一種維生素d合成抗原、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種維生素D合成抗原及其制備方法，所述維生素D合成抗原為維生素D與蛋白載體的偶聯(lián)物，所述維生素D為25-羥基維生素D3或1,25-二羥維生素D3，所述蛋白載體為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白中的一種或多種。本發(fā)明還提供所述維生素D合成抗原在維生素D免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供維生素D檢測(cè)試劑盒，其集成了現(xiàn)有臨床維生素D檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)，可適用于所有酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光儀和時(shí)間分辨分析儀，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，且靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均可滿足檢測(cè)要求。采用本發(fā)明的通用性強(qiáng)的免疫吸附檢測(cè)試劑盒，可實(shí)現(xiàn)血清（或血漿）中維生素D的批量、快速檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】一種維生素D合成抗原、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種維生素D合成抗原、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素D是體內(nèi)一類非常重要的維生素，在體內(nèi)的主要作用是調(diào)節(jié)鈣磷的代謝，同時(shí)和機(jī)體的健康狀態(tài)也有很大的關(guān)系。
[0003]維生素D的主要循環(huán)形式是25-羥基維生素D (包括25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3)，它是最重要的維生素D新陳代謝產(chǎn)物，應(yīng)用廣泛。當(dāng)體內(nèi)缺乏維生素D時(shí)會(huì)引起一系列疾病。其中，1，25-二羥基維生素D3的生物學(xué)活性最大，I, 25-二羥基維生素D3可以促進(jìn)鈣的吸收，并具有其它重要的生物學(xué)功能。
[0004]由于維生素D的重要性，因此對(duì)于體內(nèi)維生素D的含量檢測(cè)也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。
[0005]由于維生素D的特殊分子結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)都沒(méi)有太好的檢測(cè)方法，一般來(lái)說(shuō)維生素D的檢測(cè)花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，需要特殊的設(shè)備等，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前用于測(cè)定25-羥基維生素D3的方法主要有放射競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合法(CPB)，放射免疫法(RIA)，高效液相色譜法(HPLC)，羅氏的 電化學(xué)發(fā)光法和英國(guó)IDS的酶聯(lián)免疫法等。分別簡(jiǎn)述如下:
[0006]( I)放射競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合法
[0007]Wei S，Tanaka H, Kubo T 等，A multiple assay for vitamin Dmetaboltes without high-performance liquid chromatography.AnalBiochem, 1994，222(2):359-365文獻(xiàn)中公開(kāi)了一種無(wú)需HPLC純化，僅0.5ml血清即可測(cè)定血清25(0H)D3含量的方法。主要步驟包括用乙腈提取血清，在C-18/0H柱和硅膠S印-Pak柱上分離和純化，最后用維生素D結(jié)合蛋白法定量測(cè)定25 (OH) D3，該方法有簡(jiǎn)便快速，樣本用量少、重復(fù)性好、可同時(shí)對(duì)維生素D的三種主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量等優(yōu)點(diǎn)，但回收率較低。
[0008](2)放射免疫法
[0009]《中華婦產(chǎn)科雜志》1993年第3期中報(bào)道了用放射免疫法測(cè)定血清中的25-(OH)D3，該方法應(yīng)用放射性元素標(biāo)記示蹤物，檢測(cè)結(jié)果與放射性受體測(cè)定法高度相關(guān)，具有方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，特異性好等優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)在于標(biāo)記的同位素不穩(wěn)定，操作時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求很高，且產(chǎn)生的輻射對(duì)操作人員健康有不利影響。
[0010](3)高效液相色譜法
[0011]即國(guó)標(biāo)和藥典中對(duì)維生素D的檢測(cè)方法。色譜分析法由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過(guò)程，不適合臨床大量樣本篩查。
[0012](4)電化學(xué)發(fā)光法
