專利名稱：守宮糖肽及制備方法和其醫(yī)藥應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物中藥材中具有很高藥用價值的活性成分及制備方法和其醫(yī)藥應(yīng)用，特別涉及一種守宮糖肽及制備方法和其醫(yī)藥應(yīng)用。

背景技術(shù)：
中醫(yī)是我國的國粹，中藥材是中醫(yī)藥理論的物質(zhì)寶庫，中藥材分為植物中藥材、動物中藥材和礦物中藥材；傳統(tǒng)中醫(yī)的理論、臨床與現(xiàn)代研究均表明動物藥材治療惡性腫瘤是中醫(yī)的一大特色，如在斑蝥中提取斑蝥素、斑蝥酸鹽應(yīng)用于治療惡性腫瘤取得一定效果，并且還具有一定的抗病毒的作用。一般來說，多數(shù)動物中藥對人體都具有一定的毒性，限制了這類藥物在治療時的用藥量，使得治療效果受到較大的影響。如何在保持藥用活性的同時降低其對人體的不良影響，是藥學(xué)家們研究的熱點。同時，明確藥物的活性成分以及其作用機理是天然藥開發(fā)的首要任務(wù)。在有抗癌作用的動物中藥中提取有抗癌作用的活性物質(zhì)則是我國乃至世界各國的藥學(xué)家、研發(fā)機構(gòu)的工作重心。
守宮是傳統(tǒng)的中藥材，為壁虎科動物無蹼壁虎Gekko swinhonis Gūenther或其它幾種壁虎[多疣壁虎Gekko japonicus(Duméril &Bibron)；無疣壁虎Gekko subpalmatus Güenther；蹼趾壁虎Gekko chinensis Gray]的全體，是中醫(yī)傳統(tǒng)的咸寒軟堅藥。中醫(yī)長期以來使用守宮治療瘰疬癌腫(《青囊雜篡》、《得配本草》、《四川中藥志》)，國內(nèi)較多醫(yī)家使用守宮治療惡性腫瘤也取得了很好的療效。體外研究發(fā)現(xiàn)守宮水溶液可抑制人肝癌細胞的呼吸，并已明確守宮含有與馬蜂毒相似的有毒物質(zhì)及組織胺類物質(zhì)、脂肪油、多種氨基酸、微量元素和維生素，但上述成分均不足以解釋守宮的抗腫瘤作用，我們既往的研究發(fā)現(xiàn)守宮多糖具有抗腫瘤、抗病毒與免疫調(diào)節(jié)的活性成分；參見本申請人在先申請ZL 200510065309.X，關(guān)于《守宮多糖及制備方法和其醫(yī)藥應(yīng)用》的專利。
多糖或糖肽是一類天然大分子物質(zhì)，是構(gòu)成生命的基本物質(zhì)之一。大量研究表明，多糖或糖肽具有抗病毒、抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)作用。一般情況下，多糖或糖肽是良好的免疫調(diào)節(jié)劑。多糖或糖肽可以活化巨噬細胞，促進淋巴細胞有絲分裂，增強NK細胞(自然殺傷細胞)與LAK細胞(淋巴因子活化的殺傷細胞)活性，增強TD細胞(遲發(fā)性超敏反應(yīng)T細胞)功能，誘生白細胞介素(尤其是IL-1、IL-2)、IFN(干擾素)、TNF(腫瘤壞死因子)等細胞因子，活化補體，增強紅細胞免疫，調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)。新近的研究表明含硫酸根的多糖或糖肽能抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，其硫酸根離子不僅提高多糖或糖肽的水溶性，而且增強其抗腫瘤活性。此外，硫酸多糖或糖肽具有抗HIV的作用，因而硫酸多糖或糖肽已成為國內(nèi)外研究的熱點。
腫瘤的惡性增殖、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤治療失敗的主要原因，也是導(dǎo)致腫瘤患者最終死亡的重要原因。IL-8與腫瘤轉(zhuǎn)移有非常密切的關(guān)系，IL-8能通過鈣離子介導(dǎo)的細胞骨架蛋白actin的重組和分布促進腫瘤細胞遷移。細胞骨架蛋白為細胞的運動和遷移提供基本的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。細胞內(nèi)主要有三種骨架蛋白actin微絲、微管和中間絲。腫瘤細胞的遷移主要依賴于atin微絲的重組和分布。鈣離子通過調(diào)節(jié)acin結(jié)合蛋白的功能來調(diào)控actin微絲的重組和分布。新近的研究表明降低細胞內(nèi)鈣離子的濃度和有效調(diào)節(jié)actin微絲的重組和分布常常能抑制腫瘤細胞的遷移。因此，有效調(diào)節(jié)腫瘤細胞actin的重組和分布以及抑制腫瘤細胞分泌促進侵襲與轉(zhuǎn)移的細胞因子如IL-8具有重要科學(xué)意義與廣泛應(yīng)用前景。
因此，提供一種更加有效治療人體惡性腫瘤及病毒感染性等疾病，增強人體免疫力的守宮糖肽及制備方法和其醫(yī)藥應(yīng)用，造福于人類，將是該技術(shù)領(lǐng)域科研人員急需深入研究開發(fā)的新課題之一。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種應(yīng)用效果非常顯著即源自動物中藥守宮的守宮糖肽及制備方法和其醫(yī)藥應(yīng)用。該守宮糖肽對惡性腫瘤有很強的抑制作用，同時由于該守宮糖肽含有硫酸根對HIV等病毒性疾病有明顯的抗病毒作用，守宮糖肽也是一具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的生物治療劑；本發(fā)明的另一發(fā)明目的是提供制備該守宮糖肽的方法及守宮糖肽在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的實施方式如下 守宮糖肽，其特征在于重均分子量大于2,000,000Da；比旋光度為-60°；碳元素的質(zhì)量百分含量為23.39％，氫元素的質(zhì)量百分含量為4.925％，氮元素的質(zhì)量百分含量為6.51％；其組成的糖部分含有鼠李糖，巖藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，摩爾比為鼠李糖∶巖藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶N-乙酰葡糖胺＝1.334∶3.363∶3.375∶6.983∶10.480∶0.019；單糖的連接方式為1，3-連接的鼠李糖，T-連接的巖藻糖，1，2，3，6-，1，3，4-連接的甘露糖，T-，1，4-連接的葡萄糖，T-，1，4-連接的的半乳糖和1，4-連接的N-乙酰葡糖胺；糖醛酸的質(zhì)量百分含量為3.08％；其結(jié)合型蛋白質(zhì)部分含有16種氨基酸，質(zhì)量百分含量為16.33％；糖肽鍵的類型含有O-連接；硫酸基的質(zhì)量百分含量為14.7％。
