專利名稱：：糖模擬肽及其在藥物制劑中的用途的制作方法糖模擬肽及其在藥物制劑中的用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別地涉及用于預(yù)防性或治療性應(yīng)用的新型疫苗制劑的開(kāi)發(fā)，所述新型疫苗制劑允許誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答以4氐抗不同來(lái)源的疾病。
背景技術(shù)：
：具有通過(guò)(a2-8)鍵連接的、N-取代的神經(jīng)氨酸重復(fù)單元的化學(xué)結(jié)構(gòu)的糖類例如作為腦膜炎奈瑟氏球菌(#e/Mer/a邁e/7/z^/7/V/s)B血清群的多糖莢膜的組分而存在。特別地，這種細(xì)菌的莢膜由通過(guò)(a2-8)鍵連接的N-乙?；窠?jīng)氨酸的重復(fù)單元組成(BhattacharjeeA.K.等人，1975.5Yrw"wra/cf"er/z7//23〃ooo尸f力e"'a7/cac/d^s力dCfr/f力C3r6cw/"c7ear/zw《"eZ/c了e5^/7s刀ce.J.Biol.Chem.250:1926-1932)。腦膜炎奈瑟氏球菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，其唯一的宿主是人，并且組成了腦膜炎球菌病(meningococcaldisease)的致病因子。通常，在寄居于稱為攜帶者的健康個(gè)體的上呼吸道中的天然暫居^:生物群體之中發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌。這是分離林的最常見(jiàn)來(lái)源。2歲以下的兒童最容易感染腦膜炎球菌性腦膜炎，該疾病是腦膜炎球菌病的最常見(jiàn)的臨床并發(fā)癥。然而，青少年和成年人也可受到影響。未治療的腦膜炎球菌病在大多數(shù)患病個(gè)體中是致命的，疫苗接種可以預(yù)防這種情形，甚至預(yù)防早期階段例如細(xì)菌移居。腦膜炎奈瑟氏球菌臨床分離林通常是有莢膜的。分離林的莢膜的結(jié)構(gòu)差異引起抗原性的差異，并且為將這種細(xì)菌分類為幾個(gè)血清群的基礎(chǔ)(RosensteinN.E.和PerkinsB.A.2000.o/Pediatr.Clin.North.Am.，47:337-352)。從臨床觀點(diǎn)來(lái)看，A、B、C、Y和W-135血清群在目前報(bào)導(dǎo)的13種腦膜炎奈瑟氏球菌血清群中是最重要的。A血清群是撒哈拉南部非洲中該病流行的主要原因。B和C血清群與發(fā)達(dá)國(guó)家中發(fā)生的大多數(shù)病例相關(guān)。Y和W-135血清群是造成在美國(guó)一些地區(qū)中報(bào)導(dǎo)的該疾病和感染的其余病例中大多數(shù)的原因，過(guò)去幾年出現(xiàn)顯著增加(RosensteinN.等人，2001.#e/7//^cocca/crease.N.Engl.J.Med，344，1378-1388)。B血清群是造成50-70%的在嬰兒和兒童中報(bào)導(dǎo)的細(xì)菌性腦膜炎病例的原因，其可在^皮感染的青少年中造成致命的膿毒癥(RomeroJ.D和0utschoornI.M.1997.7"/e/鵬u/zerespoose&Mecapsw/ai*/70//sacc力ar2'cfeyv^/sser/a/pe///^/,/^//^gro";7及Zentralbl.Bakteriol.285:331-340)。設(shè)法抵抗由腦膜炎球菌B血清群引起的疾病的策略之一是將在指數(shù)生長(zhǎng)期期間從細(xì)菌外膜釋放的外突物用作免疫yf、。這些夕卜突物稱為夕卜膜囊夕包(outermembranevesicle)(OMV)。為了在疫苗中使用，純化所述嚢泡，其中通過(guò)去污劑處理來(lái)除去脂多糖類(LPS)。這些嚢泡中的抗原主要是細(xì)菌外膜蛋白(FraschC.E.等人，1988.J/7〃60cO^res/7o/7seo尸adu/"&a/2a/咖2'/7咖/7i*c^e/"-^T("/7"/707/i^cc力sr/deF"c/"e.J.Infect.Dis.158:710-718)。已在臨床試驗(yàn)中分析了幾種基于0MV的疫苗(RosenqvistE.等人，1991.^y^2/7s/7/76od/Tespaosesa/7er7ac￡//7af/oow/f力f力eAorfreg/a"group"/z7e/ji刀gococca7oufe,J27e/n6rai3eres/cieF縱/ze..r證7"/濯iX，W油'ei.NIPHAnn.14:169-79;SierraG.V.等人，1991.「scci/eaga/./2Stgrow;5iYe/^er/sC"6a.NIPHAnn.14:195-207)。基于血清學(xué)分類B:4:PI.19，15的菌林(來(lái)自古巴的病例的最常見(jiàn)分離林)的古巴疫苗，商業(yè)上稱為VA-MENGOC-BC，在實(shí)地臨床試驗(yàn)(fieldclinicaltrial)中顯示出83%的功效。作為在古巴大規(guī)模應(yīng)用該疫苗的結(jié)果，腦膜炎球菌病的發(fā)病率從1983年的每100OOO個(gè)居民中14.4個(gè)被感染減少至1994年的每100000個(gè)居民中0.45個(gè)病例(SierraG.V.等人，1991.&cc//7e鵬5^7acc//7"/0/7resw/"NIPHAnn.14:195-207;DiazR.J.和OutschoornI.M.1994.Curre/2fo尸/z7e/z//zgococca/^tow/^yacc/zzeca/d/c^fes..ca/su/aror"o/zcs/^w/arClin.Microbiol.Rev.7:559-575)。這種疫苗從1989年至1990年在SaoPaulo(巴西)的應(yīng)用控制了在該地區(qū)中的流行性暴發(fā)(deMoraesJ.C.等人，1992.尸r0fec〃7ee/77cac/o尸asero^roi/pA/z7e/3//7gc>cocca/7acc//2e/刀夕ao尸3w/0,"raz//.Lancet340:1074—1078)。然而，這些疫苗只從一個(gè)菌株產(chǎn)生，從而使保護(hù)作用是血清型或亞型特異性的，主要限于源菌林。另一方面，腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群菌林的循環(huán)在時(shí)間和地理上發(fā)生變化。因此，該類型的疫苗的應(yīng)用局限于隔離的地理區(qū)域(其中菌林的循環(huán)受到限制)或者局限于具有流行性暴發(fā)的地區(qū)(在該地區(qū)中，造成暴發(fā)的菌抹是經(jīng)充分表征的，并且產(chǎn)生了終止這些流行病的特異性疫苗)(HoistJ.等人，2005.r力ec0/2cej^aga//2"/z7e"http://zgococca/crease.Vaccine23:2202-2205)。來(lái)自幾種菌抹的OMV的不同制劑的簡(jiǎn)單組合不是有效的選擇，因?yàn)槠淇梢垣@得高水平的LPS含量/劑疫苗，從而具有引起副作用的危險(xiǎn)(DiazR.J.和OutschoornI.M.1994.fi/rre/2ffi/so尸/z7e/7/z7goc(cca/grow/^7acc2'/2eca"tZ/if"e5vca/7sw/aror/70/7ca/^w/盯？Clin.Microbiol.Rev.7:559-575)?；趶哪X膜炎奈瑟氏球菌的細(xì)胞中純化的莢膜多糖的疫苗已能夠提供針對(duì)由A、C、Y和W135血清群引起的腦膜炎球菌病的保護(hù)。這些疫苗能夠在成人中誘導(dǎo)殺菌性和保護(hù)性抗體，以及有效控制流行性暴發(fā)(RosensteinN.等人，2001.j1/e/7/7i/7^ccocca_/d/sease.N.Engl.J.Med，344:1378-1388)?；趶腃血清群細(xì)菌中純化的、綴合至載體蛋白的多糖的新一代疫苗可在市場(chǎng)上商購(gòu)獲得。在英國(guó)進(jìn)行的實(shí)地臨床試驗(yàn)中，這些疫苗不僅在成人中而且在兒童中顯示了它們誘導(dǎo)殺菌性和保護(hù)性抗體的能力(MillerE.等人，2002.尸/s/2"http://^，<2^2//75^/ze/72'/《ococca/serc^Tow/7Cdisease/刀f力essi/cce5^Vaccine20;s58-s67)。此外，所述經(jīng)綴合的疫苗允許克服與使用單純的多糖作為免疫原相關(guān)的主要困難，例如誘導(dǎo)了非胸腺依賴性和短期的免疫應(yīng)答、不存在具有親和力成熟的記憶免疫應(yīng)答的刺激。此外，已在例如該疾病的高發(fā)病率地區(qū)，在反復(fù)用這些疫苗進(jìn)行接種的個(gè)體中，描述了在C血清群的情況下被充分證明的低應(yīng)答性現(xiàn)象(hyporesponsivenessphenomenon)的誘導(dǎo)(JenningsH.和LugowskiC.1981.//M7w/oc力eyz7/sfr/^row;^^，^a/7"CImmunol127:1011-1018;GoldR.和LepowM.L.1975."/刀/ca/e卩a/wat/o"o_fgroupXa/idC邁6/2//2^0(70^^3/po/ysaccAar/deyacc/ze51//2//2/"a/7f51.J.ClinInvest56:1536-47;BorrowR.等人，2001./"/7we"ce0//rioriZ7e/7//7《0cocca7Cp0/7sacc力ar/'deyacc//7af/c>/2f力eres/(/7sea力d/ge/7erat/o/邁e邁orja/YerInfectDis184:377-380)。