[0013]目前羅氏公司采用的是電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清中的25-(0H)D3，其原理是用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體，通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)定的抗原或抗體進(jìn)行定量或定性。但其技術(shù)通用性差，需要用專用的設(shè)備，且設(shè)備成本較高。
[0014](5)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法
[0015]應(yīng)用ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中的25(OH) D3含量?；驹硎菓?yīng)用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中25 (OH) D3水平。用多克隆抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被多抗的微孔中依次加入25 (OH) D3 (樣品)、生物素化的人25 (OH) D3抗原、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的25 (0H)D3呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(0D值)，計(jì)算樣品濃度。此類試劑盒的缺點(diǎn)是用生物素標(biāo)記25-羥基維生素D3，用HRP標(biāo)記親和素，且固相抗體選用多克隆抗體檢測(cè)，特異性不強(qiáng)，且檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明的目的是提供一種新型的維生素D合成抗原、其制備方法及應(yīng)用。
[0017]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種維生素D合成抗原，其為維生素D與蛋白載體的偶聯(lián)物，所述維生素D為25-羥基維生素D3或1，25- 二羥維生素D3，所述蛋白載體為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白中的一種或多種。其中，所述維生素D與蛋白載體的重量比為1:16~20。
[0018]本發(fā)明還提供制備上述維生素D合成抗原的方法，包括以下步驟:1)將載體蛋白溶于pH8.5的緩沖液中，得溶液A ;2)將維生素D溶于乙醇、二甲基亞砜或吡啶等試劑中，得溶液B ;3)分別向溶液A和B中加入活化劑，得到活化的蛋白載體和維生素D ;4)以N，N’ - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯、1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺等為偶聯(lián)劑，將上述活化的蛋白載體和維生素D進(jìn)行偶聯(lián)；5)透析、干燥，即得維生素D合成抗原。
[0019]其中，步驟I)中所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液或Tris緩沖液。
[0020]步驟3)中所述活化劑為含乙二胺和乙二胺二鹽酸鹽的磷酸氫二鈉溶液、4- 二甲氨基吡啶-丙酮混合液、戊二醛或甲醛等?；罨瘎﹥?yōu)選為含乙二胺和乙二胺二鹽酸鹽的0.05M磷酸氫二鈉溶液ρΗΙΟ.4，其中乙二胺濃度為10%(v/v)，乙二胺二鹽酸鹽濃度為20mg/ml。更優(yōu)選活化劑為質(zhì)量比21:80的4- 二甲氨基吡啶-丙酮混合液。
[0021]本發(fā)明還提供上述維生素D合成抗原在維生素D免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用，其是將所述維生素D合成抗原與標(biāo)記物結(jié)合作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原，通過(guò)與樣品中的維生素D競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合維生素D單克隆抗體，從而檢測(cè)樣品中的維生素D含量。
[0022]其中，所述標(biāo)記物為:
[0023]a)辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶；
[0024]b )吖啶酯類化合物；或
[0025]c)螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、2_[ (4_氰基苯基)甲基]-1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷-1, 4，7，10-四乙酸(DOTA)或4，7- 二氯磺基苯-1, 10-菲羅啉-2，9- 二羧酸(BCPDA)等雙功能螯合劑。
[0026]所述維生素D單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。[0027]本發(fā)明進(jìn)一步提供維生素D免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒，其包括包被維生素D單克隆抗體的酶標(biāo)板、上述維生素D合成抗原經(jīng)標(biāo)記物標(biāo)記后得到的競(jìng)爭(zhēng)性抗原。
[0028]其中，所述維生素D單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。
[0029]所述標(biāo)記物為:
[0030]a)辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶；
[0031 ] b)吖啶酯類化合物；或