守宮糖肽的制備方法，其特征在于將守宮干燥、破碎后用有機溶劑抽提出脂溶性物質(zhì)，將脫脂后的藥渣用按守宮質(zhì)量的1-10倍熱水在30-100℃條件下浸提2-12小時，水提液過濾后分次加入乙醇至15％-80％濃度(V/V)沉淀，將沉淀溶解于水，1000-10000r/min離心取上清，常規(guī)sevage法除去雜蛋白，透析，干燥成粉，復(fù)溶解于粉末質(zhì)量30-180倍的含有0.5mol/L氯化鈉，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH6.5，加入粉末質(zhì)量0.5％-4％的木瓜蛋白酶及0.5-2倍的甲苯，50℃-80℃水浴4h-48h后補加粉末質(zhì)量0.2％-2％的木瓜蛋白酶，繼續(xù)水浴4h-24h；水解液濃縮后以乙醇沉淀，收集沉淀，依次用無水乙醇，丙酮洗滌，復(fù)溶于水，過濾，常規(guī)sevage法除去雜蛋白，濃縮，透析，干燥，得守宮糖肽。
將守宮糖肽制成符合藥劑學(xué)要求的注射劑型。
將守宮糖肽制成符合藥劑學(xué)要求的口服劑型。
所述的守宮糖肽在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
所述的守宮糖肽在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
所述的守宮糖肽在制備治療病毒感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。
所述的守宮糖肽在制備治療HIV感染的藥物中的應(yīng)用。
所述的守宮糖肽在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明深入研究發(fā)現(xiàn)守宮多糖是與肽牢固結(jié)合在一起的，進一步將天然守宮多糖與肽的復(fù)合物(簡稱守宮多糖)用蛋白酶水解，得到一新的守宮糖肽(簡稱守宮糖肽)，具有比天然守宮多糖更好的生物活性。守宮糖肽抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖作用優(yōu)于守宮多糖。守宮糖肽高劑量(200μg/ml)、中劑量(100μg/ml)與低劑量組(10μg/ml)均對人肝癌SMMC-7721細胞增殖有明顯抑制作用。而守宮多糖僅高劑量(200μg/ml)、中劑量組(100μg/ml)對人肝癌SMMC-7721細胞增殖有明顯抑制作用，低劑量組(10μg/ml)對人肝癌SMMC-7721細胞增殖沒有抑制作用?？梢娛貙m糖肽在10μg/ml濃度即能抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖，而守宮多糖在100μg/ml濃度抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖。守宮糖肽抑制人肝癌SMMC-7721細胞遷移作用優(yōu)于守宮多糖。守宮糖肽高劑量和中劑量組均對人肝癌SMMC-7721細胞分泌IL-8有明顯抑制作用。而守宮多糖對人肝癌SMMC-7721細胞分泌IL-8沒有抑制作用。守宮糖肽能抑制腫瘤細胞分泌IL-8，通過降低細胞內(nèi)鈣離子的濃度來促進actin微絲的重組和調(diào)控其重新分布至細胞漿，進而抑制腫瘤細胞遷移。以上結(jié)果表明守宮糖肽具有比守宮多糖更好的生物活性。
本發(fā)明在應(yīng)用守宮多糖的基礎(chǔ)上進一步研究，并得到科學(xué)驗證；守宮糖肽較比守宮多糖對惡性腫瘤有更高的療效，顯示了極高的抑癌活性，守宮糖肽含有硫酸根，能有效抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，可單獨用于惡性腫瘤的治療，也可用于惡性腫瘤手術(shù)、放療、化療與介入治療的輔助治療；守宮糖肽含有硫酸根，在艾滋病等病毒感染性疾病的防治上具有極其光明的應(yīng)用前景；糖肽通常具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，使用守宮治療免疫低下也有很好的治療效果，守宮糖肽可作為一種新的免疫調(diào)節(jié)劑，用于惡性腫瘤、慢性感染等疾病的治療；守宮對人體的毒性限制了其臨床大劑量應(yīng)用，故守宮的日用量一般僅1.5～4.5g，守宮糖肽起到了很好的減毒增效作用。



圖1是守宮多糖的高效液相色譜圖。
圖2是守宮糖肽的高效液相色譜圖。
圖3是守宮糖肽的紅外光譜圖。
圖4是標準糖樣的糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖； 圖中1鼠李糖，2阿拉伯糖，3巖藻糖，4甘露糖，5葡萄糖，6半乳糖，7肌醇。
圖5是守宮糖肽的糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖； 圖中1鼠李糖，2巖藻糖，3甘露糖，4葡萄糖，5半乳糖，6肌醇。
圖6是標準糖樣的糖醇乙酸酯衍生物的氣相色譜圖； 圖中1肌醇，2氨基半乳糖，3氨基葡萄糖。
圖7是守宮糖肽的糖醇乙酸酯衍生物的氣相色譜圖； 圖中1肌醇，2氨基葡萄糖。
圖8是守宮糖肽的總離子流圖。
圖9是守宮多糖對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響曲線分析示意圖； 圖中1PBS陰性對照組，2守宮多糖高劑量組(200μg/ml)，3守宮多糖中劑量組(100μg/ml)，4守宮多糖低劑量組(10μg/ml)。
圖10是守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響曲線分析示意圖； 圖中1PBS陰性對照組，2守宮糖肽高劑量組(200μg/ml)，3守宮糖肽中劑量組(100μg/ml)，4守宮糖肽低劑量組(10μg/ml)。