幾種針對(duì)A血清群的綴合物疫苗正在經(jīng)歷臨床研究，其已證明是安全的、具有免疫原性的和能夠誘導(dǎo)免疫記憶應(yīng)答(WorldHealthOrganisation.1999.iYaWartZ/za〃o/za/zd7a7i^3〃a/7ofserc7o《yca7/orf力eeKa7wa〃0/7o/i邁邁MeVaccineDevelopmentTeamoftheDepartmentofVaccineandBiologicals.Ginebra，www.who.int/gpv-documents/;CampagneG.等人，2000.5^尸ef/a/7d//ZMw/7C^e/72.d7/o尸f力reedc^eso/*a//7尸a/2"/V咖Pediatr.Infect.Dis.J.19:144—150;BorrowR.等人，2000./72i/i/cf/onC//ZMw/7o/c^7ca7/ffe忠or///7//7尸3/2f夕67a/e/7//7《ococca_/J/Cco/7乂w^2feEpidemiol.Infect.124:427—432;ChooS.等人，2000.//ZM7w/70ge/7/ci.^rcomparedw/f力s^row/爿+C/ne/22'/2gococca7poZ/s^ccAary^/e7acc//7eVaccine18:2686-2692)。B血清群莢膜多糖的弱免疫原性已排除了基于該化合物的疫苗制劑(ColinoJ.和OutschoornI.1998./j72a/z72'cso/*^e力wz7。ra///ZM7w/7eresponsefoiVe/wer/a邁6/7//^/〃^/<gr卯/5capsw/ar/70//sacc/ar2Ve.Infect.I鵬un.66:505-513)。腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群莢膜多糖由唾液酸組成，特別是由具有大約200個(gè)通過(guò)a(2-8)鍵連接的N-乙?；窠?jīng)氨酸的重復(fù)單元的線性同聚物組成(BhattacharjeeA.K.等人，1975.57ri/"w"7^^erm/zzs〃ozo尸f力es/a7/csc/'d/70//sacc力sry^eai2f/gei351o/iVe/515^//3re濯露e.J.Biol.Chem.250:1926-1932;FroschM.和EdwardsU.1993.#o/ecw/ar邁ec力a/2.57Z7o尸ca/sw/eej7re51570/72'T2^/^^￡/^/ge/H'/^'tWsserc^rowp及p49-57inJ.Roth，U.Rutishauser和F.A.Troy(ed)，Polysialicacid,frommicrobestoman.BirkhauserVerlag，Basel,Switzerland)。這些長(zhǎng)的糖鏈在細(xì)菌表面上采取螺旋形式的空間排布，其中采取了特征性的三維結(jié)構(gòu)，在該三維結(jié)構(gòu)的形成中細(xì)菌外膜的蛋白質(zhì)和其他組分也作出了貢獻(xiàn)(ColinoJ.和OutschoornI.1998.//z7a邁/cso尸f力e/Hf/r/i2e力u/wora/一/軀由r油.InfectImmun66:505-513)。這種同聚物不限于m.面"勿'8661'Iujooqos,—tou"o;):S8Z10口9i與'G7ojquio)i)》善:ppT耍，W啤夢(mèng)^^爭(zhēng)'+l^擬到'蕃^W、銘,f效^森枯夢(mèng)畔#'+TT(^漆顯夢(mèng)承，夢(mèng)。^FSW蟹^W紹蹄承一^U^、dT夢(mèng)廿^紹瑕^W^^爭(zhēng)^+Y，'W(g。《^^Y晷f4^女^善每^逸*爭(zhēng)哥'+郫^n^^4f4鄰效^夢(mèng)廿w啤^魂^爭(zhēng)w善每輩單if°(89K-t^￡Z:t7"soj呵.j;兩"s1，〃33zj/歸，j^/T》861'y余.W.33畫(huà)q:))^古T罩々OS-(H'群^菊銖WTW鳴Y'W醉銖f謝^扭柴平8奧,^蓉專^教鄉(xiāng)^^'W賃錄一+W(WVM)去々魯紳^啤努枯^啤鐘伶^》丄Y脈彿遂fel^^古T罩W^貨努枯節(jié)^^-N^辨審教(8-Z)FlF。賃衫凍^爭(zhēng)JL^"T^T頃》^紹瑕承一^"紛Y夢(mèng)U99叢〗9qiU"u9pi'1661'Y會(huì)T.S!a9qUsoi-6A01:乙H9861'Y會(huì)瓜BIPV〗89Z—Z92:011'ioummui'f.s7/7.,〃聊u譜"61'Y僉']'d"dSB3)+(鐘^褂莉^孩非^I喜+絮首)("5/^g7^^〃-0Y7ff87,575v。D虔^摔葉^婆止；夢(mèng)妒^r"'+(，^^*蜀貴^音罩)("〃//0ffl^5^g〃9J77^5^J)嵐^對(duì)搶2亨繁^夢(mèng)甘'+都^^(^^^^^教^^1S+V^4f夢(mèng))12W:"3^W)隳^^Y^夢(mèng)廿？貨^(a'妞^平8廣，f^蓉普l(shuí)f敦敏雖0S/9憲法能改o/*f力e/Z7wr2'/7e力w/z7ora//'/zM7W3ere5770/7sefoiVe/Mer/a膨/7//^/〃<^TOi/p5capsw/ar/707/sacc力ar/ffe.InfectImmun66:505-513)。體外實(shí)驗(yàn)表明，針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的莢膜的抗體與人組織的聚唾液酸反應(yīng)(FinneJ.等人，1987.J//g《邁o/oc7o/7Wa/7f/60c^Fto^T0i/;i/z/e/72./2gococc/cross—reacitsv/f力^7/co/7rofe//^///zewra/eA^ra/e:/ra/〃《si/e<y.J.Immunol,138:4402-4407)。這種交叉反應(yīng)性可解釋腦膜炎球菌B血清群莢膜多糖的低免疫原性，其通過(guò)可能形成了免疫耐受而引起(由于其與存在于宿主組織中的多糖的同源性)。已警示了這樣的可能性，即在體外已顯示出識(shí)別人組織的抗腦膜炎球菌多糖B抗體可能將導(dǎo)致形成自身免疫性疾病。然而，迄今仍不可能在體內(nèi)證明抗多糖B抗體與人組織的有效結(jié)合，也不可能將任何病理學(xué)狀況與在人血清中循環(huán)的高水平的抗腦膜炎球菌多糖B抗體的存在聯(lián)系在一起。幾個(gè)研究報(bào)導(dǎo)了，通常，在享有良好健康的個(gè)體(包括已有健康孩子的母親)的血清中，循環(huán)著識(shí)別腦膜炎球菌多糖B的抗體。除此以外，在南非進(jìn)行的研究中，在用蛋白質(zhì)-腦膜炎球菌多糖B綴合物疫苗免疫接種500多位成年人和2000位兒童后，沒(méi)有報(bào)導(dǎo)副作用(Mandrel1R.E.和Zol1ingerW.D.1982.,easwre邁e/Uo/a/7〃6oc^'e51to/力gococca7^rou/5c譜"/".J.Im隱o1129:2172-2178;ZollingerW.D.等人，1984.Sa尸e^Ko/*73cc/z2esco"fa//2'/7g歷e/22'/7gococca/grow/5po7j^acc力aT/cfe.Lancet2:166'，DeviS.J.等人，爿72f/6c^2'es/o7/----《j一37/;力a-yV一3ceO^刀ewra邁yi3/ca刀dpo/y/Y2----_^—3//7力3—#一<2060^/76〃7*3/7//7/匚sc/c//aree//c/7e(/6/i/n邁w//zaf/0/20/邁/ce五scAer2'c力/aco/if夕2co/7_/t;ga/70te/2t/a/7acc2'/7es尸orgro"/^^a/2dC/z7e/2/;2gococcya"cfi".co7//丄Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7175—7179;KabatE.A.等人，1988.r力ee/7/fo/eassoc/afpt/^力f力e6//zi///2g0/t力eJ.Exp.Med.168:699—711;GranoffD.M.等人，1995.J/7".60c^respo/3sestot力ecapsu/arpo//sacc/ar!.￡/eo/"A^'sser/aClin.Diagn.Lab.Immunol.2:574-582;RomeroJ.D.和OutschoornI.M.1997.7力e/邁歷"/7eres/o/7sefof力eca/sw/ar;7o7/sacc力ar/(/e。/TYe/weWa《ro"/7及Zentralbl.Bakteriol.285:331-340;SteinD.M.等人，2005.irea/7/76o^.ei1foZ力ei5^c力er/c力/aco//s5^0c/'afedy/f力/yzMw/70/7afAo/c^/..Vaccine.即將出版的論文(Articleinpress))。繼續(xù)研究腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群莢膜多糖在疫苗制劑中用作免疫應(yīng)答的靶標(biāo)的用途主要有兩個(gè)原因。首先，該多糖是B血清群中最保守的結(jié)構(gòu)，因此基于多糖的疫苗可在高數(shù)目的病例中提供針對(duì)感染的保護(hù)，其數(shù)目比可由基于細(xì)菌外膜蛋白(其誘導(dǎo)具有有限的與其他菌株的交叉反應(yīng)的抗體)的疫苗所覆蓋的病例的數(shù)目多得多。第二，如之前所討論的，在具有于血清中循環(huán)的抗腦膜炎球菌多糖B抗體的個(gè)體中不存在免疫病理學(xué)副作用。已使用了幾種策略，目的是增加多糖B的免疫原性(BartoloniA.等人，1995.//M7u/3oge/3/ci77iZe/72'/zgococca7po/ysaccAar/deco/2yw^2tedfefs/7i/sfo義02.f/orC/#_/^7.y/aad/p/cac/dd/一，流Vaccine,13:463-470;DeviS.J.等人，1997.7acc/z7e512'/2yi/7e/22'7er力es:/s邁anire/s1.Infect.Immun.65:1045-1052)。例如，使用經(jīng)修飾的B血清群莢膜多糖(其中用N-丙酰基替代N-乙?；?