專利名稱：一種白喉類毒素疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種白喉類毒素疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
白喉類毒素疫苗由白喉?xiàng)U菌菌種制成，白喉?xiàng)U菌菌體分泌出來的毒素是單一的多肽鏈，不含糖基和輔基，蛋白質(zhì)由560個氨基酸組成，分子量為62kDa，是一種酶原，只有在蛋白酶的作用下，將其切成缺口毒素，才具有生物活性。等電點(diǎn)約為PH4. 1，在pH6時，加熱至55°C就很快失去活性而凝固。白喉類毒素包括A、B兩個片段，其中B片段是受體結(jié)合和 穿膜片段，A片段是毒性片段，通過阻抑蛋白合成中的酶活性，最終引起細(xì)胞死亡。它對遠(yuǎn)端組織和器官也可產(chǎn)生毒性，尤其是心臟及外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)?，F(xiàn)有的制備方法所得到的白喉類毒素疫苗選擇性差，質(zhì)量不高，純度低(400-600Lf/mg TN),色澤深,用聚丙烯酰胺電泳檢查,仍然是一個多種成分的混合體。特別是菌液分離、白喉毒素溶液的濃縮、白喉毒素的提純、脫鹽這些過程較為簡單粗放，有些工藝不符合GMP要求而被淘汰，有些工藝方法在大生產(chǎn)條件下使用會受到限制。例如菌液分離工藝中，一般大生產(chǎn)要處理的體積要達(dá)到500L以上，若采用離心則不太適合，處理的時間會很長，耗費(fèi)大量的勞動力；若采用帆布過濾除菌，存在過濾不徹底和帆布材料不符合GMP要求的缺陷；板框過濾的缺點(diǎn)是濾板易堵塞，過濾時間可能過長；切向流過濾不易堵塞，過濾速度也較理想，但對菌體、蛋白的剪切力較大。白喉類毒素溶液的濃縮可采用沉淀劑沉淀后用綢布過濾得到沉淀，然后重懸沉淀，但是綢布用到生產(chǎn)中不符合GMP要求；采用切向流過濾，同樣也存在對蛋白的剪切力較大和過濾速度較慢的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種白喉類毒素疫苗的制備方法，以提高白喉類毒素疫苗的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種白喉類毒素疫苗的制備方法將白喉?xiàng)U菌菌種經(jīng)傳代發(fā)酵，甲醛脫毒后，將培養(yǎng)液調(diào)節(jié)PH至6. 9^7. 5，然后用孔徑為O. 22、. 45Mm的中空纖維濾膜過濾除去菌體，濾液用孔徑為KT40KD中空纖維濾膜進(jìn)行超濾，直至濾液的體積為原體積的1/8 1/10，然后向?yàn)V液中加入質(zhì)量體積比為25% 27%的硫酸銨，第一次鹽析后過濾，向?yàn)V液中再次加入質(zhì)量體積比為159Γ19%的硫酸銨，第二次鹽析后離心分離，將離心后的沉淀用注射用水完全溶解后，再次用孔徑為IOlOKD的中空纖維濾膜進(jìn)行超濾，直至濾液中硫酸銨含量小于O. 025%。優(yōu)選的，超濾中所用的空纖維濾膜的孔徑為30KD。所述超濾的進(jìn)口壓力為I. 5 2. 5bar，回流口壓力為O. 2 lbar，流速為20(T240L/小時。優(yōu)選的，所述超濾的流速為220L/小時。本發(fā)明先將培養(yǎng)液用孔徑為O. 22、. 45Mffl的中空纖維濾膜除去菌體，再進(jìn)行精制，從而減少后續(xù)過濾工藝中菌體和其他雜質(zhì)碎片堆積引起的孔道堵塞；通過改進(jìn)鹽析方法，有效去除了培養(yǎng)液中的毒素蛋白和其他致敏原；培養(yǎng)液的濃縮和鹽析后的脫鹽方法采用的均是切向流超濾方法，減少了因?qū)Χ舅氐鞍椎募羟性斐傻目乖茐模苊饬说鞍椎某恋?，縮短了制備時間，提高了生產(chǎn)效率。