圖11是守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞骨架蛋白actin的影響激光共聚焦圖片； 1PBS陰性對照組，2守宮糖肽(200μg/ml)，3守宮糖肽(100μg/ml)，4守宮糖肽(10μg/ml)。

具體實施例方式 以下結(jié)合附圖和較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提供的具體實施方式
詳述如下 實施例1 守宮糖肽，其特征在于重均分子量大于2,000,000Da；比旋光度為-60°；碳元素的質(zhì)量百分含量為23.39％，氫元素的質(zhì)量百分含量為4.925％，氮元素的質(zhì)量百分含量為6.51％；其組成的糖部分含有鼠李糖，巖藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，摩爾比為鼠李糖∶巖藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶N-乙酰葡糖胺＝1.334∶3.363∶3.375∶6.983∶10.480∶0.019；單糖的連接方式為1，3-連接的鼠李糖，T-連接的巖藻糖，1，2，3，6-，1，3，4-連接的甘露糖，T-，1，4-連接的葡萄糖，T-，1，4-連接的的半乳糖和1，4-連接的N-乙酰葡糖胺；糖醛酸的質(zhì)量百分含量為3.08％；其結(jié)合型蛋白質(zhì)部分含有16種氨基酸，質(zhì)量百分含量為16.33％；糖肽鍵的類型含有O-連接；硫酸基的質(zhì)量百分含量為14.7％。
守宮糖肽的制備取守宮全體1000g，切成0.3cm長的碎塊，分別用4000ml，2000ml的甲醇浸泡3h，過濾，藥渣于室溫下置通風處晾干，然后用10000ml，8000ml，6000ml的熱水100℃提取三次，提取時間分別為6h，4h，3h。合并提取液，過濾，濃縮至800ml，加入終濃度80％(V/V)的乙醇沉淀，離心(2000r/min，20min)，收集沉淀，將沉淀復(fù)溶于水，離心(2000r/min，20min)，取上清，常規(guī)sevage法除去游離蛋白10次，濃縮，透析，干燥。取干燥粉末24g溶解于3000ml含有0.5mol/L氯化鈉，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.5)，加入240mg木瓜蛋白酶及30ml甲苯，65℃水浴12h，后補加120mg的木瓜蛋白酶，繼續(xù)65℃水浴12h。將酶解液過濾，減壓濃縮至500ml，80％(V/V)乙醇沉淀，靜置1h。收集沉淀，依次用無水乙醇，丙酮洗滌，65-70℃干燥成固體粉末。把粉末復(fù)溶于水，過濾，收集濾液，常規(guī)sevage法除去雜蛋白6次，減壓濃縮，透析，干燥，得守宮糖肽。
實施例2 守宮糖肽的制備取守宮全體1000g，切成0.2cm長的碎塊，分別用6000ml，3000ml的甲醇浸泡2h，過濾，藥渣于室溫下置通風處晾干，然后用8000ml，6000ml，4000ml的熱水100℃提取三次，提取時間分別為6h，4h，3h。合并提取液，過濾，濃縮至800ml，加入終濃度80％(V/V)的乙醇沉淀，離心(3200r/min，10min)，收集沉淀，將沉淀復(fù)溶于水，離心(3200r/min，10min)，取上清，常規(guī)sevage法除去游離蛋白10次，濃縮，透析，濃縮，干燥。取干燥粉末24g溶解于1200ml含有0.5mol/L氯化鈉，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.5)，加入120mg木瓜蛋白酶及10ml甲苯，60℃水浴48h，后補加60mg的木瓜蛋白酶，繼續(xù)60℃水浴24h。將酶解液過濾，減壓濃縮至500ml，80％(V/V)乙醇沉淀，靜置12h。收集沉淀，依次用無水乙醇，丙酮洗滌，65-70℃干燥成固體粉末。把粉末復(fù)溶于水，過濾，收集濾液，常規(guī)sevage法除去雜蛋白6次，減壓濃縮，透析，干燥，得守宮糖肽。其它參照實施例1。
實施例3 守宮糖肽的制備取守宮全體1000g，粉碎為粗末，過1號篩，用3000ml的甲醇浸泡12h，過濾，藥渣于室溫下置通風處晾干，然后用10000ml的熱水60℃提取三次，提取時間為6h。合并提取液，過濾，濃縮至1000ml，加入終濃度70％(V/V)的乙醇沉淀，4℃靜置24h，離心(4000r/min，6min)，收集沉淀，將沉淀復(fù)溶于水，離心(4000r/min，6min)，取上清，透析，干燥。取干燥粉末24g溶解于4200ml含有0.5mol/L氯化鈉，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.5)，加入480mg木瓜蛋白酶及40ml甲苯，70℃水浴8h，后補加240mg的木瓜蛋白酶，繼續(xù)70℃水浴4h。將酶解液過濾，減壓濃縮至500ml，80％(V/V)乙醇沉淀，靜置24h。收集沉淀，依次用無水乙醇，丙酮洗滌，真空干燥成固體粉末。把粉末復(fù)溶于水，過濾，收集濾液，常規(guī)sevage法除去雜蛋白4次，減壓濃縮，透析，干燥，得守宮糖肽。其它參照實施例1。
實施例4 守宮糖肽的制備取守宮全體1000g，切成0.3cm長的碎塊，分別用4000ml，2000ml的無水乙醇浸泡4h，過濾，藥渣于室溫下置通風處晾干，然后用10000ml的熱水30℃提取三次，提取時間為12h。合并提取液，過濾，濃縮至800ml，加入終濃度30％(V/V)的乙醇沉淀，4℃靜置24h，離心(10000r/min，5min)，收集沉淀，將沉淀復(fù)溶于水，離心(10000r/min，5min)，取上清，常規(guī)sevage法除游離蛋白4次，濃縮，透析，濃縮，干燥。取干燥粉末24g溶解于3000ml含有0.5mol/L氯化鈉，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.5)，加入240mg木瓜蛋白酶及30ml甲苯，60℃水浴12h，后補加120mg的木瓜蛋白酶，繼續(xù)60℃水浴24h。將酶解液過濾，減壓濃縮至500ml，40％(V/V)乙醇沉淀，靜置12h。收集沉淀，依次用無水乙醇，丙酮洗滌，凍干成固體粉末。把粉末復(fù)溶于水，過濾，收集濾液，常規(guī)sevage法除去雜蛋白8次，減壓濃縮，透析，干燥，得守宮糖肽。其它參照實施例1。