的糖綴合物進(jìn)行免疫接種誘導(dǎo)了兩種抗體群體的產(chǎn)生一種占小部分的抗體群體，其可用從細(xì)菌中純化的多糖B的溶200680053451.5液吸附，并且不具有殺菌性和保護(hù)性活性；一種占大部分的抗體群體，其不能用純化的腦膜炎球菌多糖B吸附，屬于IgG同種型，顯示出針對(duì)幾種來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的菌株的殺菌活性，能夠減輕或甚至消除用致死劑量的腦膜炎球菌攻擊的小鼠中的菌血癥，并且不識(shí)別人組織(JenningsH.J.等人，1987.N-propionylatedgroupBmeningococcalpolysaccharidemimicsauniqueepitopeongroupBNeisseriameningitidis.JExpMed165:1207-1211;JenningsH.J等人，1986。InductionofmeningococcalgroupBpolysaccharide-specificIgGantibodiesinmicebyusinganN-propionylatedBpolysaccharide-tetanustoxoidconjugatevaccine.JImmunol137:1708-1713;AshtonF.E.等人，1989.ProtectiveefficacyofmouseserumtotheN-propuonyldetivativeofmeningococcalgroupBpolysaccharide.MicrobPathog6:455-458;MichonF.等人,1987.Conformationaldifferencesbetweenlinearalpha(2----8)-linkedhomosialooligosaccharidesandtheepitopeofthegroupBmeningpcoccalpolysaccharide.Biochemistry26:8399-8405;PonR.A.等人，1997.N-PropionylatedgroupBmeningococcalpolysaccharidemimicsauniquebactericidalcapsularepitopein-groupBNeisseriameningitidis.J.Exp.Med.185:1929-1938)。這些結(jié)果表明，在來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的多糖B中存在兩種主要表位當(dāng)該多糖以短鏈的形式(如在人細(xì)胞的表面上顯現(xiàn)的)或以隨機(jī)構(gòu)象(在純化的多糖的溶液中常常發(fā)現(xiàn)的)存在時(shí)可被檢測(cè)的第一種表位(DiazR.J.和OutschoornI.M.1994.CurrentstatusofmeningococcalgroupBvaccinecandidates:capsularornoncapsularCline.Microbiol.Rev.7:559-575).該表位產(chǎn)生不殺菌的自身抗體。第二種表位只有在該天然多糖保持其高分子量且在空間上以螺旋形式排列(如在細(xì)菌的表面上)時(shí)才可檢測(cè)到。構(gòu)象本質(zhì)的該第二種表位負(fù)責(zé)產(chǎn)生不識(shí)別人組織的殺菌性和保護(hù)性抗體。已報(bào)導(dǎo)了單克隆抗體的分離，所述單克隆抗體根據(jù)它們的特異性和性質(zhì)被分類為正好相應(yīng)于先前描述的兩類抗體的兩個(gè)群體(PonR.A.等人，1997.^-尸ro//o/7j^"edgrow/7"me"http://^ococca///2-^To";7_g^Ye/^er/aWs.J.Exp.Med.185:1929-1938;GranoffD.M.等人，1998.萬(wàn)acter/c/da//zo/2oc/o"a/a刀f/6od/esdoci"c^s—reacf力wz/a刀poJ/siaJicJImmunol160:5028-5036)。在從細(xì)菌中純化的多糖B的溶液中主要發(fā)現(xiàn)無(wú)構(gòu)象的、與人N-CAM共有的表位，這解釋了多糖B的低免疫原性和在免疫后在其所誘導(dǎo)的抗體中檢測(cè)到的極少的殺菌活性。通過(guò)用N-丙酰基替代N-乙?；谠摱嗵侵幸氲臉?gòu)象變化誘導(dǎo)了非自體反應(yīng)性、殺菌性和保護(hù)性抗體的主要群體的產(chǎn)生。然而，N-丙?；亩嗵荁也誘導(dǎo)了部分的自身抗體(盡管以低的比例)，這在其用作疫苗時(shí)引起人們的注意，甚至當(dāng)最近的研究顯示其在人中用作免疫原具有安全性時(shí)(BrugeJ.等人，2004.^7//2.ca/eya/i/a〃o/7ofa^to"/^/ze/7/;^ococca/鵬/e70/i//^eerAVaccine.22:1087-1096)。為了設(shè)計(jì)針對(duì)腦膜炎球菌B血清群的疫苗，將莢膜多糖用作免疫應(yīng)答的靶標(biāo)的另一種備選方案是將肽序列用作免疫原，所述肽序列組成了對(duì)于負(fù)責(zé)保護(hù)作用、當(dāng)糖以其天然構(gòu)象存在于細(xì)菌表面上時(shí)存在于多糖B中的構(gòu)象表位而言特異的分子模擬物(模擬表位)。鑒定莢膜多糖的模擬表位的方法是用在絲狀噬菌體中展示的抗體隨機(jī)肽文庫(kù)進(jìn)行的淘選。該技術(shù)基于絲狀噬菌體在它們的表面上展示與病毒莢膜蛋白質(zhì)融合的外源肽序列的能力。在病毒顆粒的表面上展示的肽序列可容易地接近，并且潛在地能夠結(jié)合用于選擇的分子，從而可基于這種親和力來(lái)選擇它們?？扇菀椎貜乃x噬菌體的基因組的核苷酸序列推導(dǎo)出通過(guò)某一性質(zhì)選擇出的噬菌體文庫(kù)的肽序列(ParmleyS.F.等人，1988.Antibody-selectablefilamentousfdphagevectors:affinitypurificationoftargetgenes.Gene73:305-318;SmithG.P.等人，1993.Librariesofpeptidesandproteinsdisplayedonfilamentousphage.MethodsEnzymol.217:228-257;CwirlaS.E.等人，1990.Peptidesonphage:avastlibraryofpeptidesforidentifyingligands.Proc.Natl.Acad.Sci.USA;87:6378-6382)。為了成為可能的疫苗候選物，這些肽必須首先能夠結(jié)合針對(duì)原始抗原的特異性抗體和抑制這些抗體與該抗原的結(jié)合。第二，它們必須誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答的特征在于存在識(shí)別該病原體和提供針對(duì)其所引起的感染的保護(hù)作用的抗體。這些肽具有確定的和可重現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，并且可以在疫苗制作中代替天然抗原，另外的優(yōu)點(diǎn)是它們誘導(dǎo)的抗體的靶標(biāo)是充分確定的，消除了誘導(dǎo)能夠識(shí)別人組織的自身抗體的可能性，從而避免了形成自身免疫性疾病的可能'f生(Monzavi—KarbassiB.等人，2002.Peptidemimotopesassurrogateantigensofcarbohydratesinvaccinediscovery.Trends.Biotechnol.20:207-214)，這在來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的莢膜多糖的情況下是特別重要的。在另一方面，可能使用展示肽的噬菌體直接免疫接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。這加快了可能的疫苗候選物的免疫評(píng)估的過(guò)程，因?yàn)檫@可能避免肽合成和綴合至蛋白質(zhì)載體的常規(guī)程序。已證明，絲狀噬菌體是有效的載體蛋白，其能夠有效地將肽呈遞給免疫系統(tǒng)(MeolaA.等人，1995.Derivationofvaccinesfromminmotopes:ImmunologicpropertiesofhumanhepatitisBvirussurfaceantigenmimotopesdisplayedonfilamentousphage.J.Immunol.154:3162—3172:delaCruzV.F.等人，1988.Immunogenicityandepitopemappingofforeighsequencesviageneticallyengineeredfilamentousphage.J.Biol.Chem.263:4318-4322;Gree畫(huà)odJ.等人，1991.Multipledisplayofforeighpeptidesonafilamentousbacteriophage.PeptidesfromPlasmodiumfalciparumcircumsporozoiteproteinasa/2">e/^.J.Mol.Biol.220:821-827;WillisA.E.等人，1993./卿w2c^o^7ca/prefer〃es尸ore/g"pep〃des/'/7邁w/〃/7ed/577/ay0/2a/7/諸e/7fow516a"er/o;7力age.Gene128:79—83;Galfr6G.等人，1996.//zM/wn'zaf2'o/w^7力；7力age—cf/sp/a/ed邁/訪c^o/;es.MethodsEnzymol.267:109-115;BastienN.等人，1997.尸rWe"細(xì)//zM7w/eresponses//dwcei/6/f力e/邁邁w//zsf/o/7c尸/7/ce<2reccw6/'/7a/7t6acfer/0;7力a《e^75^/3//'/7《a/7e/7/7o/7eoff力eAi//z72/7res/7/r"07ysj77cy〃a/Virology234:118-122;Men6ndezT.