圖I是本發(fā)明的工藝流程圖；圖2是本發(fā)明中空纖維濾膜超濾的工作原理圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例I白喉類毒素疫苗的制備方法，包括以下步驟I)白喉類毒素的培養(yǎng)采用白喉?xiàng)U菌PW8株(CMCC 38007)，在馬丁培養(yǎng)基中培養(yǎng)5代后，轉(zhuǎn)入大罐中以深層攪拌，在34 36°C條件下表面通氣法培養(yǎng)48 50小時，培養(yǎng)結(jié)束后按培養(yǎng)量的O. 6% (V/V)加入甲醛溶液，3(T35°C殺菌30分鐘，用管道輸送至精制罐中。2)菌液分離取白喉類毒素培養(yǎng)液30L (3241^/1111)，用似!10)3調(diào)節(jié)溶液？!1值至6.9，采用中空纖維超濾系統(tǒng)中的微濾模塊(該系統(tǒng)型號為MUF-HF7美國PALL，其中包含中空纖維膜柱、隔膜泵、儲罐、必要的能夠承受3Bar以上壓力的管道、回流閥和濾出閥，此時所用中空纖維膜柱的孔徑為O. 22Mm)，對發(fā)酵液進(jìn)行切向流超濾，去除菌體，所述的切向流超濾步驟為開啟泵前，檢查管道流路，打開微濾柱管道濾出端和回流端的閥門，關(guān)閉超濾柱所有閥門，關(guān)閉低端排放閥門；打開泵控制開關(guān)，調(diào)整泵的控制旋鈕，使泵的進(jìn)口壓力達(dá)到1.5 3.5bar，回流口壓力達(dá)到O. 2"lbar,開始微濾，收集濾出端液體；待料液濃縮到5000ml開始洗濾，洗濾時，將洗濾用緩沖液出口連接到出液罐上，調(diào)整緩沖液出液的流速和濾出端流速相一致，洗濾到3飛倍，停止洗濾；洗濾停止后，關(guān)掉泵的電源開關(guān)，先打開濾出端的低位排放閥，收集系統(tǒng)內(nèi)的濾出液并合并到收集罐內(nèi)，待排放干凈后打開回流端的低位排放閥門，將系統(tǒng)內(nèi)的液體全部排放完畢。3)超濾濃縮收集濾出液I. 5L，用孔徑為30KD的中空纖維濾膜進(jìn)行切向流超濾濃縮，具體步驟為開啟泵前，檢查管道流路，打開超濾柱管道濾出端和回流端的閥門，關(guān)閉微濾柱所有閥門，關(guān)閉低端排放閥門；打開泵控制開關(guān)，調(diào)整泵的控制旋鈕，使泵的進(jìn)口壓力達(dá)到1.5 2.5bar，回流口德壓力達(dá)到O. 2 lbar，開始超濾，控制濾液的流速為200L/小時，收集回流端液體；待濃縮至原體積的1/8時，停止超濾濃縮。關(guān)掉泵的電源開關(guān)，先打開回流端的低位排放閥門，收集系統(tǒng)內(nèi)的回流液體，合并到濃縮液中，待回流液排放干凈后，再打開濾出端的低位排放閥門，將系統(tǒng)內(nèi)的濾出液全部排放完畢；收集濃縮液200ml。4)兩次鹽析將濃縮液用硫酸銨二段鹽析法進(jìn)行鹽析沉淀，一段鹽析時，向濃縮液中加入質(zhì)量體積比為25%的硫酸銨，靜置24小時，用板框?yàn)V器(型號為40*40*10)過濾，收集濾液230ml，在收集到的濾液中再次加入質(zhì)量體積比為19%的硫酸銨，靜置24小時，在低溫(2 8°C)離心機(jī)上離心,5020g, 30min,取糊狀沉淀70ml。
5)超濾脫鹽上述沉淀用注射用水300ml完全溶解后，采用中空纖維超濾系統(tǒng)中的超濾模塊(該系統(tǒng)型號為MUF-HF7包含中空纖維膜柱、隔膜泵、儲罐、必要的能夠承受3Bar以上壓力的管道、回流閥和濾出閥，此時所用中空纖維膜柱的孔徑為30KD，對上清液進(jìn)行切向流透析洗濾，所述洗濾步驟為開啟泵前，檢查管道流路，打開超濾柱管道濾出端和回流端的閥門，關(guān)閉微濾柱所有閥門，關(guān)閉低端排放閥門；打開泵控制開關(guān)，調(diào)整泵的控制旋鈕，使泵的進(jìn)口壓力達(dá)到I. 5^2. 