守宮糖肽結(jié)構(gòu)分析 (一)守宮多糖純度分析 1、材料與方法 采用高效液相色譜法(HPLC)檢測守宮多糖純度。液相色譜柱為ShodexKS-805，流動相為雙蒸餾水，流速為1ml/min，柱溫35℃。配制樣品的水溶液，進樣。
2、結(jié)果 參見圖1，在5.883分鐘出現(xiàn)單一對稱峰，提示守宮多糖是均一組分。
(二)守宮糖肽純度分析及相對分子質(zhì)量測定 1、材料與方法 采用高效液相色譜法(HPLC)檢測守宮糖肽純度及相對分子質(zhì)量。采用標準葡聚糖Dextran T系列制作標準曲線，根據(jù)守宮糖肽樣品在相同色譜條件下的保留時間，用標準曲線計算該樣品的相對分子質(zhì)量。液相色譜柱為ShodexKS-805，流動相為雙蒸餾水，流速為1ml/min，柱溫為35℃。配制葡萄糖，各個標準T10，T40，T70，T110，T500，2000，藍色葡聚糖的2％(W/V)溶液，各溶液進樣后得到相應(yīng)的液相圖譜，繪制出保留時間與分子量關(guān)系的標準曲線，得出回歸方程。根據(jù)守宮糖肽的保留時間，從回歸方程上求得分子量。
2、結(jié)果 2.1純度 參見圖2，在7.980分鐘出現(xiàn)單一對稱峰，提示守宮糖肽是均一組分。守宮多糖的出峰時間為5.883分鐘(見圖1)，提示守宮糖肽較守宮多糖的分子量小，說明守宮糖肽是守宮多糖經(jīng)過蛋白酶水解得到的新化合物。
2.2分子量 根據(jù)回歸方程求得守宮糖肽重均分子量(Mw)大于2,000,000Da。
(三)守宮糖肽比旋光度的測定 1、材料與方法 取守宮糖肽4mg，溶于2ml雙蒸水，用自動旋光儀測量旋光度，用公式[α]＝α/(l×C)計算比旋光度。[a]為比旋光度，a為旋轉(zhuǎn)角，1為池長(dm)、c為濃度(g/ml)。
2、結(jié)果如下表 (四)守宮糖肽元素分析如下表
(五)守宮糖肽紅外光譜 1、材料與方法 取1-2mg守宮糖肽，用溴化鉀壓片后進行紅外光譜分析。
2、結(jié)果 參見圖3，在3421.4cm-1處出現(xiàn)的寬峰為羥基的O-H的伸縮振動引起，2929.5cm-1處左右出現(xiàn)的比較弱吸收峰，為甲基的C-H伸縮振動引起，1409.8cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為甲基的C-H變角振動引起，此3組吸收峰是糖類物質(zhì)的特征峰。1601.8cm-1處出現(xiàn)的強吸收峰為氨基的N-H變角振動引起，提示含有葡糖胺。1256.7cm-1出現(xiàn)的吸收峰是硫酸基的S＝O的伸縮振動引起的；859.2cm-1處吸收峰是由硫酸基的C-O-S伸縮振動引起，提示含有硫酸基。
(六)守宮糖肽單糖的組成與連接方式 1、單糖的組成及比例 1.1、薄層層析(TLC) 1.1.1、材料與方法 為檢測守宮糖肽的中性糖和氨基糖的組成，樣品分別用三氟乙酸和鹽酸水解。三氟乙酸的水解條件為稱取守宮糖肽6mg，加入4mol/L三氟乙酸6ml，封管，105℃水解4h；鹽酸的水解條件為稱取守宮糖肽10mg，加入6mol/L鹽酸10ml，封管，105℃水解8h。然后分別反復(fù)加入甲醇45℃減壓蒸干，以完全除去三氟乙酸和鹽酸。再分別向樣品中加入少量的水使樣品溶解，取少量在硅膠板上進行薄層層析，采用標準單糖對照以初步確定樣品單糖組成。中性糖的標準單糖對照為阿拉伯糖，葡萄糖，甘露糖，半乳糖，巖藻糖，鼠李糖；氨基糖的標準單糖對照為葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，N-乙酰葡糖胺，氨基半乳糖，氨基葡萄糖。乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸∶水(12ml∶3ml∶3ml∶2ml)展開，苯胺-鄰苯二甲酸顯色。根據(jù)標準單糖和樣品的Rf值(比移值)的比較來確定樣品中組成單糖的種類。
1.1.2、結(jié)果 1.1.2.1、守宮糖肽中性糖的組成如下表
樣品經(jīng)展開顯色后，有兩個點，其Rf值與葡萄糖和巖藻糖相同，提示樣品中含有葡萄糖和巖藻糖。
1.1.2.2、守宮糖肽氨基糖的組成如下表
樣品經(jīng)展開顯色后，有兩個點，其中一個點的Rf值與氨基葡萄糖相同，提示樣品中含有氨基葡萄糖。另外一個點的Rf值接近葡萄糖醛酸，提示樣品中可能含有糖醛酸。
1.2、氣相 1.2.1、中性糖的檢測 1.2.1.1、材料與方法 樣品精密稱取守宮糖肽8.4mg，加入4mol/L三氟乙酸，封管，105℃水解4h，反復(fù)加甲醇于45℃減壓濃縮至干。加1mg肌醇，16mg鹽酸羥胺，1ml吡啶，90℃加熱反應(yīng)30分鐘。取出冷卻至室溫，加入1ml乙酸酐，90℃繼續(xù)加熱反應(yīng)30分鐘，反復(fù)加甲醇于45℃減壓濃縮至干，然后將乙酰化后的樣品溶于氯仿中，再加入等體積的蒸餾水洗滌氯仿層3次，除盡水層，制備糖腈乙酸酯的衍生物，反應(yīng)產(chǎn)物用0.2ml氯仿溶解，進樣1μl?；鞓司芊Q取鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖，巖藻糖，葡萄糖，半乳糖各1mg，肌醇1mg，加鹽酸羥胺14mg，吡啶1ml，同上操作，反應(yīng)產(chǎn)物用0.2ml氯仿溶解，進樣1μl。根據(jù)標準單糖和樣品的保留時間的比較來確定樣品中組成單糖的種類。根據(jù)標準單糖和樣品的峰面積和進樣量來計算樣品中組成單糖的摩爾比。
1.2.1.2、結(jié)果如下表 樣品含鼠李糖，巖藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖。
摩爾比為鼠李糖，巖藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖＝1.334∶3.363∶3.375∶6.983∶10.480，參見圖4、圖5。