等人，2001.//H邁w2/safio/7y/f力/7力age—d/s/7/a/edKar2.a6/e2/Vo/z7/z7e"7/《ococca7owfer范e/16ra/2e/^rofe///"c^cesImmunol.Lett.39:143-148)。通過(guò)使用這種方法，除其他以外，已鑒定了幾種多肽，其構(gòu)成新型隱球酵母(Crj7^ococcws/zeo/or則/7s)、A群鏈球菌(i7repfococcwsgroupA)、B群鏈球菌(5Yr一ococ面groupB)的莢膜多糖和弗氏志賀氏菌(5^2>e//a/7e;r/er2')的脂寡糖的分子模擬物(ValadonP.等人，1996.戶e/7f/de/2.6rar/esde/7力ef力e/7/zespec/ZVci^Fo/*Mol.Biol.261:11-22;HarrisS.L.等人，1997.i>/7or//^Me6aWs/7e/7〃de-cflr60/7j^/racrossreac〃".We"Ve/ce尸ord/scr/'j!Z/2V3af/a/6/pe;,/i/es6effree力c7ose7/re/afeda力t/一car6o/j^/i"aa/7f/60d/es.Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:2454—2459;PincusS.H.等人，1998.戶e;^/cfes^Aaf/zz/zw/cf力e^row;Immunol.160:293-298;PhaliponA.等人，1997.//3c^c〃0/2o尸/z2./z/cs.Eur.J.Immunol.27:2620-2625)。在針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌的疫苗開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中，還進(jìn)行了涉及細(xì)菌莢膜多糖的分子模擬物的鑒定的工作。例如，已報(bào)導(dǎo)了，通過(guò)使用對(duì)于這種多糖特異的單克隆抗體對(duì)在絲狀噬菌體上展示的隨機(jī)肽文庫(kù)進(jìn)行選擇來(lái)鑒定A血清群的莢膜多糖的分子模擬物。所述模擬表位能夠抑制人超免疫血清與天然抗原的結(jié)合和能夠在免疫接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后誘導(dǎo)高水平的抗多糖抗體的產(chǎn)生(GrothausM.C.等人，2000.t/2'^7ay//6rs/r.Vaccine18:1253-1263)。在腦膜炎球菌C血清群的情況下，合成具有相應(yīng)于抗獨(dú)特型抗體的輕鏈和重鏈高變區(qū)的序列的肽(模擬了腦膜炎球菌多糖C)，并用所述合成的肽進(jìn)行免疫接種，導(dǎo)致在經(jīng)免疫接種的動(dòng)物的血清中檢測(cè)到高水平的保護(hù)性抗腦膜炎球菌多糖C抗體(WesterinkM.A.等人，1995.尸e/7〃de邁/zz7/cr/f力e/ffe/7//7gc>coccW^row/7Cca;si/7ar/^7/5^cc力a"'de.Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:4021-4025)。由于可能將免疫應(yīng)答準(zhǔn)確地導(dǎo)向針對(duì)存在于所述血清群的多糖中的保護(hù)性構(gòu)象表位(其不與人N-CAM共有)，模擬表位的鑒定技術(shù)的應(yīng)用在搜尋針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的疫苗候選物中是至關(guān)重要的。已報(bào)導(dǎo)了使用四種單克隆抗體以及線性和環(huán)狀的七氨基酸長(zhǎng)的肽的兩個(gè)文庫(kù)來(lái)鑒定此類結(jié)構(gòu)，但在出版物中沒(méi)有反映此類結(jié)構(gòu)的免疫學(xué)評(píng)估(ShinJ.S.等人，2001.#o/7oc/offa/a/〃6od/e51s/7ec/Z7c尸or^e/sseWa/pe///7g/〃c^^r0"/75/70//sacc力aride^e/r;7e/^2'de/z72'/z70fo/7es.Infect.Immun.69:3335—3342)。后來(lái)，在2004年的出版物中，通過(guò)使用以前工作的單克隆抗體之一和展示出線性的12氨基酸長(zhǎng)的肽的噬菌體文庫(kù)，報(bào)導(dǎo)了三種新結(jié)構(gòu)的鑒定，并在動(dòng)物模型中進(jìn)行了免疫學(xué)評(píng)估。所述血清很好地識(shí)別腦膜炎球菌B血清群，但在出版物中沒(méi)有反映這些抗體的功能活性的評(píng)估(ParkI.等人，2004.尸e/7〃t/e邁/膨fo;e51oTiYe/5^er/a/pe//i7^g7〃t//51sero^ro"/5cs;7Si/7ar;o7/5^cc力s"Ve.YonseiMedicalJournal.45:755-758)。Granoff和Moe(GranoffD.M.和MoeG.R.2003."epHopes.美國(guó)專利6,642,354B2)保護(hù)67種肽序列在疫苗制劑中的用途，所述肽序列基于它們結(jié)合針對(duì)B血清群莢膜多糖的單克隆抗體的能力而選自在噬菌體中展示的肽庫(kù)。合成了它們中的兩種以選擇用于免疫學(xué)研究，并且將它們綴合至腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜嚢泡，所述嚢泡純化自莢膜突變型腦膜炎球菌B血清群菌林。在該專利中公開(kāi)了，使用此類綴合物之一進(jìn)行的免疫接種誘導(dǎo)產(chǎn)生顯示出針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的殺菌活性的抗體?？紤]到將該肽綴合至腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜嚢泡(所述嚢泡的主要組分是該細(xì)菌外膜的蛋白質(zhì))和考慮到充分證明了它們誘導(dǎo)具有針對(duì)腦膜炎球菌的殺菌活性的抗體的能力，解釋這些結(jié)果是非常困難的。在該研究中使用OMV作為載體妨礙了直接評(píng)估該肽誘導(dǎo)具有殺菌活性的抗體的能力。作者認(rèn)為在這些血清中檢測(cè)到的殺菌活性的級(jí)分是由于存在抗肽抗體，因?yàn)樗鲅迮c未綴合的肽的溫育在測(cè)定法中增加了細(xì)菌的存活。然而，在反映這些結(jié)果的科學(xué)出版物中，它們報(bào)告了，在用肽-OMV綴合物免疫接種后所引發(fā)的抗體微弱地識(shí)別原始抗原，并且未報(bào)導(dǎo)對(duì)血清的殺菌活性的評(píng)估(MoeG.R.等人，1999，#o/ecw7arpolysaccharidepputopesascaccinecandidatesforpreventionofNeisseriameningitidiesserogruopBdisease.FEMSImmunnol.Med.Microdiol.26和GranoffD.M.2001./o7"acc力ar/de.Int.Rev.Immunol.20:201-20)。特別是在針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的疫苗的領(lǐng)域內(nèi)，鑒定模擬表位的這一備選方案是重要的，因?yàn)楦鶕?jù)該方法選擇出的肽，即使與原始抗原完全不同，仍然能夠?qū)е庐a(chǎn)生針對(duì)處于其夭然情形中(即，在細(xì)菌的表面上，在這種情況下形成在多糖B上存在的保護(hù)性構(gòu)象表位)的抗原的抗體。這些肽誘導(dǎo)產(chǎn)生具有針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌性和保護(hù)性活性的抗體。此外，因?yàn)檫@些肽引發(fā)的抗體不與由存在于某些人組織上的聚唾液酸短鏈所形成的表位交叉反應(yīng)，從而消除了引起自身免疫性應(yīng)答的可能性。因此，它們組成了備選的抗原來(lái)源，以允許開(kāi)發(fā)在疾病的診斷、治療或預(yù)防中具有潛在用途的新一代試劑。發(fā)明詳述在本發(fā)明中，第一次報(bào)導(dǎo)了肽NMGBPS1、NMGBPS2、NMGBPS3和NMGBPS4作為用于診斷或疫苗制劑的試劑的組分，所述疫苗制劑具有針對(duì)腦膜炎球菌病或者由奈瑟氏球菌屬(^e/^er/a)的成員或由任何其他細(xì)菌、病毒或寄生蟲(chóng)引起的任何感染的治療或預(yù)防特性。本發(fā)明的創(chuàng)新在于第一次描述了肽NMGBPS1、NMGBPS2、NMGBPS3和NMGBPS4作為存在于腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的莢膜多糖中的表位的分子模擬表位，其能夠誘導(dǎo)針對(duì)該血清群的腦膜炎球菌菌林的殺菌性抗體的產(chǎn)生。所述肽可用作試劑以用于診斷和/或用在疫苗制劑中，以便治療或預(yù)防由奈瑟氏球菌屬的成員或其他細(xì)菌、病毒或寄生蟲(chóng)引起的疾病。在本發(fā)明中，使用單字母代碼(例如A-丙氨酸、W-色氨酸、S-絲氨酸、E-谷氨酸、Y-酪氨酸、K-賴氨酸、F-苯丙氨酸、I-異亮氨酸、V-纈氨酸、P-脯氨酸等)來(lái)表示氨基酸。附圖簡(jiǎn)述圖1.將在使用抗多糖B單克隆抗體淘選噬菌體展示肽文庫(kù)后選擇出的噬菌體施加于硝酸纖維素膜上，并且使其與選擇抗體(selectorantibody)反應(yīng)。每個(gè)點(diǎn)相應(yīng)于30pg的選擇出的獨(dú)個(gè)謹(jǐn)菌體克隆。將對(duì)照噬菌體施加于位置G5和15。圖2.