[0032]c)螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、2_[ (4_氰基苯基)甲基]-1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷-1, 4，7，10-四乙酸(DOTA)或4，7- 二氯磺基苯-1, 10-菲羅啉-2，9- 二羧酸(BCPDA)等雙功能螯合劑。 [0033]優(yōu)選前述檢測(cè)試劑盒中還包括洗滌液、維生素D標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、反應(yīng)終止液等中的一種或多種。
[0034]本發(fā)明首次提供維生素D合成抗原及其制備方法，將小分子的維生素D直接連接于載體蛋白上，并通過(guò)在蛋白載體上連接免疫檢驗(yàn)用的示蹤物，例如辣根過(guò)氧化物酶(或堿性磷酸酶)、熒光素(如鑭系元素螯合物)、化學(xué)發(fā)光劑(魯米諾或吖啶酯)等，因此，可適用于大多數(shù)免疫學(xué)檢測(cè)方法。
[0035]本發(fā)明提供的維生素D檢測(cè)試劑盒，其集成了現(xiàn)有臨床維生素D檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)，可適用于所有酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光儀和時(shí)間分辨分析儀，實(shí)現(xiàn)了一步檢測(cè)法，與兩步法相比，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，且靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均可滿足檢測(cè)要求。采用本發(fā)明的通用性強(qiáng)的免疫吸附檢測(cè)試劑盒，可實(shí)現(xiàn)血清(或血漿)中維生素D的批量、快速檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0037]實(shí)施例1 25-羥基維生素D3抗原的合成及酶聯(lián)免疫試劑盒的制備
[0038]1.1 25-羥基維生素D3抗原的合成
[0039]A、將IOOmg牛血清白蛋白(BSA)溶于IOml pH8.5 0.05M的磷酸鹽緩沖液中；
[0040]B、將5mg 25-羥基維生素D3溶于0.5ml乙醇中，再加入二琥珀酰亞胺基碳酸酯IOSmg (預(yù)先溶于400μ I 二甲基甲酰胺中)，室溫下將所述混合物避光攪拌過(guò)夜(一般為16~22h)；
[0041]C、向溶解的牛血清白蛋白液中加入2ml含乙二胺和乙二胺二鹽酸鹽的0.05MρΗΙΟ.4的磷酸氫二鈉溶液(磷酸氫二鈉緩沖液中乙二胺濃度為10v/v%，乙二胺二鹽酸鹽濃度為20mg/ml)，在室溫下反應(yīng)3~4小時(shí)；
[0042]D、反應(yīng)完成后向C所得溶液中加入37%甲醛溶液1ml，室溫下避光攪拌均勻；
[0043]E、將B所得溶液滴加至D的溶液中，室溫下避光攪拌過(guò)夜；
[0044]F、將終產(chǎn)物用0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液透析16小時(shí)，每4小時(shí)更換一次透析液。
[0045]1.2用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記合成抗原
[0046]G、稱取5mg HRP溶解于Iml蒸餾水中；
[0047]H、向上述溶液中加入0.2ml新配制的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；
[0048]1、將上述溶液裝入透析袋中，用ImM pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過(guò)夜；[0049]J、向透析后的溶液中加入20 μ I 0.2Μ ρΗ9.5碳酸鹽緩沖液，使上述醛化HRP的pH值升高到9.0~9.5，然后立即加入IOmg 25-羥基維生素D3合成抗原(預(yù)先溶于Iml 0.01M碳酸鹽緩沖液中)，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)；
[0050]K、向其中加入0.1ml新配制的4mg/ml NaBH4溶液，混勻，4°C放置2小時(shí)；
[0051]L、將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M pH7.4 PBS液透析，4°C過(guò)夜；
[0052]M、將透析后的溶液轉(zhuǎn)移至合適的容器內(nèi)，攪拌下逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4°C放置I小時(shí)；
[0053]N、3000rpm離心30分鐘，棄上清；沉淀物用半飽和硫酸銨溶液洗二次，最后將沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS液中； [0054]O、將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析，去除銨離子后，10，OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，_20°C冰凍保存。
[0055]1.325-羥基維生素D3的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備