1.2.2、氨基糖的檢測 1.2.2.1、材料與方法 樣品精密稱取守宮糖肽8mg，加入6mol/L鹽酸，封管，105℃水解8h，反復(fù)加入甲醇45℃減壓蒸干，以完全除去鹽酸。再加入1mg肌醇，四氫硼鈉20mg，雙蒸水2ml，室溫還原3h，再用25％乙酸(V/V)中和過量的四氫硼鈉，反復(fù)加甲醇于45℃減壓濃縮至干，然后置P2O5的干燥器中過夜，次日在80℃加熱15min除去水分。加3ml乙酸酐，封管，100℃加熱反應(yīng)1h，反復(fù)加入甲苯45℃減壓蒸干，除去乙酸酐，然后將乙?；蟮臉悠啡苡诼确轮?，再加入等體積的蒸餾水洗滌氯仿層3次，除盡水層，制備糖醇乙酸酯的衍生物，反應(yīng)產(chǎn)物用0.2ml氯仿溶解，進樣1μl?；鞓司芊Q取氨基葡萄糖，氨基半乳糖，肌醇各1mg，四氫硼鈉20mg，同上操作，反應(yīng)產(chǎn)物用0.1ml氯仿溶解，進樣1μl。根據(jù)標準單糖和樣品的保留時間的比較來確定樣品中組成單糖的種類。根據(jù)標準單糖和樣品的峰面積和進樣量來計算樣品中組成單糖的摩爾比。
1.2.2.2、結(jié)果 樣品含氨基葡萄糖。保留時間14.151min，摩爾數(shù)為0.019，參見圖6、圖7。
1.3、糖醛酸含量測定 1.3.1、材料與方法 0.15％(W/V)間羥聯(lián)苯，用0.5％(W/V)氫氧化鈉配置，在冰箱中避光保存，1月內(nèi)穩(wěn)定； 四硼酸鈉-硫酸溶液0.0125mol/L四硼酸鈉的硫酸溶液； 半乳糖醛酸標準溶液60μg/ml； 精密量取標準溶液0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25ml值試管中，用雙蒸水補加至0.25ml，在冰浴中預(yù)冷后加入1.5ml的四硼酸鈉-硫酸溶液?；靹?，在沸騰水浴中加熱5min，用冰浴冷卻至室溫后，加25μl的間羥聯(lián)苯試劑，混勻，在520nm處測定光吸收。吸取樣品溶液(1mg/ml)0.25ml，同前操作，為避免樣品中非己糖醛酸成分與四硼酸鈉-硫酸溶液反應(yīng)的干擾，以25μl的0.5％(W/V)氫氧化鈉代替間羥聯(lián)苯試劑，測得的光吸收值從樣品吸收值中扣除。根據(jù)標準品糖醛酸的含量和其對應(yīng)的吸光度繪制出標準曲線，得出回歸方程。根據(jù)守宮糖肽的吸光度，從回歸方程上求得糖醛酸的含量。
1.3.2、結(jié)果 根據(jù)回歸方程求得守宮糖肽的糖醛酸質(zhì)量百分含量3.08％。
2、單糖的連接方式——甲基化 2.1、材料與方法 2.1.1、甲基化反應(yīng) 稱取守宮糖肽8mg，加入2ml二甲基亞砜溶解。加入干燥的氫氧化鈉20mg，超聲10min，室溫下靜置90min。在冰浴下逐滴加入碘甲烷1ml，直至反應(yīng)物成為亮黃色溶液。然后恢復(fù)至室溫，繼續(xù)超聲10min，減壓蒸餾除盡過量的碘甲烷，用氯仿3ml溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，然后加入等體積的水，洗滌3次，去除水層。反復(fù)甲基化7次，經(jīng)IR分析，在3500cm-1左右強而寬的羥基吸收峰基本消失，而2900cm處的甲基峰顯著增強時，提示多糖上的羥基已經(jīng)被甲基化。
2.1.2、甲基化的多糖解聚，水解，制備糖醇乙酸酯的衍生物。
將甲基化的樣品加入90％甲酸(V/V)4ml，封管，100℃水解6h，向反應(yīng)瓶中加入2～3ml甲醇，45℃下減壓濃縮蒸干，重復(fù)以上操作以除盡過量甲酸。再加入4mol/L三氟乙酸4ml溶解，密封，105℃水解4h，向反應(yīng)瓶中加入2～3ml甲醇，45℃下減壓濃縮蒸干，重復(fù)以上操作以除盡過量三氟乙酸。水解后樣品加入四氫硼鈉20mg，雙蒸水2ml，室溫還原3h，25％乙酸中和，向反應(yīng)瓶中加入2～3ml甲醇，45℃下減壓濃縮蒸干，重復(fù)以上操作以除盡過量乙酸。剩余物在80℃加熱15min除去水分。加3ml乙酸酐，100℃加熱反應(yīng)1h，向反應(yīng)液中加入2ml甲苯，振蕩后45℃下減壓蒸去未反應(yīng)的醋酐，如此重復(fù)多次以除盡醋酐。然后將乙?；蟮臉悠啡苡诼确轮?，再加入等體積的蒸餾水洗滌氯仿層3次，除盡水層，制備糖醇乙酸酯的衍生物，反應(yīng)產(chǎn)物用0.1ml氯仿溶解，進行氣質(zhì)聯(lián)用分析(GC-MS)。
2.2、結(jié)果 2.2.1總離子流圖，參見圖8。
2.2.2、甲基化分析如下表 當樣品用6mol/L鹽酸水解時，N-乙酰葡糖胺的N-乙?；黄茐?。因此在薄層層析和氣相實驗中，樣品被檢測出含有氨基葡萄糖。而在甲基化反應(yīng)中，樣品未用鹽酸水解，故樣品被檢測出含有N-乙酰葡糖胺。
(七)蛋白質(zhì)組成和含量分析 1、材料與方法 取適量守宮糖肽，加鹽酸，封管，110℃水解24h，濃縮，調(diào)節(jié)pH值為6.2-6.3，經(jīng)氨基酸自動分析儀測定氨基酸組成和含量。
2、結(jié)果 表中表明守宮糖肽含有16種氨基酸，氨基酸的質(zhì)量百分含量為16.33％。
(八)糖肽鍵的類型——β消去反應(yīng) 1、材料與方法 稱取守宮糖肽4mg，溶解于2ml 0.3mol/L的氫氧化鈉-1mol/L四氫硼鈉中，加一滴甲苯，45℃水解24h，加入25％乙酸(V/V)中和稀堿溶液以終止反應(yīng)，取0.5ml檢測氨基酸的組成與含量，配制相同濃度的樣品水溶液作為空白對照。
2、結(jié)果 守宮糖肽經(jīng)β消去反應(yīng)前后氨基酸組成及含量比較(μg/mg) 守宮糖肽經(jīng)β消去反應(yīng)后，每毫克守宮糖肽中，蘇氨酸的含量由7.12mg下降為3.64mg，氨基丁酸的含量由0mg上升為1.16mg。提示守宮糖肽鍵的類型含有O-連接。
(九)硫酸基的測定 1、材料與方法 明膠2g明膠在60-70℃溶解于400ml水中，4℃保存； 氯化鋇明膠試劑0.5g氯化鋇溶解于100ml明膠溶液中，4℃保存； 三氯乙酸8％水溶液(W/V)； 硫酸鹽的標準品400μg/ml； 所有器具用HNO3洗后，再用去離子水沖洗。
精密吸取標準品0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4ml，用水補足至0.4ml，分別加入0.35ml三氯乙酸，0.25ml氯化鋇明膠試劑，混勻，靜置15min，在360nm處測定濁度。精密稱取守宮糖肽2mg，6mol/L鹽酸水解6h，反復(fù)加入甲醇45℃減壓蒸干，殘渣各用1ml水溶解，守宮糖肽吸取0.4ml×2份。取1份加入0.35ml三氯乙酸，0.25ml氯化鋇明膠試劑；另1份加入0.35ml三氯乙酸，0.25ml明膠試劑，混勻，靜置15min，在360nm處測定濁度。有氯化鋇存在時的吸光度減去無氯化鋇存在時的吸光度，用這項對照消除水解液中含有的紫外吸收物質(zhì)的影響。根據(jù)標準品硫酸基的含量和其對應(yīng)的吸光度繪制出標準曲線，得出回歸方程。根據(jù)守宮糖肽的吸光度，從回歸方程上求得硫酸基的含量。