在三輪文庫(kù)淘選后吸附至選擇抗體的噬菌體的ELISA反應(yīng)性的評(píng)估。獨(dú)個(gè)地純化噬菌體，并將其用于包被ELISA平板。該圖顯示了13個(gè)經(jīng)評(píng)估的噬菌體在492nm處的ELISA吸光度(A492nm)。圖3.在兩輪文庫(kù)淘選后吸附至選擇抗體的噬菌體的ELISA反應(yīng)性的評(píng)估。獨(dú)個(gè)地純化謹(jǐn)菌體，并將其用于包被ELISA平板。該圖顯示了16個(gè)經(jīng)評(píng)估的噬菌體在492nm處的ELISA吸光度(A492nm)。圖4.按照實(shí)施例9中的解釋，使用3個(gè)ELISA系統(tǒng)(常規(guī)ELISA、夾心ELISA和抑制ELISA)進(jìn)行的噬菌體的反應(yīng)性的評(píng)估，所述噬菌體在它們的表面上展示通過(guò)用抗多糖B單克隆抗體淘選噬菌體展示肽文庫(kù)而選擇出的肽。圖5.通過(guò)ELISA評(píng)估的在使用在絲狀噬菌體中展示的肽NMGBPS1-NMGBPS4免疫接種Balb/c小鼠后誘導(dǎo)的IgG抗體的水平。該圖顯示了對(duì)于用每種所述噬菌體免疫接種的組，與相應(yīng)的在免疫接種前收集的免疫前血清相比，在三次劑量后收集的免疫血清中檢測(cè)到的特異性抗體的增加。圖6.在纖維素膜上合成的肽片段，其用于確定由抗多糖B單克隆抗體和經(jīng)誘導(dǎo)的針對(duì)肽NMGBPS1的鼠類血清所識(shí)別的表位。圖7.抗多糖B單克隆抗體(左圖)和經(jīng)誘導(dǎo)的針對(duì)肽NMGBPS1的鼠類血清(右圖)與來(lái)源于肽NMGBPS1的肽片段的集合物(collection)的反應(yīng)性。所述肽片段的集合物的設(shè)計(jì)顯示于圖6中。圖8.在針上合成的肽的集合物，其來(lái)源于引入肽NMGBPS1中的修飾，所述修飾由下列組成a)在各位置處，在位置7和8處用Ala同時(shí)置換Pro,和b)在結(jié)合抗多糖B單克隆抗體的序列中引入1至3個(gè)點(diǎn)置換。肽1相應(yīng)于NMGBPS1的序列。圖9.圖8中顯示的在針上合成的肽的集合物與抗多糖B單克隆抗體的反應(yīng)性。肽的編號(hào)與圖8中所示的列表中的一樣。條塊l顯示了與肽NMGBPS1的反應(yīng)性。圖10.來(lái)源于NMGBPS1的序列的肽與抗多糖B單克隆抗體的反應(yīng)性。各肽的置換如下用A置換V12(肽5)、用S置換V12(肽11)、用E置換V12(肽12)、用A置換V9(肽16)、用E置換Yu(肽14)、用I置換Yn(肽2)。在每種情況下，P7和Ps在各位置處同時(shí)被A置換。肽的編號(hào)與圖8中所示的列表中的一樣。條塊1(肽7)顯示了P7和Ps在各位置處同時(shí)被A置換的肽NMGBPS1的反應(yīng)性。圖11.抗多糖B單克隆抗體與基于序列NMGBPS1的肽的反應(yīng)性，其中圖8中的殘基Eu和另外的殘基被置換。在所有情況下，P,和P8在各位置處同時(shí)被A置換。肽的編號(hào)相應(yīng)于圖8中所示的列表。條塊1(肽7)顯示了P7和Ps在各位置處同時(shí)被A置換的肽NMGBPS1的反應(yīng)性。圖12.在針上合成的肽的集合物，其來(lái)源于引入肽NMGBPS1中的修飾，所述修飾由下列組成a)用A12、Su和Eu置換V12，和b)用A7置換P或用As置換Ps。肽1相應(yīng)于NMGBPS1的序列。圖13.圖12中顯示的在針上合成的肽的集合物與抗多糖B單克隆抗體的反應(yīng)性。圖14.抗多糖B單克隆抗體與基于序列NMGBPS1的肽(條塊l)的反應(yīng)性，在所述肽中引入下列修飾1)用F,。置換Wm和2)用A7置換P,或用As置換Ps。該圖還顯示了各個(gè)肽的序列。圖15.抗多糖B單克隆抗體與腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的莢膜多糖的結(jié)合的抑制，所述抑制通過(guò)使用下列物質(zhì)作為配體來(lái)進(jìn)行a)以串聯(lián)方式包含3個(gè)拷貝的最小序列的肽，所述最小序列對(duì)于肽NMGBPS1與抗多糖B單克隆抗體的結(jié)合來(lái)說(shuō)是必需的，b)肽NMGBPS1,和c)對(duì)照肽。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳述實(shí)施例1.使用抗腦膜炎奈瑟氏球菌的多糖B的單克隆抗體來(lái)淘選在噬菌體上展示的肽文庫(kù)為了選擇在本發(fā)明中描述的肽，構(gòu)建在絲狀噬菌體的P8區(qū)域中表達(dá)的15個(gè)氨基酸殘基的線性隨機(jī)肽文庫(kù)。使用不識(shí)別人組織的、具有針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的殺菌活性的鼠類單克隆抗體作為選擇性分子來(lái)淘選所述文庫(kù)(PonR.A.等人，1997.N-propionylatedgroupBmeningococcalpolysaccharidemimicsaunique6a"er/c油7capsw/arep/帥e//7-gr卯/A^e/sser/a應(yīng)s.J.Exp.Med.185:1929-1938)?；旧先缥墨I(xiàn)(SmithG.P.等人，1993."6rar/e"/卿〃desprofe//^(//》7a/ef/o/7/7/豬e/^ows;力age.MethodsEnzymol.217:228-257)中所描述的，循環(huán)進(jìn)行文庫(kù)的淘選，除了將抗體直接用于包被固體支持物外。在噬菌體和單克隆抗體反應(yīng)后，收集和滴定未吸附至抗體的噬菌體級(jí)分(級(jí)分Nl)。此外，收集吸附至抗體的噬菌體級(jí)分(級(jí)分Al)，并測(cè)定噬菌體的滴度。計(jì)算滴度N1/滴度A1比率。擴(kuò)增級(jí)分A1并允許其與抗多糖B單克隆抗體反應(yīng)，并且再次收集和滴定吸附至抗體和未吸附至抗體的噬菌體級(jí)分。重復(fù)這些循環(huán)直至滴度N/滴度A比率低于103。進(jìn)行四輪淘選。表1顯示了在各輪淘選后在滴定所收集的級(jí)分A和N后獲得的值。該表還顯示了在進(jìn)行擴(kuò)增和純化以用于隨后的輪次后，在各輪淘選中獲得的級(jí)分A的滴度。表l.各輪淘選后獲得的滴度，其表示為級(jí)分A和N的氨千青霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)單元(TransductionUnit)(TU/mU;以及相應(yīng)的滴度比率N/A。Aamp:經(jīng)擴(kuò)增和純化的級(jí)分A。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>將在4輪文庫(kù)淘選后吸附至選擇抗體的噬菌體用于感染大腸桿菌XL-1blue細(xì)胞，將幾個(gè)稀釋物倒在包含培養(yǎng)基2XYT的瓊脂平板上。選擇獨(dú)個(gè)噬菌體并且在液體培養(yǎng)中進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)使用聚乙二醇進(jìn)行沉淀來(lái)純化噬菌體。實(shí)施例2.選擇抗體與在4輪文庫(kù)淘選后選擇出的噬菌體的反應(yīng)。將純化的噬菌體(30網(wǎng))施加至硝酸纖維素膜上。還施加等量的對(duì)照噬菌體。在用脫脂牛奶封閉后，將膜與抗多糖B單克隆抗體一起溫育。通過(guò)與綴合至辣根過(guò)氧化物酶的特異性地識(shí)別小鼠IgG的抗體以及包含H202和生色團(tuán)二氨基聯(lián)苯胺的溶液一起溫育來(lái)檢測(cè)反應(yīng)性。圖1顯示了結(jié)果。選擇出相應(yīng)于具有更大強(qiáng)度的點(diǎn)的25個(gè)噬菌體以用于進(jìn)一步的工作。實(shí)施例3.在用抗多糖B單克隆抗體進(jìn)行4輪文庫(kù)淘選后選擇出的噬菌體的DNA的純化和測(cè)序。純化25個(gè)在免疫鑒定實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性的噬菌體的DM,并且測(cè)定核苷酸序列。如先前所述，進(jìn)行噬菌體DNA的純化(SambrookJ.等人，1989.MolecularCloning,aLaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,USA)。使用自動(dòng)測(cè)序儀ALFexpressII(TermoSequenaseCyTM5DyeTerminadorKit,AmershamBiosciences)，通過(guò)使用M13/pUC測(cè)序引物(-47)#1224，NewEnglandBiolabsInc.,USA)和M13/pUC反向測(cè)序引物(-48)#1233，NewEnglandBiolabsInc.,USA)這些寡核苷酸對(duì)病毒DNA進(jìn)行測(cè)序。如序列表中所示，所有克隆具有相同的序列(SEQIDNO:1)。相應(yīng)于該DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列的肽顯示于序列表中(SEQIDNO:5)。實(shí)施例4.在使用抗多糖B單克隆抗體進(jìn)行4輪文庫(kù)淘選后選擇出的噬菌體中所展示的肽序列的表征。為了分析在4輪文庫(kù)淘選后選擇出的在噬菌體中展示的序列，將其與先前報(bào)道的腦膜炎奈瑟氏球菌多糖B的模擬結(jié)構(gòu)的其他序列邁油帥es.Infect.Immun.69:3335-3342;ParkI.等人，2004.ca/75^/ar/70//i^cc力a"Ve.YonseiMedicalJournal.45:755-758;MoeG.R.等人，1999.