[0056]在96孔板上包被25-羥基維生素D3的單克隆抗體(購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)，以上述得到的標(biāo)記抗原作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原，配制酶工作液，制備定標(biāo)血清中值質(zhì)控血清和高值質(zhì)控血清(新生牛血清含適量25-羥基維生素D3)，配制底物液A (含0.1%過(guò)氧化氫、0.1M醋酸鈉和IOmM檸檬酸)、底物液B (含0.05%四甲基聯(lián)苯胺、0.2%檸檬酸和10%丙三醇)、樣本稀釋液(IOmmoI/L磷酸鹽緩沖液)、終止液(2M硫酸)和濃縮洗滌液(含5%Tween20和0.2M磷酸鹽緩沖液)，即得25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒(競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫試劑盒)。
[0057]實(shí)施例2 25-羥基維生素D3抗原的合成及化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒的制備
[0058]1.1 25-羥基維生素D3抗原的合成
[0059]A、將IOOmg卵清蛋白溶于8ml pH8.5 0.05M的硼酸鹽緩沖液中；
[0060]B、將25-羥基維生素D35mg溶于0.5ml無(wú)水吡啶中；
[0061]C、向溶解的卵清蛋白溶液中加入200μ I 4-二甲氨基吡啶(42mg)和丙酮(200 μ I)混合液，室溫下避光攪拌過(guò)夜；
[0062]D、向B的溶液中加入二琥珀酰亞胺基碳酸酯108mg(預(yù)先溶于400 μ I 二甲基甲酰胺)，室溫下將所述混合物避光攪拌過(guò)夜；
[0063]Ε、將1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽IOmg溶于lmlpH8.5 0.05M的硼酸鹽緩沖液中，然后滴加至D和C的混合液中，室溫下避光攪拌過(guò)夜；
[0064]F、將終產(chǎn)物用0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液透析16小時(shí)，每4小時(shí)更換一次透析液。
[0065]1.2用吖唳酯標(biāo)記合成抗原
[0066]G、取25-羥基維生素D3合成抗原Img溶于800 μ I磷酸鹽緩沖液(0.lmol/L,ρΗ8.0)中；
[0067]H、取吖啶酯20 μ I溶于180 μ I DMF中；
[0068]1、取吖啶酯溶液160 μ I分4次加入抗原溶液中，每次加入后搖勻，室溫避光反應(yīng)20min ；
[0069]J、反應(yīng)結(jié)束后加入賴氨酸(50mg/ml) 400 μ I,放置15min以終止反應(yīng)；
[0070]K、用磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH6.3) 4°C避光透析24小時(shí)，期間換液6次；
[0071]L、取葡聚糖凝膠G-25作為層析柱填料純化，柱(0.8CmX34Cm)預(yù)先用PBS(10mmol/L, pH6.3)平衡，上樣后用同一緩沖液洗脫，分布收集，測(cè)量收集管發(fā)光強(qiáng)度，高峰管合并4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0072]1.3 25-羥基維生素D3的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒的制備
[0073]在96孔板上包被25-羥基維生素D3的單克隆抗體(購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)，以上述得到的標(biāo)記抗原作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原制備標(biāo)記物溶液，配制樣本稀釋液(10mmol/L磷酸鹽緩沖液)、底物液A (含0.1M硝酸和0.1M過(guò)氧化氫)、底物液B (含0.2M氫氧化鈉和2%TritonX-100)、濃縮洗液(含5%Tween20和0.2M磷酸鹽緩沖液)，、定標(biāo)血清、中值質(zhì)控血清和高值質(zhì)控血清(新生牛血清含適量25-羥基維生素D3)，即得25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒(競(jìng)爭(zhēng)法化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒)。
[0074]實(shí)施例3 I, 25- 二羥基維生素D3抗原的合成及時(shí)間分辨免疫試劑盒的制備
[0075]1.1 I, 25- 二羥基維生素D3抗原的合成
[0076]Ajf 80mg血藍(lán)蛋白溶于5ml pH8.50.05M的Tris-鹽酸緩沖液中；
[0077]B、將1，25- 二羥基維生素D35mg溶于0.6ml 二甲基亞砜中溶解；將3.5mg賴氨酸及3mg 1-羥基苯并三氮唑溶于0.25ml 二甲基乙酰胺中，加入16 μ I N, N’-二環(huán)己基碳二亞胺，室溫下?lián)u床反應(yīng)I小時(shí)，再加入1.5mg 4-二甲氨基吡啶，將混合液加入1，25-二羥基維生素D3的二甲基亞砜溶液中，室溫避光攪拌反應(yīng)5小時(shí)，產(chǎn)物真空干燥；
[0078]C、向溶解的血藍(lán)蛋白溶液中逐滴加入2ml戊二醛，充分混勻；
[0079]D、將B中得到的產(chǎn)物溶于0.5ml 二甲基亞砜，并向其中滴加血藍(lán)蛋白溶液，37°C恒溫?fù)u床反應(yīng)2h ；
[0080]E、將終產(chǎn)物用0.01·5M pH7.4磷酸鹽緩沖液4°C透析24小時(shí)，每4小時(shí)更換一次透析液。
[0081]1.2用螯合有稀土離子的雙功能螯合劑標(biāo)記1，25- 二羥基維生素D3合成抗原
[0082]F、用Tris-HCl緩沖液(0.05M, pH7.8)溶解EuCl3 (或任一種稀土離子化合物，如Sm3+、Tb3+、Dy3+)，使其濃度為 lO-W/L;
[0083]G、用上述溶液稀釋螯合劑二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，使稀土離子和螯合劑的摩爾比為2:1;
