微生物及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了微生物及其應用。該微生物命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通保藏中心的保藏號為CGMCC No.12324。堿性果膠酶的分子量為44.3kDa，肽指紋圖譜表明該酶為果膠酸裂解酶，其最適溫度和最適反應pH分別為50℃和9.0，溫度穩(wěn)定性范圍在50℃以下，在pH5?11范圍內(nèi)均表現(xiàn)出比較好的穩(wěn)定性。CGMCC No.1232420160331
【專利說明】
微生物及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體設及一種微生物及其用于生產(chǎn)果膠酶的應 用。
【背景技術】
[0002] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)芽抱桿菌屬的一種需氧菌，因其易在枯草浸 汁中繁殖而得名。枯草芽抱桿菌單個細胞0.7~0.8X2~3皿，著色均勻，無芙膜，周生鞭毛， 能運動，為革蘭氏陽性菌。芽抱0.6~0.9X1.0~1.5皿，楠圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏， 芽抱形成后菌體不膨大。菌落表面粗糖不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時， 常形成皺釀。枯草芽抱桿菌可利用蛋白質、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成嗎I噪，還能合成 維生素81、82、86、煙酸等多種站矣維生素，提高動物體內(nèi)干擾素和巨隧細胞的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明人從自然醇化3年W上的煙葉表面，經(jīng)分離、篩選，獲得了一株菌株，該微生物 菌株命名為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)PBl，發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，采用該微生物菌株 所產(chǎn)的堿性果膠酶，酶活高達19.抓/mL，可應用于降低果膠質含量及其它需要在堿性環(huán)境 下操作的領域。酶活采用DNS法測定，酶活定義為:在50°C，pH9.4的條件下，每分鐘水解果膠 釋放Iwiiol半乳糖醒酸的酶量定義為一個酶活力單位。
[0004] 該枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)PBl于2016年03月31日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱CGMCC)，經(jīng)檢測為存活，在該中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中屯、的保藏號為CGMCC No. 12324，自2016年03月31日起保存30 年，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
[0005] 本發(fā)明的微生物在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、保藏，命名為 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)PBl，保藏號為CGMCC No. 12324。
[0006] 本發(fā)明微生物的16S rRNA基因序列如下（Genbank Accession number : KU904502)：
[0007] CAGCAGGGGCGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAA CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAG GTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATG AAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACC TAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTG GGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAAC TGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACC AGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCACGCC GTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTA AGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCA TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCC CCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC GAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG GTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAG CGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGC TGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC ACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGTGAACAGGATGTT
[000引本發(fā)明的目的之二是提供上述微生物用于生產(chǎn)堿性果膠酶的應用。
[0009] 本發(fā)明的目的之=是提供上述微生物用于降解果膠質的應用。
[0010] 本發(fā)明的目的之四還提供上述微生物生產(chǎn)的堿性果膠酶。
[0011] 本發(fā)明得到的微生物菌株，可產(chǎn)生一種堿性果膠酶，通過對該果膠酶的酶學特性 研究，表明其最適溫度和最適反應pH分別為50°C和9.0,溫度穩(wěn)定性范圍在50°CW下，在 PH5-11范圍內(nèi)均表現(xiàn)出比較好的穩(wěn)定性，說明該酶具有較寬的抑耐受范圍。本發(fā)明的菌株 所產(chǎn)的堿性果膠酶可應用于煙葉及其它產(chǎn)業(yè)領域W降解果膠質。
【附圖說明】
[0012] 圖1為果膠酶聚丙締酷氨凝膠電泳圖；其中M為標準蛋白分子量;F為硫酸錠沉淀所 得粗酶;F22為經(jīng)柱層析純化所得果膠酶。
[0013] 圖2為本發(fā)明制備的果膠酶的溫度影響及溫度穩(wěn)定性:其中：（A)為最適酶促反應 溫度；（B)為不同溫度下酶的穩(wěn)定性;溫度對菌株PB-1酶促反應的影響見圖2A，在45~55°C 范圍內(nèi)有較高的酶活性，55°C時達到最大值，其酶促反應的最適溫度為55°C ;隨著溫度的持 續(xù)升高，酶活性開始降低，在60°C時只有最大酶活性的78%;酶促反應前將酶液分別置于 40、45、50、55和60°(：條件下進行酶的熱穩(wěn)定性試驗，結果見圖28^8-1果膠酸裂解酶在40、 45和50°C條件下作用化后，酶活性仍保持在90%W上，說明該酶在40、45和50°C條件下穩(wěn) 定。當溫度超過50°C時，酶活性開始迅速降低，在55°C條件下保溫化后，酶活性只有初始酶 活性的70%左右;可知，雖然在55°C條件下具有最大酶活性，但穩(wěn)定性較差，短時間內(nèi)容易 失活，因此將PB-1果膠酶的最適反應溫度確定在50°C。
[0014] 圖3為果膠酶的的抑影響及抑穩(wěn)定性:其中(A)為最適抑;（B)為不同抑下的酶的穩(wěn) 定性，pH對菌株PB-1酶促反應的影響見圖3A，酶促反應的最適抑為9;在pH 7~9范圍內(nèi)具有 較高的反應活性，當pH大于9時酶活性明顯下降；在pH 3.0和pH 4.0的反應體系中，酶不發(fā) 生作用，pH 5.0時果膠酶活性僅為最大酶活性的3.2%。將酶液在不同pH的緩沖液中作用化 后測定果膠酸裂解酶的pH穩(wěn)定性，結果見圖3B，由圖可知該酶對堿具有較大耐受性，在pH 6 ~11范圍內(nèi)均具有較高活性，在pH 8~10條件下酶活性始終保持在初始酶活性的90% W 上，表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性，當pH大于11時酶穩(wěn)定性開始明顯下降；結果表明枯草芽抱桿菌 PB-1所產(chǎn)的果膠酸裂解酶屬于堿性果膠酶。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1:本發(fā)明枯草芽抱桿菌PB1菌種的篩選：
[0016] 用lOg自然醇化3年W上的煙葉接種于LB液體培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)過夜，用無菌 取樣的方法取ImL混合液加入至lj9mL滅菌生理鹽水中制成10一1菌懸液，然后逐級稀釋，取10 -2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇- 6、1〇-7六個稀釋度的菌懸液0.2血涂布到果膠固體培養(yǎng)基(果膠固體 培養(yǎng)基主要成分組成（g/L):果膠0.5%;K2HP04 0.1%;MgS〇4 0.05%;(NH4)2S04 0.3%; FeS化0.001 % ;瓊脂2% ;起始抑7.0)平板上，37°C恒溫培養(yǎng)24~4她，然后采用剛果紅水解 圈法，挑取有水解圈的菌株劃線到LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)2地后，挑取長勢良 好，菌落飽滿均勻的單菌落，鏡檢。
[0017]若為純培養(yǎng)單一菌株，則接種于LB斜面固體培養(yǎng)基，37。直溫培養(yǎng)24h后保藏于4 °C冰箱。
[0018] 若為混合菌株，則再次在果膠固體培養(yǎng)基平板上進行劃線分離，并采用剛果紅水 解圈法檢測活性，挑取有水解圈的菌株劃線到LB固體培養(yǎng)基平板上，按上述步驟，鏡檢為菌 株純培養(yǎng)物后，接種LB斜面固體培養(yǎng)基，37 °C恒溫培養(yǎng)24h后保藏于4 °C冰箱。
[0019] LB液體培養(yǎng)基主要成分組成(w/v):膜化蛋白腺：1%，酵母提取物:0.5%，NaCl: 1%，蒸饋水。
[0020] LB斜面固體培養(yǎng)基主要成分組成(w/v):膜化蛋白腺：1 %，酵母提取物：0.5%， NaCl:l%，瓊脂粉 2%。
[0021] 實施例2:本發(fā)明枯草芽抱桿菌PB1菌種的培養(yǎng)：