#o/ecw/ar歷/邁e〃cso/p0/7sacc力ar/dee//fopesasFacc/z/eca/3d/cf"es尸orpre7e/7〃0/7o/*iYe/5^er/a邁6/7//2^/^/^//夕serogro^p_gt//sease.FEMSImmunol.Med.Microbiol.26:209—269;MoeG.R和GranoffD.M.2001.￥o7eci//ar邁/zz7e"'"。/iVe/5^er/a/ge/7j./^7.〃^.s^e/"。^Tow/7/70//i^cc力3r2.de.Int.Rev.Immunol.20:201-20;GranoffD.M.和MoeG.R.2003.5ep〃o;es.USP6,642,354B2)進(jìn)行比對(duì)，在任何情況下，都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相似性百分比大于29%。使用軟件ClustalW來(lái)進(jìn)行比對(duì)(ThompsonJ.D.等人，1994.a^ST"於/.范;77^W/^Me5"e/2s/fi>/^/o尸pro^Tess/ye/z/i//f///esegweiJceaZ/g/2邁e/^f力rowg力/Z7afr/;rc力o/ce.NucleicAcidsRes.22:4673—80)。還通過(guò)使用軟件BLASTP2.2.10在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索來(lái)表征所述序列(AltschulS.F.等人1997.^/7/7ed見(jiàn)^5Ts/dNucleicAcidsRes.25:3389-3402)。該搜索限定于包含在數(shù)據(jù)庫(kù)SwissProt(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的細(xì)菌基因和蛋白質(zhì)的序歹'J。這一過(guò)程的結(jié)果表明，肽NMGBPS1與儲(chǔ)存在這些數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列的相似性百分比不大于30%。實(shí)施例5.選擇抗體與在第三輪文庫(kù)淘選后選擇出的噬菌體的反應(yīng)性。為了鑒定腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的莢膜多糖的其他模擬結(jié)構(gòu)，通過(guò)ELISA來(lái)評(píng)估在第三輪文庫(kù)淘選后吸附至抗多糖B抗體的噬菌體。獨(dú)個(gè)地純化噬菌體并將其用于包被ELISA平板。在該實(shí)驗(yàn)中還包括對(duì)照噬菌體和展示出肽NMGBPS1的噬菌體。在使用脫脂牛奶封閉后，將平板與抗多糖B單克隆抗體一起溫育。在與綴合至辣根過(guò)氧化物酶的對(duì)于小鼠IgG特異的抗體以及包含H202和生色團(tuán)鄰苯二胺(OPD)的溶液一起溫育后，揭示出反應(yīng)性。使用2.5N硫酸來(lái)終止反應(yīng)，并在ELISA平板閱讀器中讀取A"^。圖2顯示了對(duì)于幾個(gè)純化的噬菌體而獲得的結(jié)果。選擇ELISA信號(hào)的強(qiáng)度比對(duì)照噬菌體更大的20個(gè)噬菌體以進(jìn)行進(jìn)一步的工作。實(shí)施例6.在用抗多糖B單克隆抗體進(jìn)行的第三輪文庫(kù)淘選后選擇出的謹(jǐn)菌體的DNA的純化和測(cè)序。根據(jù)與實(shí)施例3中描述的相同的程序，對(duì)20個(gè)在通過(guò)ELISA進(jìn)行的免疫鑒定實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性的噬菌體的DM進(jìn)行純化和測(cè)序。所有的克隆具有與在第四輪文庫(kù)淘選后分離的噬菌體的序列相同的序列。該序列顯示于序列表的SEQIDNO:l中。相應(yīng)于該DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列的氨基酸序列顯示于序列表的SEQIDNO:5中。實(shí)施例7.選擇抗體與在第二輪文庫(kù)淘選后選擇出的噬菌體的反應(yīng)性。為了繼續(xù)搜索腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的莢膜多糖的其他模擬結(jié)構(gòu)，通過(guò)ELISA來(lái)評(píng)估在第二輪文庫(kù)淘選后吸附至抗多糖B抗體的噬菌體。獨(dú)個(gè)地純化噬菌體并將其用于包被ELISA平板。在該實(shí)驗(yàn)中還包括對(duì)照噬菌體和展示出肽NMGBPS1的噬菌體。在使用脫脂牛奶封閉后，將平板與抗多糖B單克隆抗體一起溫育。在與綴合至辣根過(guò)氧化物酶的對(duì)于小鼠IgG特異的抗體以及包含H202和生色團(tuán)鄰苯二胺(OPD)的溶液一起溫育后，揭示出反應(yīng)性。使用2.5N硫酸來(lái)終止反應(yīng)，并在ELISA平板閱讀器中讀取Aw^。圖3顯示了對(duì)于幾個(gè)純化的噬菌體而獲得的結(jié)果。選擇ELISA信號(hào)的強(qiáng)度比對(duì)照噬菌體更大的15個(gè)噬菌體以進(jìn)行進(jìn)一步的工作。圖8.在用抗多糖B單克隆抗體進(jìn)行的第二輪文庫(kù)淘選后選擇出的噬菌體的DNA的純化和測(cè)序。根據(jù)與實(shí)施例3中描述的相同的程序，對(duì)15個(gè)在免疫鑒定實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性的噬菌體的DNA進(jìn)行純化和測(cè)序。鑒定出了總共5個(gè)獨(dú)特的序列。表2概述了在噬菌體中展示的每一個(gè)序列的出現(xiàn)頻率。序列l(wèi)相應(yīng)于肽NMGBPS1。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例9.展示于通過(guò)文庫(kù)淘選而選擇出的噬菌體上的肽的反應(yīng)性的ELISA表征。純化表達(dá)在實(shí)施例8中鑒定的獨(dú)特序列中的每一個(gè)序列的謹(jǐn)菌體，并研究它們與抗多糖B單克隆抗體的反應(yīng)性。進(jìn)行3個(gè)BLISA實(shí)驗(yàn)1)常規(guī)ELISA，其中將噬菌體直接施加至聚丙烯平板上，然后加入抗多糖B單克隆抗體，最后加入對(duì)小鼠IgG特異的免疫球蛋白；2)夾心ELISA，其中將抗多糖B單克隆抗體直接施加至ELISA平板上，然后加入噬菌體，隨后加入在兔子中獲得的抗野生型M13-噬菌體血清，最后加入對(duì)兔IgG特異的免疫球蛋白；3)抑制ELISA,其中用從細(xì)菌中純化出的多糖B的溶液包被平板，并加入抗多糖B單克隆抗體與噬菌體的混合物，最后加入對(duì)小鼠IgG特異的免疫球蛋白。在所有情況下，將在最終加入的免疫球蛋白綴合至辣根過(guò)氧化物酶，并使用包含11202和生色團(tuán)鄰苯二胺(OPD)的溶液來(lái)揭示反應(yīng)性。使用2.5N疏酸來(lái)終止反應(yīng)，并在ELISA平板閱讀器中讀取A,9h。圖4顯示了所獲得的結(jié)果。表達(dá)表2中所顯示的獨(dú)特序列2、3和5的噬菌體克隆在3個(gè)ELISA中的表現(xiàn)與肽NMGBPS1類似，然而表達(dá)表2中所顯示的獨(dú)特序列4的噬菌體在3個(gè)ELISA中的表現(xiàn)與對(duì)照噬菌體類似。被選擇用于進(jìn)一步工作的肽2、3和5分別重新命名為腦BPS2、腦BPS3和NMGBPS4。相應(yīng)于NMGBPS2、NMGBPS3和NMGBPS4的DNA序列顯示于序列表中(分別為SEQIDNO:2、3和4)。相應(yīng)于這些DM序列翻譯成蛋白質(zhì)序列的肽顯示于序列表中(分別為SEQIDNO:6、7和8)。表2顯示了鑒定出的噬菌體與序列標(biāo)識(shí)號(hào)之間的對(duì)應(yīng)。實(shí)施例10.在用抗多糖B單克隆抗體進(jìn)行的第二輪文庫(kù)淘選后選擇出的噬菌體中表達(dá)的肽序列的表征。為了分析在第二輪文庫(kù)淘選后選擇出的噬菌體中展示的序列，將其與在出版物中報(bào)導(dǎo)的腦膜炎奈瑟氏球菌多糖B的模擬結(jié)構(gòu)的其他序歹寸(ShinJ.S.等人，2001.Vo刀oc7o/7a7a/7"6od/e51s/7ec/Z7c/z/2'/z^。拜.Infect.Immun.69:3335-3342;ParkI.等人，2004.ca;7S^/ar/o/j^acc力ar/de.YonseiMedicalJournal.45:755-758;MoeG.R.等人，1999.歷/i!!7e〃cs/o7/5^cc力aWdee;y,o/e51asp^c"'/eca;2(l/(/a/or/7re7e/2〃0/7o尸AWsser/a/Z7e"i.力^7〃c^sero》ro";7Wsease.FEMSImmunol.Med.Microbiol.26:209-269'，MoeG.R和GranoffD.M.2001.#o/ecu/ar/z7/.zz7e〃"o尸iVe/^er/a/zye/72./ff"油'sserogro";5po7ysacc/ar/de.Int.Rev.Immunol.20:201-20;GranoffD.M.和MoeG.R.2003.^e;7〃0pes.USP6,642,354B2)進(jìn)行比對(duì)，在任何情況下，對(duì)于肽NMGBPS2沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相似性百分比大于30%,對(duì)于肽NMGBPS3沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相似性百分比大于33%,和對(duì)于肽NMGBPS4沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相似性百分比大于40%。使用ClustalW程序來(lái)進(jìn)行比對(duì)(ThompsonJ.D.