[0084]H、將上述溶液置于37°C恒溫水浴中加熱反應(yīng)2小時(shí)，制備雙功能螯合標(biāo)記試劑；
[0085]1、冷凍干燥上述螯合產(chǎn)物；
[0086]J、將上述冷凍干燥螯合物Img溶于50 μ I 二甲基甲酰胺(DMF);
[0087]K、將1，25- 二羥基維生素D3合成抗原Img溶于500 μ I pH9.1 0.05Μ的碳酸鹽緩沖液中；
[0088]L、將溶解的螯合物分成4份，每2分鐘1份加入溶解的抗原溶液中，室溫避光攪拌反應(yīng)30分鐘;
[0089]Μ、取葡聚糖凝膠G-50作為層析填料，裝柱后用水進(jìn)行壓柱流速控制在2~3ml/min,柱子壓好后,用0.1mmol/LNaOH對(duì)柱子進(jìn)行處理,流速控制在2~3ml/min, 2個(gè)柱體積即可。然后用水洗平，用柱平衡液對(duì)純化柱進(jìn)行平衡，大約lh，柱平衡液為0.1%高純度BSA水溶液，用ρΗ8.0的0.05Μ NH4HCO3為洗脫液，洗脫液也可以是ρΗ7.8的0.05MTris_HCl (含
0.9%NaCl)，洗脫流速為lml/min，分離終產(chǎn)物。收集蛋白濃度較高的幾管合并，加入等倍甘油-20°C凍存。
[0090]1.31，25- 二羥基維生素D3時(shí)間分辨免疫試劑盒的制備[0091 ] 在96孔板上包被1，25- 二羥基維生素D3的單克隆抗體(購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)，以上述得到的標(biāo)記抗原作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原制備標(biāo)記物溶液，制備定標(biāo)血清、中值質(zhì)控血清和高值質(zhì)控血清(新生牛血清含適量1，25- 二羥基維生素D3)，配制實(shí)驗(yàn)緩沖液(含1%牛血清白蛋白、含0.02%乙二胺四乙酸二鈉的Tris-HCl緩沖液)、增強(qiáng)液(含2% TritonX_100、6%冰醋酸和0.005%β -NTA)和濃縮洗液(含5%Tween20和0.2MTris-HCl緩沖液)，即得1，25- 二羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒(競(jìng)爭(zhēng)法時(shí)間分辨免疫試劑盒)。
[0092]實(shí)施例4 25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
[0093]操作步驟如下:
[0094]A、取實(shí)施例1中制備的25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒，向相應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中加入50 μ L稀釋的定標(biāo)血清、質(zhì)控血清或樣本，再加入50 μ L的酶工作液。貼上封口膠，于37°C條件下孵育I小時(shí)。
[0095]B、用工作洗滌液洗板5次；向每孔加入300 μ L工作洗滌液，在進(jìn)行下一步操作前，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍打以除去殘留的工作洗滌液。
[0096]C、向每孔加入50 μ L的底物液A和50 μ L的底物液B，貼上封口膠，于37°C下孵育，恒溫培養(yǎng)箱或恒溫鼓風(fēng)干燥箱中反應(yīng)15分鐘。
[0097]D、向每孔加入50 μ L終止液。在加入終止液后立即于450nm、630nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。
[0098]E、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，25-0H-D3濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行指數(shù)曲線擬合。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和每 個(gè)樣本檢測(cè)的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到對(duì)應(yīng)的25-0H-D3濃度值(μ g/L或 nmol/L)。
[0099]試劑盒性能分析:
[0100](1)25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果的比較
[0101]選擇代表較大25-羥基維生素D3范圍(0-100 μ g/L)的10個(gè)樣品，分別采用上述兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，在比較數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)分析:相關(guān)系數(shù)(r)> 0.90，偏差< 15%。
[0102](2)靈敏度檢測(cè)
[0103]對(duì)樣本進(jìn)行濃度梯度稀釋，以稀釋液作為檢測(cè)樣本，平行測(cè)定10次，檢測(cè)結(jié)果的平均吸光度減去兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差SD值所對(duì)應(yīng)的濃度，結(jié)果不高于5 μ g/L。
[0104](3)批內(nèi)精密度檢測(cè)
[0105]用中值質(zhì)控血清，平行測(cè)定10次，CV值< 10%。
[0106](4)線性范圍
[0107]在試劑盒分析范圍(5-100 μ g/L)內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)(r) ^ 0.990.[0108](5)特異性分析
[0109]樣品中維生素D3濃度<100 μ g/L時(shí)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響，即與未加入維生素D3的同一份樣本檢測(cè)結(jié)果相比，其結(jié)果偏差< 10%。
