一種戊唑醇人工抗原的合成方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人工抗原，具體的說(shuō)是一種戊唑醇人工抗原的合成方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 戊唑醇（Tebuconazole，CAS 107534-96-3)，化學(xué)名：（RS)-I-對(duì)氯苯基-4, 4-二 甲基-3-(1Η-1，2, 4-三唑-1-基甲基）戊-3-醇，為一種三唑類(lèi)殺菌劑，是德國(guó)拜耳公司于 1986年開(kāi)發(fā)的，具有高效、廣譜、低毒和持效期長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，其殺菌機(jī)理是破壞和阻止麥角甾 醇的生物合成，導(dǎo)致病原菌因不能形成細(xì)胞膜而致死。它可以在植物組織內(nèi)部轉(zhuǎn)移，從而既 可以殺死植物表面的病菌，也可以殺死植物內(nèi)部的病菌。在農(nóng)業(yè)上普遍用于防治白粉病、黑 穗病、紋枯病、全蝕病、云紋病、銹病、菌核病、葉斑病、斑點(diǎn)落葉病、灰霉病等病害。但是，戊 唑醇農(nóng)藥對(duì)肝臟與血液系統(tǒng)有一定的蓄積毒性，還可能是一種非遺傳毒性的動(dòng)物致癌物。 戊挫醇對(duì)大鼠的急性經(jīng)口半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50)約為4000 mg/kg，對(duì)雌、 雄小鼠的急性經(jīng)口 LD50分別為3933和2000 mg/kg，對(duì)大鼠的急性經(jīng)皮LD50>5000 mg/kg。 因此，戊唑醇農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品、水體及土壤環(huán)境中的殘留問(wèn)題受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。
[0003] 目前，檢測(cè)戊唑醇農(nóng)藥常用方法有氣相色譜法和高效液相色譜法，但這些方法均 存在檢測(cè)成本高和樣品前處理繁瑣，尤其不適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。隨著免疫分析技術(shù)的 不斷發(fā)展，酶聯(lián)免疫分析法現(xiàn)已開(kāi)始用于檢測(cè)三唑類(lèi)殺菌劑農(nóng)藥，具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和高 通量的優(yōu)勢(shì)。然而，建立戊唑醇農(nóng)藥酶聯(lián)免疫分析法的關(guān)鍵在于抗原的設(shè)計(jì)與合成。到目 前為止，國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有針對(duì)戊唑醇農(nóng)藥抗原合成和抗體制備的有關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問(wèn)題的不足，提供了一種新型的人工抗原制備方 法，合成了針對(duì)戊唑醇農(nóng)藥殘留檢測(cè)的完全抗原，為國(guó)內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品中戊唑醇農(nóng)藥的免疫分析 檢測(cè)提供技術(shù)支撐。
[0005] -種戊唑醇人工抗原的合成方法，所述戊唑醇人工抗原包括免疫原和包被原，其 合成方法包括以下步驟： 步驟一、將戊唑醇采用羧基二咪唑法和牛血清白蛋白偶聯(lián)，得到戊唑醇免疫原混合液， 反應(yīng)如下：
將戊唑醇采用碳二亞胺法和雞卵清蛋白偶聯(lián)，得到戊唑醇包被原混合液，反應(yīng)如下：
步驟二、戊唑醇人工抗原的純化 采用透析法分別對(duì)到戊唑醇免疫原混合液和戊唑醇包被原混合液，進(jìn)行脫鹽純化，得 到免疫原和包被原，即為戊唑醇人工抗原混合液。
[0006] 該步驟可以采用以下操作方法：稱(chēng)取0. 025 mmol (分子量307. 8, 7. 7 mg)的戊唑 醇，向其中加入0.5 mL的Ν，Ν' 一二甲基甲酰胺（DMF)，攪拌，溶解得到A液；準(zhǔn)確稱(chēng)量N， Ν' 一羧基二咪唑0.2 mmol (Mw 162. 2, 32. 5 mg)加入到A液中，在37°C的水浴中攪拌，反 應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，溶液無(wú)色透明，得到B液；稱(chēng)取20 mg的牛血清白蛋白（BSA)溶于 4. 5 mL pH 8. 8的硼酸鹽緩沖溶液中，為C液。在冰浴下，將B液逐滴滴加到C液中，反應(yīng)4 h，得到戊唑醇免疫原混合液； 稱(chēng)取0.025 mmol (分子量307. 8, 7. 7 mg)的戊唑醇，向其中加入0.5 mL的Ν，Ν' 一二 甲基甲酰胺（DMF)，攪拌，溶解得到A液；準(zhǔn)確稱(chēng)量Ν，Ν'一羧基二咪唑0.2 mmol (Mw 162. 2， 32. 5 mg)加入到A液中，在37°C的水浴中攪拌，反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，溶液無(wú)色透明， 得到B液；稱(chēng)取28 mg的雞卵清蛋白溶于4. 5 mL pH 8. 8的硼酸鹽緩沖溶液中，為C液。在 冰浴下，將B液逐滴滴加到C液中，反應(yīng)4 h，得到戊唑醇包被原混合液； 步驟二、戊唑醇人工抗原的純化 采用透析法對(duì)戊唑醇人工抗原混合液進(jìn)行脫鹽純化，即得到戊唑醇人工抗原。
[0007] 該步驟的具體操作方法，所述步驟二的具體操作方法為，分別將戊唑醇包被原混 合液和戊唑醇包被原混合液移入處理過(guò)的透析袋中，用0.0 lmol/L pH 7. 2的的磷酸鹽緩沖 液透析，更換透析外液6-8次，分別除去戊唑醇免疫原和包被原，即戊唑醇人工抗原，分別 對(duì)其進(jìn)行分裝和保存。