5bar,回流口的壓力達(dá)到O. 2 lbar，開始超濾，控制濾液的流速為240L/小時，收集回流端液體；超濾脫鹽時，將脫鹽用緩沖液出口連接到出液罐上，并通過調(diào)整濾出閥和隔膜泵的頻率控制濾出液的流速，使緩沖液出液的流速和濾出端流速相一致，檢測樣品中殘余硫酸銨的質(zhì)量百分含量小于O. 025%時為合格，停止超濾脫鹽。得到白喉類毒素疫苗280ml，濃度為1140Lf/ml，批號為20090201。實(shí)施例2白喉類毒素疫苗的制備方法，包括以下步驟I)白喉類毒素的培養(yǎng)培養(yǎng)方法同實(shí)施例I。2)菌液分離取發(fā)酵液30L，用NaHCO3調(diào)節(jié)溶液pH值在7. 5，采用中空纖維超濾系統(tǒng)中的微濾模塊(該系統(tǒng)型號為MUF-HF7美國PALL，其中包含中空纖維膜柱、隔膜泵、儲罐、必要的能夠承受3Bar以上壓力的管道、回流閥和濾出閥，此時所用中空纖維膜柱的孔徑為O. 45Mm)，對發(fā)酵液進(jìn)行切向流超濾，去除菌體，所述的切向流超濾步驟為開啟泵前，檢查管道流路，打開微濾柱管道濾出端和回流端的閥門，關(guān)閉超濾柱所有閥門，關(guān)閉低端排放閥門；打開泵控制開關(guān)，調(diào)整泵的控制旋鈕，使泵的進(jìn)口壓力達(dá)到I. 5^2. 5bar,回流口德壓力達(dá)到O. 2"lbar,開始微濾，收集濾出端液體；待料液濃縮到一定體積時6000ml開始洗濾，洗濾時，將洗濾用緩沖液出口連接到出液罐上，調(diào)整緩沖液出液的流速和濾出端流速相一致，洗濾到所需要的倍數(shù)后3飛倍，停止洗濾。洗濾停止后，關(guān)掉泵的電源開關(guān)，先打開濾出端的低位排放閥，收集系統(tǒng)內(nèi)的濾出液并合并到收集罐內(nèi)，待排放干凈后打開回流端的低位排放閥門，將系統(tǒng)內(nèi)的液體全部排放完畢。3)超濾濃縮
收集濾出液I. 9L，用孔徑為30KD的中空纖維濾膜進(jìn)行切向流超濾濃縮，所述超濾步驟為開啟泵前，檢查管道流路，打開超濾柱管道濾出端和回流端的閥門，關(guān)閉微濾柱所有閥門，關(guān)閉低端排放閥門；打開泵控制開關(guān)，調(diào)整泵的控制旋鈕，使泵的進(jìn)口壓力達(dá)到I. 5^2. 5bar,回流口的壓力達(dá)到O. 2 lbar，開始超濾，控制濾液的流速為220L/小時，收集回流端液體；待濃縮至原體積的1/10時，停止超濾濃縮。關(guān)掉泵的電源開關(guān)，先打開回流端的低位排放閥門，收集系統(tǒng)內(nèi)的回流液體，合并到濃縮液中，待回流液排放干凈后，再打開濾出端的低位排放閥門，將系統(tǒng)內(nèi)的濾出液全部排放完畢，收集濃縮液230ml。4)兩次鹽析將濃縮好的樣品溶液230ml用硫酸銨二段鹽析法進(jìn)行鹽析沉淀，一段鹽析時，向 濃縮液中加入質(zhì)量體積比為27%的硫酸銨，靜置24小時，用板框?yàn)V器(型號為40*40*10)過濾，收集濾液270ml，再在收集到的濾液中加入質(zhì)量體積比為15 %的硫酸銨，靜置24小時，在低溫(2 8°C )離心機(jī)上離心,5020g, 30min,取糊狀沉淀90ml。5)超濾脫鹽沉淀用注射用水300ml完全溶解后，采用中空纖維超濾系統(tǒng)(該系統(tǒng)型號為MUF-HF7，包含中空纖維膜柱、隔膜泵、儲罐、必要的能夠承受3Bar以上壓力的管道、回流閥和濾出閥，此時所用中空纖維膜柱的孔徑為30KD，對上清液進(jìn)行切向流透析洗濾，所述洗濾步驟為開啟泵前，檢查管道流路，打開超濾柱管道濾出端和回流端的閥門，關(guān)閉微濾柱所有閥門，關(guān)閉低端排放閥門；打開泵控制開關(guān)，調(diào)整泵的控制旋鈕，使泵的進(jìn)口壓力達(dá)到1.5 2.5bar，回流口的壓力達(dá)到O. 2 lbar，開始超濾，控制濾液的流速為220L/小時，收集回流端液體。