[0110]實(shí)施例5 25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
[0111]操作步驟如下:
[0112]A、取實(shí)施例2中制備的25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒，向相應(yīng)的包被板微孔中加入50 μ L已稀釋好的定標(biāo)血清、質(zhì)控血清或樣本，再加入50 μ L的標(biāo)記物工作液。貼上封口膠，于37°C條件下孵育I小時(shí)。[0113]B、用工作洗滌液洗板5次；向每孔加入300 μ L工作洗滌液，在進(jìn)行下一步操作前，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍打以除去殘留的工作洗滌液。
[0114]C、向每孔加入50 μ L的底物液A和50 μ L的底物液B。
[0115]D、加入底物液后立即于化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上讀取結(jié)果。
[0116]Ε、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，25-0H-D3濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行指數(shù)曲線擬合。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和每個(gè)樣本檢測(cè)的光強(qiáng)度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到對(duì)應(yīng)的25-0H-D3濃度值(μ g/L或nmol/L)。試劑盒性能分析:
[0117](I) 25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒與高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果的比較
[0118]選擇代表較大25-羥基維生素D3范圍(0-100 μ g/L)的10個(gè)樣品，分別采用上述兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，在比較數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)分析:相關(guān)系數(shù)(r)> 0.90，偏差< 15%。
[0119](2)靈敏度檢測(cè)
[0120]對(duì)樣本進(jìn)行濃度梯度稀釋，以稀釋液作為檢測(cè)樣本，平行測(cè)定10次，檢測(cè)結(jié)果的平均吸光度減去兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差SD值所對(duì)應(yīng)的濃度，結(jié)果不高于5 μ g/L。
[0121](3)批內(nèi)精密度檢測(cè)
[0122]用中值質(zhì)控血清，平行測(cè)定10次，CV值< 10%。
[0123](4)線性范圍
[0124]在試劑盒分析范圍(5-100 μ g/L)內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)(r) ^ 0.990.[0125](5)特異性分析
[0126]樣品中維生素D3濃度<100 μ g/L時(shí)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響，即與未加入維生素D3的同一份樣本檢測(cè)結(jié)果相比，其結(jié)果偏差< 10%。
[0127]實(shí)施例6 I, 25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
[0128]操作步驟如下:
[0129]A、取實(shí)施例3中制備的1，25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒，向相應(yīng)的包被板微孔中加入50 μ L已稀釋好的定標(biāo)血清、質(zhì)控血清或樣本，再加入50 μ L的銪標(biāo)記物工作液。貼上封口膠，振蕩器緩慢震蕩5分鐘，于37°C條件下孵育I小時(shí)。
[0130]B、用工作洗滌液洗板5次；向每孔加入300μ L工作洗滌液，在進(jìn)行下一步操作前，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍打以除去殘留的工作洗滌液。
[0131]C、向每孔加入100 μ L的增強(qiáng)液，于振蕩器上緩慢震蕩5分鐘。
[0132]D、用時(shí)間分辨免疫熒光分析儀檢測(cè)。
[0133]Ε、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以熒光值為縱坐標(biāo)，1，25- (OH) 2_D3濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行指數(shù)曲線擬合。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和每個(gè)樣本檢測(cè)的熒光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到對(duì)應(yīng)的1，25- (OH)2-D3濃度值(ng/L或pmol/L)。試劑盒性能分析:
[0134](1)1，25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒與高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果的比較