[0008] 步驟三、戊唑醇人工抗原的鑒定 首先，采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)戊唑醇人工抗原的蛋白濃度進(jìn)行估算；對(duì)牛血清白蛋 白的濃度及其對(duì)應(yīng)的吸光值采用origins. 5軟件進(jìn)行線(xiàn)性回歸，再根據(jù)線(xiàn)性回歸方程和稀 釋倍數(shù)計(jì)算可得所制備的戊唑醇人工抗原的蛋白濃度3. 2 mg/mL。
[0009] 其次，根據(jù)戊唑醇在220nm的吸光值，計(jì)算其摩爾吸光系數(shù)。
[0010] 最后，測(cè)定200 mg/mL的牛血清白蛋白和戊唑醇人工抗原在220nm下的吸光值，根 據(jù)上述公式估算出戊唑醇免疫原的偶聯(lián)比15 :1，兩種免疫原分子比為8-25,可取得良好的 免疫效果。
[0011] 所制備戊唑醇人工抗原可以應(yīng)用于戊唑醇農(nóng)藥殘留檢測(cè)。
[0012] 有益效果是： 1、本發(fā)明成功合成了戊唑醇的人工抗原，合成步驟簡(jiǎn)單，有效，用該抗原可以制備出滿(mǎn) 足國(guó)內(nèi)需求的戊唑醇抗體，并可以利用該抗體建立檢測(cè)戊唑醇的各種免疫分析方法，為以 后人們的研究提供了試驗(yàn)原料和簡(jiǎn)便的方法。
[0013] 2、提供一種戊唑醇人工抗原的合成方法，所制備的產(chǎn)品用于建立檢測(cè)戊唑醇的免 疫分析方法，為今后的研究提供了一種新型的人工抗原制備方法。為此，本專(zhuān)利設(shè)計(jì)并合成 了針對(duì)戊唑醇農(nóng)藥殘留檢測(cè)的完全抗原，為國(guó)內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品中戊唑醇農(nóng)藥的免疫分析檢測(cè)提供 技術(shù)支撐，還可以用于制備檢測(cè)戊唑醇農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是利用間接ELISA方法測(cè)定戊唑醇農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)圖； 圖2是戊唑醇抗體的親和常數(shù)測(cè)定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] -種戊唑醇人工抗原的合成方法，所述戊唑醇人工抗原包括免疫原和包被原，其 合成方法包括以下步驟： 步驟一、將戊唑醇采用羧基二咪唑法和牛血清白蛋白偶聯(lián)，得到戊唑醇免疫原混合液， 反應(yīng)如下：
步驟二、戊唑醇人工抗原的純化 采用透析法分別對(duì)到戊唑醇免疫原混合液和戊唑醇包被原混合液，進(jìn)行脫鹽純化，得 到免疫原和包被原，即為戊唑醇人工抗原混合液。
[0016] 該步驟可以采用以下操作方法：稱(chēng)取0. 025 mmol (分子量307. 8, 7. 7 mg)的戊唑 醇，向其中加入0.5 mL的Ν，Ν' 一二甲基甲酰胺（DMF)，攪拌，溶解得到A液；準(zhǔn)確稱(chēng)量N， Ν' 一羧基二咪唑0.2 mmol (Mw 162. 2, 32. 5 mg)加入到A液中，在37°C的水浴中攪拌，反 應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，溶液無(wú)色透明，得到B液；稱(chēng)取20 mg的牛血清白蛋白（BSA)溶于 4. 5 mL pH 8. 8的硼酸鹽緩沖溶液中，為C液。在冰浴下，將B液逐滴滴加到C液中，反應(yīng)4 h，得到戊唑醇免疫原混合液； 稱(chēng)取0.025 mmol (分子量307. 8, 7. 7 mg)的戊唑醇，向其中加入0.5 mL的Ν，Ν' 一二 甲基甲酰胺（DMF)，攪拌，溶解得到A液；準(zhǔn)確稱(chēng)量Ν，Ν'一羧基二咪唑0.2 mmol (Mw 162. 2， 32. 5 mg)加入到A液中，在37°C的水浴中攪拌，反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，溶液無(wú)色透明， 得到B液；稱(chēng)取28 mg的雞卵清蛋白溶于4. 5 mL pH 8. 8的硼酸鹽緩沖溶液中，為C液。在 冰浴下，將B液逐滴滴加到C液中，反應(yīng)4 h，得到戊唑醇包被原混合液； 步驟二、戊唑醇人工抗原的純化 采用透析法對(duì)戊唑醇人工抗原混合液進(jìn)行脫鹽純化，即得到戊唑醇人工抗原。
[0017] 該步驟的具體操作方法，所述步驟二的具體操作方法為，新的透析袋先蒸餾水中 煮15min左右，分別將戊唑醇包被原混合液和戊唑醇包被原混合液移入處理過(guò)的透析袋 中，用0.0 lmol/L pH 7. 2的的磷酸鹽緩沖液透析，更換透析外液6-8次，每隔8 h更換一次 透析液，分別除去戊唑醇免疫原和包被原，即戊唑醇人工抗原，分別對(duì)其進(jìn)行分裝和保存。
[0018] 步驟三、戊唑醇人工抗原的鑒定 偶聯(lián)比測(cè)定：本專(zhuān)利采用紫外分光光度法對(duì)抗原中被偶聯(lián)兩種分子的比率進(jìn)行估算， 原理是基于物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系來(lái)分別測(cè)定被偶聯(lián)的兩種分子濃度，并且 蛋白質(zhì)和戊唑醇均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加和偏移的性質(zhì)進(jìn)行計(jì) 算。
[0019] 采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定偶聯(lián)物的蛋白濃度：采用20%甲醇磷酸鹽緩沖溶液， 配制lmg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