超濾脫鹽時，將脫鹽用緩沖液出口連接到出液罐上，并通過調(diào)整濾出閥和隔膜泵的頻率控制濾出液的流速，使緩沖液出液的流速和濾出端流速相一致，檢測樣品中殘余硫酸銨的質(zhì)量百分含量小于O. 025%為合格，停止超濾脫鹽。得到白喉類毒素疫苗290ml，濃度為11 IOLf/ml，批號為20090202。上述兩批疫苗的動物免疫效果試驗(yàn)，結(jié)果見表I。表I. 20090101、20090202批白喉類毒素疫苗的效價(jià)結(jié)果
Wk 1
2009010197 IU/ml
2009020291 IU/ml
傳統(tǒng)工藝均值 93 IU/ml本發(fā)明制備的兩個批次的白喉類毒素疫苗的各項(xiàng)生化檢測結(jié)果如下表2. 20090201、20090202批白喉類毒素疫苗的各項(xiàng)生化檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種白喉類毒素疫苗的制備方法，其特征在于將白喉?xiàng)U菌菌種經(jīng)傳代發(fā)酵，甲醛脫毒后，將培養(yǎng)液調(diào)節(jié)PH至6. 9^7. 5，然后用孔徑為O. 22、. 45Mm的中空纖維濾膜過濾除去菌體，濾液用孔徑為IOlOKD中空纖維濾膜進(jìn)行超濾，直至濾液的體積為原體積的1/8 1/10,然后向?yàn)V液中加入質(zhì)量體積比為25% 27%的硫酸銨鹽析,靜置24小時后過濾，向?yàn)V液中再次加入質(zhì)量體積比為15°/Γ19%的硫酸銨鹽析，靜置24小時后離心分離，將離心后的沉淀用注射用水完全溶解后，再次用孔徑為IOlOKD的中空纖維濾膜進(jìn)行超濾，直至濾液中硫酸銨的質(zhì)量百分含量小于O. 025%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白喉類毒素疫苗的制備方法，其特征在于超濾中所用的空纖維濾膜的孔徑為30KD。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白喉類毒素疫苗的制備方法，其特征在于所述超濾的進(jìn)口壓力為I. 5 2. 5bar，回流口壓力為O. 2 lbar，液體流速為20(T240L/小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的白喉類毒素疫苗的制備方法，其特征在于所述超濾的液體流速為220L/小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白喉類毒素疫苗的制備方法，該方法是以白喉?xiàng)U菌菌株為原料，經(jīng)過白喉類毒素的培養(yǎng)、菌液分離、超濾濃縮、兩次鹽析和超濾脫鹽等步驟制備而成的。本發(fā)明先將培養(yǎng)液用中空纖維濾膜除去菌體，再進(jìn)行精制，從而減少后續(xù)過濾工藝中菌體和其他雜質(zhì)碎片堆積引起的孔道堵塞；通過改進(jìn)鹽析方法，有效去除了培養(yǎng)液中的毒素蛋白和其他致敏原；培養(yǎng)液的濃縮和鹽析后的脫鹽方法采用的均是切向流超濾方法，減少了因?qū)Χ舅氐鞍椎募羟性斐傻目乖茐?，避免了蛋白的沉淀。本發(fā)明縮短了白喉類毒素疫苗的制備時間，提高了生產(chǎn)效率。
文檔編號C07K14/34GK102961740SQ20121052945
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者李佩珊, 陳亮, 白磊, 凌霜, 楊以梅, 楊海燕, 薛紅剛, 李新國 申請人:武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司