[0135]選擇代表較大1，25- 二羥基維生素D3范圍(0_240ng/L)的10個(gè)樣品通過(guò)兩種方法檢測(cè)，在比較數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)分析:相關(guān)系數(shù)(r) ^ 0.90，偏差< 15%。
[0136](2)靈敏度檢測(cè)
[0137]對(duì)樣本進(jìn)行濃度梯度稀釋，以稀釋液作為檢測(cè)樣本，平行測(cè)定10次，檢測(cè)結(jié)果的平均吸光度減去兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差SD值所對(duì)應(yīng)的濃度，結(jié)果不高于3ng/L。
[0138](3)批內(nèi)精密度檢測(cè)[0139]用中值質(zhì)控血清，平行測(cè)定10次，CV值≤10%。
[0140](4)線性范圍
[0141]在試劑盒分析范圍(3-240ng/L)內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)(r)≥0.990。
[0142](5)特異性分析
[0143]樣品中維生素D3濃度< 10 μ g/L時(shí)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響，即與未加入維生素D3的同一份樣本檢測(cè)結(jié)果相比，其結(jié)果偏差< 10%。
[0144]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種維生素D合成抗原，其特征在于，其為維生素D與蛋白載體的偶聯(lián)物，所述維生素D為25-羥基維生素D3或1，25- 二羥維生素D3，所述蛋白載體為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白中的一種或多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成抗原，其特征在于，所述維生素D與蛋白載體的重量比為1:16~20。
3.制備權(quán)利要求1或2所述維生素D合成抗原的方法，其特征在于，包括步驟: 1)將蛋白載體溶于PH8.5的緩沖液中，得溶液A ; 2)將維生素D溶于乙醇、二甲基亞砜或吡啶中，得溶液B； 3)分別向溶液A和B中加入活化劑，得到活化的蛋白載體和維生素D； 4)以N，N’- 二琥珀酰亞胺基碳酸酯、1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺為偶聯(lián)劑，將上述活化的蛋白載體和維生素D進(jìn)行偶聯(lián)； 5)透析、干燥，即得維生素D合成抗原； 其中，步驟3)中所述活化劑為含乙二胺和乙二胺二鹽酸鹽的磷酸氫二鈉溶液、4-二甲氨基吡啶-丙酮混合液、 戊二醛或甲醛。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液或Tris緩沖液。
5.權(quán)利要求1或2所述維生素D合成抗原在維生素D免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將所述維生素D合成抗原與標(biāo)記物結(jié)合作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原，通過(guò)與樣品中的維生素D競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合維生素D單克隆抗體，從而檢測(cè)樣品中的維生素D含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述標(biāo)記物為: a)辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶； b)吖啶酯類化合物；或 c)螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸、2_[(4-氰基苯基)甲基]_1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸或4，7-二氯磺基苯-1，10-菲羅啉-2，9-二羧酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述維生素D單克隆抗體為Abcam公司的維生素D單抗產(chǎn)品。
9.維生素D免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其包括包被維生素D單克隆抗體的酶標(biāo)板、權(quán)利要求1或2所述的維生素D合成抗原經(jīng)標(biāo)記物標(biāo)記后得到的競(jìng)爭(zhēng)性抗原； 其中，所述維生素D單克隆抗體為Abcam公司的維生素D單抗產(chǎn)品；所述標(biāo)記物為:a)辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶；b)魯米諾或吖啶酯類化合物；或c)螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸、2_[ (4-氰基苯基)甲基]_1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸或4，7- 二氯磺基苯-1，10-菲羅啉-2，9- 二羧酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括洗滌液、維生素D標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、反應(yīng)終止液中的一種或多種。
【文檔編號(hào)】C07K14/77GK103588872SQ201210287219
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月13日
【發(fā)明者】楊奇, 崔建華 申請(qǐng)人:北京博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司