等人，1994.CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsRes.22:4673-80)。還通過(guò)使用軟件BLASTP2.2.10在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索來(lái)表征所述序列(AltschulS.F.等人1997.&/7/7ecTWASTa/dNucleicAcidsRes.25:3389-3402)。該搜索限定于包含在數(shù)據(jù)庫(kù)SwissProt(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的細(xì)菌基因和蛋白質(zhì)的序列。這一過(guò)禾呈的結(jié)果表明，對(duì)于肽NMGBPS2和4,針對(duì)在這些數(shù)據(jù)庫(kù)中儲(chǔ)存的序列而檢測(cè)到的相似性百分比低于30%,和對(duì)于肽NMGBPS3低于35%。實(shí)施例11.使用在其表面上展示出肽NMGBPS1-NMGBPS4的噬菌體，通過(guò)腹膜內(nèi)途徑來(lái)免疫接種Balb/c小鼠。為了評(píng)估肽NMGBPS1-NMGBPS4的免疫原性，在Balb/c小鼠中進(jìn)行免疫接種方案，其中用展示所述肽的噬菌體直接接種動(dòng)物。按照由delaCruz及合作者(delaCruzF.V.等人，1988.7/ZM//7c>《e/3/c//7s/d/77a歷e/^oM/7力age.J.Biol.Chem.25:4318—4322)4葛述的對(duì)于純化操作程序1(LinT.C.等人，1980./i^"〃o/s刀dc力aracfer/zaf/o力o,f力eC3/7^"/7rofe//7^coded67《e/es/dge/7eK/"f力e/7/a/Z7e/7"i/516a"eWo/7力age/7a/7d/V.J.Biol.Chem.255:10331-10337)的改進(jìn)，通過(guò)氯化銫梯度來(lái)純化噬菌體。用每種噬菌體免疫接種7只Balb/c小鼠(H-2d雌性，7-8周齡)的組。每只小鼠在每次接種中接受IO"個(gè)病毒顆粒。在每一次用綴合至人血清白蛋白(HSA)的、N-丙酰化的腦膜炎奈瑟氏球菌多糖B(pPSC-B)(pPSC-B/HSA)進(jìn)行的接種中，以5ug/小鼠免疫接種另一組小鼠(JenningsH.J.等人，1986.//2dwc〃0/7o尸/z7e/7/'/7gcicc7cca/Mcc//2e.JImmunol137:1708-1713)。通過(guò)腹膜內(nèi)途徑進(jìn)4亍3次免疫接種，其中間隔15天。在第一劑中使用完全弗氏佐劑來(lái)乳化所有免疫原，在相繼的劑中使用不完全弗氏佐劑來(lái)進(jìn)行乳化。表3描述了各組所接受的免疫原。表3.用于肽的免疫學(xué)評(píng)估的小鼠和免疫原的組，所述肽是通過(guò)使用抗多糖B單克隆抗體淘選展示在噬菌體上的肽文庫(kù)而選擇出來(lái)的。組免疫原1謹(jǐn)菌體NMGBPS12嗟菌體NMGBPS23謹(jǐn)菌體NMGBPS34謹(jǐn)菌體NMGBPS45對(duì)照噬菌體6pPSC-B/HSA實(shí)施例12.肽NMGBPS1-薩BPS4的免疫原性的ELISA評(píng)估。通過(guò)ELISA來(lái)評(píng)估由在絲狀噬菌體中展示的肽NMGBPS1-NMGBPS4所誘導(dǎo)的抗體(IgG)的水平。通過(guò)使用具有經(jīng)鑒定的肽的序列的合成肽作為用于包被ELISA平板的抗原，來(lái)評(píng)估在第三次接種后獲得的動(dòng)物的血清。圖5顯示了，在3次免疫接種后，針對(duì)展示于噬菌體上的肽的特異性IgG抗體的水平顯著增加。為了進(jìn)行所述結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用通過(guò)Kruska1-Wallis等級(jí)進(jìn)行的簡(jiǎn)單分類的方差分析的非參數(shù)方法，因?yàn)楦鶕?jù)Bartlett檢驗(yàn)，組間的方差不是同質(zhì)的。為了進(jìn)行非參數(shù)多重比較，使用Dunns檢驗(yàn)。實(shí)施例13.由肽誘導(dǎo)的抗體的血清殺菌活性的評(píng)估，所迷肽是通過(guò)使用抗多糖B單克隆抗體淘選展示在噬菌體上的肽文庫(kù)而選擇出來(lái)的。通過(guò)血清殺菌活性測(cè)定法來(lái)評(píng)估來(lái)自用各免疫原接種的每組小鼠的血清的混合物。Ashton及合作者所使用的測(cè)定法(AshtonF.E.等人，1989.戶rc^ec〃ree/77cac/C邁卯seser咖fof力ejV-z^to;////der/r<2/7</^row/^/o7/5^cc力siV'f/e.Microb.Pathog.6:455-458)適用于評(píng)估針對(duì)腦膜炎球菌多糖B的抗體，但其中并不使用這些研究者所推薦的緩沖溶液，而使用補(bǔ)充有BSA的Veronal溶液。當(dāng)評(píng)估針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的莢膜的抗體時(shí)，推薦該溶液用于增加殺菌活性測(cè)定法的靈敏度(MandrellR.E.等人，1995.Co/z^/effle/^ie^//""6a"er/c/da/ac"V"yo尸a/^/^od/estopo//a/p力a2一->《y—aceO^/2ei/ra邁2'/2/cac/《t力eca/5^/ar;70/7^acc力ar/fl^c/邁e/z/./7^^cocca/^ro://7及J.Infect.Dis.172:1279-1289)。將血清學(xué)分類B:4:Pl.19，15的腦膜炎奈瑟氏球菌菌林CU385用于該測(cè)定法。殺菌抗體的滴度表示為與對(duì)照相比能夠殺死至少50。/。的細(xì)菌的所評(píng)估抗體的更大稀釋度的倒數(shù)。表4顯示了結(jié)果。表4.評(píng)估在用展示出肽的噬菌體進(jìn)行免疫接種的小鼠血清中的殺菌活性，所述肽是通過(guò)用抗多糖B單克隆抗體淘選肽文庫(kù)而選擇出的。針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群菌抹CU385，來(lái)評(píng)估來(lái)自用各免疫原接種的小鼠的血清混合物。SBT:血清殺菌滴度。NT:無(wú)滴度。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例14.由抗多糖B單克隆抗體和由鼠類血清所識(shí)別的肽區(qū)域的作圖。為了研究由抗多糖B單克隆抗體和由用展示這些肽的絲狀噬菌體免疫接種的小鼠血清所識(shí)別的肽NMGBPS1-4的區(qū)域，在纖維素膜上合成重疊有4個(gè)殘基且覆蓋肽NMGBPS1-4的整個(gè)序列的五殘基肽片段的集合物，還合成了包含下列連續(xù)氨基酸殘基缺失的這些肽的片段1)從氨基末端；2)從羧基末端；和3)同時(shí)從兩個(gè)末端。圖6顯示了合成的肽片段的設(shè)計(jì)，其用于肽NMGBPS1的區(qū)域的作圖。圖7(左圖)顯示了當(dāng)將纖維素膜與抗多糖B單克隆抗體一起溫育時(shí)獲得的結(jié)果。在五氨基酸殘基肽中，識(shí)別出具有序列VWYVE和WYVEG的那些。該結(jié)果和使用其余的肽所獲得的反應(yīng)性模式的分析允許得出結(jié)論在肽NMGBPS1內(nèi)的對(duì)于抗多糖B單克隆抗體的結(jié)合而言所必需的最小序列是四肽WYVE。圖7(右圖)顯示了，將在紙上合成的肽集合物與用在絲狀噬菌體上展示的肽NMGBPS1免疫接種的小鼠血清混合物進(jìn)行溫育使得能夠識(shí)別具有序列WYVEG的肽片段，這與對(duì)于單克隆抗體所獲得的結(jié)果一致。該血清混合物還識(shí)別相應(yīng)于具有序列RPPVW和PPVWY的肽片段的點(diǎn)，這表明在肽NMGBPS1中第二表位的形成能夠誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生。根據(jù)肽NMGBPS1的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，得出這樣的結(jié)論，即對(duì)于該第二表位的形成，兩個(gè)P的存在是極其重要的，因?yàn)樗鼈儗⑥D(zhuǎn)角引入該肽的結(jié)構(gòu)中，這有利于將肽的該區(qū)域呈遞給免疫系統(tǒng)。實(shí)施例15.通過(guò)對(duì)肽NMGBPS1-4進(jìn)行點(diǎn)突變而衍生出的肽集合物的合成，和所述肽與抗多糖B單克隆抗體的反應(yīng)性。通過(guò)考慮來(lái)自根據(jù)實(shí)施例14實(shí)施的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們考慮進(jìn)行肽NMGBPS1-4的變體的搜索，所述變體1)除了結(jié)合抗多糖B單克隆抗體的區(qū)域外不包含任何額外的區(qū)域，其具有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力；和/或2)具有更大的與抗多糖B單克隆抗體的親和力。為了獲得這一點(diǎn)，我們選擇了肽集合物的合成方法，在所述肽集合物中，將肽的各個(gè)P(位點(diǎn)7和8)用A進(jìn)行置換，并將1至3個(gè)點(diǎn)變化(相對(duì)于原始氨基酸)引入相應(yīng)于對(duì)于結(jié)合抗多糖B單克隆抗體所必需的序列的位置中。另外，通過(guò)考慮在電荷、疏水性和親水性、極性、結(jié)構(gòu)同源性和氨基酸側(cè)鏈的體積方面的相似性來(lái)改變?cè)及被?。此外，還合成了其中在各位置處引入一個(gè)A的肽。圖8顯示了合成的肽集合物，其用于肽NMGBPS1的優(yōu)化。肽l相應(yīng)于NMGBPS1序列。在所有肽中，在7和8這兩個(gè)位置處用Ala同時(shí)置換位置7和8處的Pro。