2、結(jié)果 根據(jù)回歸方程求得守宮糖肽的硫酸基質(zhì)量百分含量14.7％ 守宮糖肽與守宮多糖對比活性分析 1、守宮多糖與守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響 我們原有的研究觀察了守宮多糖對人肝癌BEL-7402細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)守宮多糖可抑制人肝癌BEL-7402細胞的增殖。本研究同時觀察守宮多糖與守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響。
1.1、守宮多糖對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響 1.1.1、材料與方法 SMMC-7721細胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞中心；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國GIBCO公司產(chǎn)品；守宮多糖用PBS緩沖液溶解，超濾除雜，配制成2mg/ml的儲備液。
SMMC-7721細胞在5％CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％滅活胎牛血清的DMEM高糖，含1％雙抗(青霉素和鏈霉素)。每3～4天傳代一次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。12孔板每孔接種0.5×104/ml個細胞(2ml培養(yǎng)體系)，共接種84孔。接種后24小時加藥培養(yǎng)，分設(shè)守宮多糖高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低劑量組(10μg/ml)與PBS陰性對照組。分別于加藥后30分鐘、1～6天每組分別收集3孔細胞，臺盼藍染色，計數(shù)活細胞和死細胞，作生長曲線，計算細胞存活率。以下式計算細胞存活率細胞存活率(％)＝(活細胞/活細胞+死細胞)×100％。統(tǒng)計方法采用雙因素方差分析，全部統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件包SPSS(version16.0，Chicago，USA)完成。
1.1.2、結(jié)果 守宮多糖高劑量、中劑量組對人肝癌SMMC-7721細胞增殖有明顯抑制作用，但低劑量組對人肝癌SMMC-7721細胞增殖沒有抑制作用，參見圖9。
1.2、守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響 1.2.1、材料與方法 SMMC-7721細胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞中心；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國GIBCO公司產(chǎn)品；守宮糖肽用PBS緩沖液溶解，超濾除雜，配制成2mg/ml的儲備液。
SMMC-7721細胞在5％CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％滅活胎牛血清的DMEM高糖，含1％雙抗(青霉素和鏈霉素)。每3～4天傳代一次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。12孔板每孔接種0.5×104/ml個細胞(2ml培養(yǎng)體系)，共接種84孔。接種后24小時加藥培養(yǎng)，分設(shè)守宮糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低劑量組(10μg/ml)與PBS陰性對照組。分別于加藥后30分鐘、1～6天每組分別收集3孔細胞，臺盼藍染色，計數(shù)活細胞和死細胞，作生長曲線，計算細胞存活率。以下式計算細胞存活率細胞存活率(％)＝(活細胞/活細胞+死細胞)×100％。統(tǒng)計方法采用雙因素方差分析，全部統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件包SPSS(version16.0，Chicago，USA)完成。
1.2.1、結(jié)果 守宮糖肽高劑量、中劑量與低劑量組均對人肝癌SMMC-7721細胞增殖有明顯抑制作用。以上結(jié)果表明守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的抑制作用優(yōu)于守宮多糖，參見圖10。
2、守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞遷移的影響 2.1、材料與方法 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞，細胞接種的密度為0.5×104/ml，接種后24小時加藥培養(yǎng)，分設(shè)守宮糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低劑量組(10μg/ml)與PBS陰性對照組。于加藥后96h換液(含守宮糖肽的無血清的DMEM)，24h后收集各組細胞，重懸于無血清的DMEM。每組取1×105個細胞接種于24孔板transwell的上室，下室加入含10％胎牛血清的DMEM和CXCL12(100ng/ml)，每組平行設(shè)三孔，繼續(xù)于37℃孵育48h，用棉簽擦去transwell小室膜內(nèi)側(cè)的細胞，穿越至膜外側(cè)的細胞用4％的多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，計數(shù)。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，全部統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件包SPSS(version16.0，Chicago，USA)完成。