[0022] 將保藏的微生物菌株PB1從LB固體斜面培養(yǎng)基接種2環(huán)至lOOmL的LB液體培養(yǎng)基 中，于37°C，120rpm恒溫搖床振蕩培養(yǎng)24h進行活化，然后W8%的接種量接種至C液體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，于37°C，150巧m恒溫搖床振蕩培養(yǎng)24h得到PB1發(fā)酵液。
[0023] LB液體培養(yǎng)基主要成分為:膜化蛋白腺：1 %，酵母提取物:0.5%，化C1:1 %，蒸饋 水。
[0024] C發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分為：可溶性淀粉1.5 %，果膠1.2 %，蛋白腺1.42 %，MnC12 0.01%，K2HP04 0.1%，MgS04 0.05%，F(xiàn)eS04 0.001%，初始抑 8.8。
[0025] 實施例3:堿性果膠酶的制備：
[00%] 將實施例2所得到的發(fā)酵液在4°C7500r/min離屯、15min，除去菌體，經(jīng)過硫酸錠分 級沉淀和透析提取到發(fā)酵液中的粗酶，冷凍干燥濃縮后通過腳L離子交換層析和S邱harose G-75凝膠過濾層析進行分離純化，獲得單一的純酶，經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析，獲得一個 44.3W)a的單一蛋白條帶（圖1中F22)，果膠酶達到電泳純。經(jīng)膜蛋白酶酶解，MLDI-T0F-MS/ MS膚指紋圖譜鑒定氨基酸序列如下：
[0027]
[0028」用Mascot檢索軟件查詢NCBInr數(shù)據(jù)庫，該酶與果膠酸裂解酶(MW :45.49化化;PI: 8.26;NCBI gi 16729823)的匹配度最高，但與上述匹配的果膠酸裂解酶的二級序列覆蓋度 僅為32%，表明該果膠酶為新酶。
[00巧]采用DNS顯色法測定果膠酶活性(Miller 1959):
[0030] (1)半乳糖醒酸標準曲線
[0031] 表1半乳糖醒酸標準曲線
[0032]
[0033] 不同濃度的半乳糖醒酸溶液加入5. OmL DNS試劑，攬拌均勻，在沸水浴中反應 5min，取出后立即用流水冷卻，加蒸饋水定容至25mL，1號試管為空白對照，作為調零管。用 可見分光光度計在540nm波長處比色測定吸光度值。W吸光度為縱坐標，半乳糖醒酸含量為 橫坐標，繪制半乳糖醒酸標準曲線。
[0034] (2)樣品中果膠酶活性測定
[0035] 粗酶液的制備：挑取斜面保藏的菌種，接種至LB液體培養(yǎng)基中進行活化，37°C， 120rpm培養(yǎng)24h后，按4 %的接種量接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 °C，150rpm發(fā)酵24h，將發(fā)酵好的 菌懸液在7500巧m下離屯、15min，除去菌體，上清液即為粗酶液。
[0036] 取ImL適當稀釋的粗酶液，加入5mL于50°C預保溫5min的0.4%果膠溶液與4mL pH 9.4甘氨酸-氨氧化鋼緩沖液中，將上述反應體系在50°C準確保溫30min。反應結束后，從中 取出2mL反應液，加入2mL蒸饋水及5mL DNS試劑，混勻，沸水浴煮沸5min，取出后立即用流水 冷卻，加蒸饋水定容到25mL?？瞻讓φ諡榉兴≈兄蠓衛(wèi)Omin的滅活酶液，其它操作均同上。 W標準空白為基準調零，在540nm處測吸光度。
[0037] (3)果膠酶活性定義及計算方法
[0038] 果膠酶活單位定義:在50°C，pH 9.4的條件下，每分鐘水解果膠釋放化111〇1半乳糖 醒酸的酶量定義為一個酶活力單位。
[0039] 果膠酶的測定原理：W果膠為底物，與經(jīng)過適當稀釋的粗酶液在一定溫度下反應 30min。W半乳糖醒酸作為反應產(chǎn)物，測定酶反應液在540皿處的0D值，最后通過查半乳糖醒 酸的標準曲線，得到對應的半乳糖醒酸含量，由此計算酶活。
[0040] 果膠酶酶活力計算公式如下：
[0041 ]果膠酶活力(U/mL) = [ (A-Aq) XNX 5 X 1000]/化 X t X 194.14)
[0042] 式中:A-酶樣品的吸光度;Ao-酶空白對照的吸光度;N-稀釋倍數(shù);5-測定酶活時取 了反應液的1/5; 1000-lmol D-半乳糖醒酸為lOOOwnol ;K-標準曲線斜率；t-反應時間， 30min; 194.14-D-半乳糖醒酸分子量。
[0043] 上述實驗表明，最適溫度和最適反應抑分別為50°C和9.0，溫度穩(wěn)定性范圍在50°C W下，在抑5-11范圍內(nèi)均表現(xiàn)出比較好的穩(wěn)定性，說明該酶具有較寬的pH耐受范圍（圖2和 圖3)，酶活高達19.抓/mL。
【主權項】
1. 微生物，該微生物命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtil is)，保藏號為CGMCC No.12324。2. 如權利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO: 1所示。3. 權利要求1所述微生物用于生產(chǎn)堿性果膠酶的應用。4. 權利要求1所述微生物用于降解果膠質的應用。5. 權利要求1所述微生物生產(chǎn)的堿性果膠酶。6. 權利要求5所述的堿性果膠酶，其特征在于，所述堿性果膠酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
【文檔編號】C12N9/88GK106047745SQ201610307359
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】呂欣, 吳靜利, 張曉妮, 張崗
【申請人】西北農(nóng)林科技大學