003mmo1的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL 二氧六環(huán)組 成的溶液中，并用1N的氫氧化鈉調節(jié)pH8-9，低溫保存，此液為B液。
在4-C低溫攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液中，并用1N的氫氧化鈉溶液 調節(jié)pH，使pH保持在8-9。 4'C條件下，攪拌保存過夜，即得到人工抗原混合 液。
透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min，保存在4'C去離子水中備用。
將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.05M的碳酸氫鈉溶液和2 X2L的去離子水透析4-6天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即 得到地西泮人工抗原地西泮-牛血清蛋白。
(3) 地西泮人工抗原的鑒定
偶聯比測定估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率(偶聯比率)的方法，
雖然種類很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量(或相對含量) 的原理建立起來的.分光光度法是利用物質對光的吸收與其濃度呈比例關系的 原理分別測定被偶聯的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯物中，兩種分子 均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現出光譜圖迭加的性質。
摩爾吸收系數s:配制地西泮濃度為O， 10， 20， 30嗎'mL"的20。/。乙醇溶 液，通過紫外掃描可知地西泮的最大吸收波長為253nm，在253nm處測吸光值， 每個濃度做平行樣.摩爾吸光系數計算為s-吸光值/摩爾濃度。本發(fā)明計算得 s=8732.44 L，r1
偶聯物蛋白濃度測定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200 ixg'mU1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30。C水浴
溫熱5分鐘，每個濃度做平行樣.在595nrn處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光 值，從曲線上得到抗原溶液的相應的蛋白濃度。本發(fā)明計算得抗原溶液的蛋白 濃度為9.33mg'mL"。
偶聯比測定配制150嗎TIlL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，將偶聯產物用 20%乙醇稀釋到lSO^ig'mL-1,在242nm處測吸光值，以20%乙醇為空白，測出 的吸光值為A1， A2,則偶聯比率Y為"=[(4-乓)/^/(150><10—3/65000)，本發(fā)明
計算得Y"17。
其中s為摩爾吸光系數(L.mor1)， 65000為牛血清蛋白的分子量，150x10—3 為牛血清蛋白濃度(吸mU1)。
權利要求
1.一種地西泮人工抗原的制備方法，其特征是以地西泮，丁二酸酐為原料，利用付-克?；磻诘匚縻?位苯環(huán)上引入羧基；利用混合酸酐法使之與牛血清蛋白結合制備地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白；步驟為1)人工半抗原的制備地西泮和丁二酸酐配料摩爾比為1∶1，分別稱取無水氯化鋁2.5mmol和丁二酸酐1mmol于50mL圓底燒瓶中，加入10mL硝基苯，40℃條件下攪拌至固體完全溶解；另稱取地西泮1mmol，分3次加入上述的反應液中，反應溫度逐漸提高至70℃，反應過夜；在劇烈攪拌下，將反應液傾入適量冰水中，靜置分層后，取有機層進行減壓蒸餾，得到的殘留用少量熱甲醇溶液溶解，低溫析出沉淀，過濾、干燥得到0.8mmol半抗原備用；反應終點監(jiān)測采用薄層層析法進行監(jiān)測，硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應液1μL點于線上，點樣結束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為甲苯∶乙醚∶乙酸∶甲醇，體積比為60∶30∶9∶1，展開至薄板0.35-0.4cm處，取板，吹干溶劑；將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.53處觀察到顯色點作為反應終點；2)人工抗原的制備制備A液稱取0.1mmol半抗原于20mL燒杯中，加入5mL二氧六環(huán)和0.2mL的三乙胺，冷卻至5℃；然后加入0.15mL氯甲酸異丁酯，低溫下攪拌1h，此液為A液；制備B液稱取0.003mmol的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL二氧六環(huán)的溶液中，并用1N的氫氧化鈉調節(jié)pH8-9，低溫保存，此液為B液；在4℃低溫攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液，并用1N的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH，使pH保持在8-9；4℃條件下，攪拌保存過夜，即得到人工抗原混合液；將人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氫鈉溶液和2×2L的去離子水透析4-6天，使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原地西泮-牛血清蛋白。
全文摘要
一種地西泮人工抗原的制備方法，屬于生物化工技術領域。本發(fā)明第一步為半抗原的制備及檢測以地西泮，丁二酸酐為原料，利用付-克?；磻诘匚縻?位苯環(huán)上引入羧基；第二步為人工抗原的制備及檢測利用混合酸酐法使之與牛血清蛋白結合制備地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白。本發(fā)明合成了地西泮的人工抗原，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內對其研究的需要。
文檔編號C07K14/765GK101161678SQ200710135000
公開日2008年4月16日 申請日期2007年11月2日 優(yōu)先權日2007年11月2日
發(fā)明者彭池方, 徐一平, 李秋生, 昉 秦, 胡擁民, 胥傳來, 媛 袁, 偉 陳, 陶冠軍 申請人:江南大學