2.2、結(jié)果 守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞遷移的影響
P＜0.001 ●與PBS陰性對照組比較，P＜0.001 □與中劑量組比較，P＝0.001 ■與低劑量組比較，P＜0.001 ○與PBS陰性對照組比較，P＜0.001 ▲與低劑量組比較，P＝0.01

與PBS陰性對照組比較，P＝0.001 守宮糖肽高劑量、中劑量組與低劑量組均能顯著抑制人肝癌SMMC-7721細胞的遷移。
3、守宮多糖與守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞分泌白細胞介素8(IL-8)的影響 3.1、守宮多糖對人肝癌SMMC-7721細胞分泌白細胞介素8(IL-8)的影響 3.1.1、材料與方法 取對數(shù)生長期細胞用于實驗。12孔板每孔接種0.5×104/ml個細胞(2ml培養(yǎng)體系)，接種后24小時加藥培養(yǎng)，分設(shè)守宮多糖高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低劑量組(10μg/ml)與PBS陰性對照組。于加藥后120h收集各組細胞上清，離心，取上清。用雙抗體夾心法檢測IL-8的表達。IL-8的標準品的濃度梯度設(shè)置為500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml，7.8pg/ml，0pg/ml，每個劑量組平行設(shè)2孔。樣品每個劑量組平行設(shè)3孔。根據(jù)標準品的各個濃度與其對應(yīng)的吸光度(OD值)擬合曲線方程，再將樣品的OD值代入方程計算其濃度。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，全部統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件包SPSS(version16.0，Chicago，USA)完成。
3.1.2、結(jié)果 守宮多糖對人肝癌SMMC-7721細胞分泌IL-8的影響 P＝0.108 表明守宮多糖對人肝癌SMMC-7721細胞分泌IL-8沒有抑制作用。
3.2、守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞分泌白細胞介素8(IL-8)的影響 3.2.1、材料與方法 取對數(shù)生長期細胞用于實驗。12孔板每孔接種0.5×104/ml個細胞(2ml培養(yǎng)體系)，接種后24小時加藥培養(yǎng)，分設(shè)守宮糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低劑量組(10μg/ml)與PBS陰性對照組。于加藥后120h收集各組細胞上清，離心，取上清。用雙抗體夾心法檢測IL-8的表達。IL-8的標準品的濃度梯度設(shè)置為500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml，7.8pg/ml，0pg/ml，每個劑量組平行設(shè)2孔。樣品每個劑量組平行設(shè)3孔。根據(jù)標準品的各個濃度與其對應(yīng)的吸光度(OD值)擬合曲線方程，再將樣品的OD值代入方程計算其濃度。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，全部統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件包SPSS(version16.0，Chicago，USA)完成。
3.2.2、結(jié)果 守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞分泌IL-8的影響 P＝0.006 ●與PBS陰性對照組比較，P＝0.001 ○與PBS陰性對照組比較，P＝0.005 ▲與低劑量組比較，P＝0.032 說明守宮糖肽高劑量、中劑量組均對人肝癌SMMC-7721細胞分泌IL-8有明顯抑制作用。以上結(jié)果表明守宮糖肽具有守宮多糖不具備的抑制人肝癌SMMC-7721細胞分泌IL-8的功能。
4、守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響 4.1、材料與方法 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞，細胞接種的密度為0.5×104/ml，接種后24小時加藥培養(yǎng)，分設(shè)守宮糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低劑量組(10μg/ml)與PBS陰性對照組。于加藥后120h收集各組細胞，F(xiàn)luo-3AM酯(5μmol/L)于37℃標記40分鐘，用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子的濃度。
4.2、結(jié)果 守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響
P＜0.001 ●與PBS陰性對照組比較，P＜0.001 □與中劑量組比較，P＝0.002 ■與低劑量組比較，P＝0.001 ○與PBS陰性對照組比較，P＝0.003

與PBS陰性對照組比較，P＝0.011 守宮糖肽高劑量、中劑量組與低劑量組均能顯著抑制人肝癌SMMC-7721細胞細胞內(nèi)鈣離子濃度。
5、守宮糖肽對人肝癌SMMC-7721細胞骨架蛋白actin的影響 5.1、材料與方法 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞，6孔板每孔接種0.5×104/ml個細胞(3ml培養(yǎng)體系)，接種后24小時加藥培養(yǎng)，分設(shè)守宮糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低劑量組(10μg/ml)與PBS陰性對照組。于加藥后120h收集各組細胞，4％多聚甲醛固定，0.1％Triton X-100穿透，羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽標記細胞，于共聚焦顯微鏡下檢測F-actin的定位與分布。
5.2、結(jié)果 PBS陰性對照組的細胞呈多邊形，骨架蛋白actin沿著細胞膜分布，經(jīng)200μg/ml和100μg/ml守宮糖肽作用后，細胞呈紡錘狀，actin微絲聚合增加，主要分布在細胞漿。守宮糖肽低劑量組與陰性對照組相比，沒有差異。參見圖11。
應(yīng)用實施例1 將守宮糖肽制成符合藥劑學(xué)要求的注射劑型。
含守宮糖肽的注射液的制備 守宮糖肽，蒸餾水溶解，過濾，透析3次，調(diào)整濃度為10mg/ml，除菌，除熱原，無菌分裝為2ml/瓶。
應(yīng)用實施例2 將守宮糖肽制成符合藥劑學(xué)要求的口服劑型。
含守宮糖肽口服膠囊的制備 守宮糖肽，裝入空心膠囊，每粒50mg，封口，除粉，裝瓶。
含守宮糖肽口服片劑的制備 守宮糖肽，加糊精2份，淀粉2份，糖粉1份，氫氧化凝膠達總量的3％，壓片為50mg/片，裝瓶。
所述的守宮糖肽在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
所述的守宮糖肽在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
所述的守宮糖肽在制備治療病毒感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。
所述的守宮糖肽在制備治療HIV感染的藥物中的應(yīng)用。
所述的守宮糖肽在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
上述參照實施例對該守宮糖肽及制備方法和其醫(yī)藥應(yīng)用進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.守宮糖肽，其特征在于重均分子量大于2,000,000Da；比旋光度為-60°；碳元素的質(zhì)量百分含量為23.39％，氫元素的質(zhì)量百分含量為4.925％，氮元素的質(zhì)量百分含量為6.51％；其組成的糖部分含有鼠李糖，巖藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，摩爾比為鼠李糖∶巖藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶N-乙酰葡糖胺＝1.334∶3.363∶3.375∶6.983∶10.480∶0.019；單糖的連接方式主要為1，3-連接的鼠李糖，T-連接的巖藻糖，1，2，3，6-，1，3，4-連接的甘露糖，T-，1，4-連接的葡萄糖，T-，1，4-連接的的半乳糖和1，4-連接的N-乙酰葡糖胺；糖醛酸的質(zhì)量百分含量為3.08％；其結(jié)合型蛋白質(zhì)部分含有16種氨基酸，質(zhì)量百分含量為16.33％；糖肽鍵的類型含有O-連接；硫酸基的質(zhì)量百分含量為14.7％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述守宮糖肽的制備方法，其特征在于將守宮干燥、破碎后用有機溶劑抽提出脂溶性物質(zhì)，將脫脂后的藥渣用按守宮質(zhì)量的1-10倍熱水在30-100℃條件下浸提2-12小時，水提液過濾后分次加入乙醇至15％-80％濃度(V/V)沉淀，將沉淀溶解于水，1000-10000r/min離心取上清，常規(guī)sevage法除去雜蛋白，透析，干燥成粉，復(fù)溶解于粉末質(zhì)量30-180倍的含有0.5mol/L氯化鈉，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH6.5，加入粉末質(zhì)量0.5％-4％的木瓜蛋白酶及0.5-2倍的甲苯，50℃-80℃水浴4h-48h后補加粉末質(zhì)量0.2％-2％的木瓜蛋白酶，繼續(xù)水浴4h-24h；水解液濃縮后以乙醇沉淀，收集沉淀，依次用無水乙醇，丙酮洗滌，復(fù)溶于水，過濾，常規(guī)sevage法除去雜蛋白，濃縮，透析，干燥，得守宮糖肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述守宮糖肽，其特征在于將其制成符合藥劑學(xué)要求的注射劑型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述守宮糖肽，其特征在于將其制成符合藥劑學(xué)要求的口服劑型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的守宮糖肽在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的守宮糖肽在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的守宮糖肽在制備治療病毒感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的守宮糖肽在制備治療HIV感染的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的守宮糖肽在制備免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種守宮糖肽及制備方法和其醫(yī)藥應(yīng)用，所述守宮糖肽，重均分子量大于2,000,000Da；組成糖含有鼠李糖，巖藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，糖醛酸；其結(jié)合型蛋白質(zhì)含有16種氨基酸，質(zhì)量百分含量為16.33％；硫酸基質(zhì)量百分含量為14.7％；本發(fā)明在應(yīng)用守宮多糖的基礎(chǔ)上進一步研究，并得到科學(xué)驗證；守宮糖肽較守宮多糖對惡性腫瘤有更高的療效，能有效抑制腫瘤細胞的增殖和遷移；可單獨用于惡性腫瘤的治療，也可用于腫瘤手術(shù)、放療、化療與介入治療的輔助治療；以及艾滋病等病毒感染性疾病的防治；同時可作為一種新的免疫調(diào)節(jié)劑，用于腫瘤與慢性感染等疾病的治療。
文檔編號A61P37/02GK101768215SQ201010104900
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者吳雄志 申請人:吳雄志