在相應(yīng)于對(duì)于結(jié)合抗多糖B單克隆抗體所必需的氨基酸的位置中，通過(guò)考慮在之前段落中解釋的標(biāo)準(zhǔn)，引入1至3個(gè)點(diǎn)改變。圖9顯示了圖8中所示肽集合物與抗多糖B單克隆抗體的反應(yīng)性。A7對(duì)P7和As對(duì)Ps的同時(shí)置換(肽7，圖9)減少了肽NMGBPS1(肽l,圖9)與抗多糖B抗體的結(jié)合的親和力?？紤]到這一點(diǎn)，在抗多糖B單克隆抗體與其他合成肽的反應(yīng)性的分析中，選擇保留了對(duì)于結(jié)合單克隆抗體所必需的完整表位、但在位置7和8的每個(gè)處具有Ala的肽作為陽(yáng)性對(duì)照(肽7，圖9)。這允許我們鑒定出位置12(該位置在原始肽中為V)作為用于引入變化的有利位置。例如，與陽(yáng)性對(duì)照(肽7，圖10)相比，Au對(duì)Vu的置換(肽5，圖IO)增加了與單克隆抗體的親和力，然而與陽(yáng)性對(duì)照(肽7，圖10)相比，Su對(duì)Vu的置換(肽ll，圖IO)或Eu對(duì)Vu的置換(肽12，圖10)產(chǎn)生了保留超過(guò)85%的與單克隆抗體的反應(yīng)性。在其中用A9置換V9(肽16，圖IO)和用Eu置換Yn(肽14，圖10)或/和用Iu置換Yu(肽2，圖IO)的肽中，與陽(yáng)性對(duì)照相比，保留了超過(guò)75%的與抗多糖B單克隆抗體的反應(yīng)性(肽7，圖IO)。其他位置處的變化使肽與單克隆抗體的反應(yīng)性降至低于相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照的75%。相應(yīng)于在圖8中顯示為2、5、7、11、12、14和16的肽的序列以Seq.IDNo.9、Seq.IDNo.10、Seq.IDNo.11、Seq.IDNo.12、Seq.IDNo.13、Seq.IDNo.14和Seq.IDNo.15顯示于序列表中。圖11顯示了具有在位置13處進(jìn)行了置換的肽。應(yīng)當(dāng)注意，該位置(在原始的肽中為E)不利于突變的引入，因?yàn)橹脫Q該氨基酸將導(dǎo)致與單克隆抗體的反應(yīng)性相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照(肽7,圖ll)的反應(yīng)性而言非常低。當(dāng)改變氨基酸13時(shí)，其他氨基酸位置處的其他變化的引入不提高與抗體的反應(yīng)性。因此，存在于該肽序列中的谷氨酸對(duì)于識(shí)別是必需的?？紤]到前述結(jié)果，合成了新的肽集合物，其中用A只置換兩個(gè)P中的一個(gè)，并且只考慮了在與抗多糖B抗體結(jié)合的序列中的置換，其與陽(yáng)性對(duì)照肽相比保持了超過(guò)85。/。的與抗多糖B抗體的反應(yīng)性。圖12顯示了第二肽集合物，其被合成用于繼續(xù)肽NMGBPS1的序列的優(yōu)化。序列1相應(yīng)于肽NMGBPS1。我們合成了其中用于結(jié)合抗多糖B抗體的序列只包含下述變化的肽Au對(duì)Vu的置換、Su對(duì)Vu的置換和Eu對(duì)L的置換以及包含A對(duì)一些P的置換。作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照，合成了包含原始肽的所有P或包含所有同時(shí)被A置換的P的相似的肽。圖13顯示了圖12中所述的肽集合物與抗多糖B單克隆抗體的反應(yīng)性。當(dāng)結(jié)合抗多糖B抗體的表位保持完整時(shí)，A7對(duì)P7的置換允許恢復(fù)97。/。的與抗體的反應(yīng)性，并且當(dāng)引入額外的Au對(duì)Vu的置換時(shí)，與肽NMGBPS1相比恢復(fù)了8U的反應(yīng)性。相應(yīng)于在圖8中顯示為2-12的肽的序列以Seq.IDNo.16、Seq.IDNo.17、Seq.IDNo.18、Seq.IDNo.19、Seq.IDNo.20、Seq.IDNo.21、Seq.IDNo.22、Seq.IDNo.23、Seq.IDNo.24、Seq.IDNo.25和Seq.IDNo.26顯示于序列表中。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，評(píng)估了其中用F置換氨基酸W的肽的反應(yīng)性。圖14顯示了抗多糖B單克隆抗體與源自NMGBPS1的肽(其中，引入了F!。對(duì)W!。的置換，以及A7對(duì)P7或As對(duì)Ps的額外置換)的反應(yīng)性。圖10顯示了所述合成肽的序列。與肽NMGBPS1相比，在其中同時(shí)引入A7對(duì)P7和F,。對(duì)l。的置換的肽(肽2，圖14)中保留了86。/。的與抗體的反應(yīng)性。相應(yīng)于在圖14中在條塊2、3和4的底部中所顯示的肽的序列以Seq.IDNo.27、Seq.IDNo.28和Seq.IDNo.29顯示于序列表中。實(shí)施例16.肽的合成，所述肽包含幾個(gè)拷貝的對(duì)于抗多糖B單克隆體與肽NMGBPS1-4結(jié)合而言所必需的最小序列。被建議用于確定具有更大的與抗多糖B單克隆抗體的親和力的肽的其他策略是合成這樣的肽，所述肽以串聯(lián)的方式包含幾個(gè)拷貝的對(duì)于抗多糖B單克隆抗體與肽NMGBPS1-4結(jié)合而言所必需的最小序列。另外地，該策略將免疫應(yīng)答限定于只針對(duì)在肽NMGBPS1—4中對(duì)于結(jié)合抗多糖B單克隆抗體所必需的區(qū)域。與原始的肽相比，就抑制抗多糖B單克隆抗體與腦膜炎球菌多糖B的結(jié)合方面，通過(guò)ELISA來(lái)評(píng)估所述合成肽。用細(xì)菌多糖B的溶液包被聚苯乙烯平板。向ELISA平板中加入固定濃度(5ug/ml)的抗多糖B單克隆抗體與不同濃度的肽的混合物。然后，加入綴合至辣根過(guò)氧化物酶的對(duì)于小鼠IgG特異的免疫球蛋白，并用包含11202和生色團(tuán)鄰苯二胺(0PD)的溶液來(lái)揭示反應(yīng)性。使用2.5N硫酸來(lái)終止反應(yīng)，并在ELISA平板閱讀器中讀取A圖15顯示了用所述合成的肽(其包含3個(gè)拷貝的對(duì)于抗多糖B單克隆抗體與肽NMGBPS1結(jié)合而言所必需的最小序列)獲得的結(jié)果。該肽能夠比肽NMGBPS1更有效地抑制抗多糖B單克隆抗體與多糖B的結(jié)合。權(quán)利要求1.命名為NMGBPS1-25的肽，其特征在于，其是能夠在受者生物體中產(chǎn)生針對(duì)糖的免疫應(yīng)答的抗原，并且具有在序列表中Seq.IDNo.5-Seq.IDNo.29所示的氨基酸序列，所述糖具有通過(guò)(α2-8)鍵連接的、N-取代的神經(jīng)氨酸重復(fù)單元的化學(xué)結(jié)構(gòu)。2.權(quán)利要求1的命名為NMGBPS1、NMGBPS2、NMGBPS3和NMGBPS4的肽，其特征在于，其由在序列表中Seq.IDNo.1、Seq.IDNo.2、Seq.IDNo.3和Seq.IDNo.4所示的稱為ADN-NMGBPS1、ADN-NMGBPS2、ADN-NMGBPS3和ADN-NMGBPS4的DNA片段編碼。3.稱為ADN-NMGBPS1、ADN-NMGBPS2、ADN-NMGBPS3和ADN-NMGBPS4的DNA片段，其特征在于，其具有在序列表中Seq.IDNo.1、Seq.IDNo.2、Seq.IDNo.3和Seq.IDNo.4所示的堿基序列，并且編碼肽NMGBPSl-4,所述肽的特征在于具有在序列表中Seq.IDNo.5、Seq.IDNo.6、Seq.IDNo.7和Seq.IDNo.8所示的氨基酸序列。4.權(quán)利要求1的命名為NMGBPS1—25的肽或其片段，其特征在于，其是能夠在受者生物體中產(chǎn)生針對(duì)糖的免疫應(yīng)答的藥物制劑的活性組分，所述糖具有通過(guò)(a2-8)鍵連接的、N-取代的神經(jīng)氨酸重復(fù)單元的化學(xué)結(jié)構(gòu)。5.權(quán)利要求4的藥物制劑，其特征在于，其包含多糖抗原。6.權(quán)利要求4和5的藥物制劑，其特征在于，所述制劑的組分之一是腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。7.權(quán)利要求4、5和6的藥物制劑，其特征在于，其包含蛋白質(zhì)-多糖綴合物。8.權(quán)利要求4、5、6和7的藥物制劑，其特征在于，其為通過(guò)腸胃外、粘膜或口服途徑施用的制劑。9.權(quán)利要求4、5、6、7和8的藥物制劑，其特征在于，其包含肽NMGBPS1-25中至少一種肽的模擬結(jié)構(gòu)或模擬表位。10.權(quán)利要求1和8的命名為NMGBPSSeq.IDNo.5-8、16-26和27-29的肽，其特征在于，脯氨酸被丙氨酸置換。11.權(quán)利要求1和9的命名為NMGBPSSeq.IDNo.7-26的肽，其特征在于，色氨酸被苯丙氨酸置換。12.權(quán)利要求1和9的命名為NMGBPSSeq.IDNo.5－6，8－29的肽，其特征在于，纈氨酸被丙氨酸置換。13.權(quán)利要求1和9的命名為NMGBPSSeq.IDNo.5－6，8－29的肽，其特征在于，纈氨酸被絲氨酸置換。14.權(quán)利要求1和9的命名為NMGBPSSeq.IDNo.5－6，8－29的肽，其特征在于，纈氨酸被谷氨酸置換。15.權(quán)利要求1和9的命名為NMGBPSSeq.IDNo.5，9－13和16-29的肽，其特征在于，酪氨酸被谷氨酸置換。16.權(quán)利要求1和9的命名為NMGBPSSeq.IDNo.5，9－13和16-29的肽，其特征在于，酪氨酸被異亮氨酸置換。17.權(quán)利要求1和9的命名為NMGBPS1-25的肽，其特征在于，所述肽序列中的任何谷氨酸對(duì)于由它們誘導(dǎo)的針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌的保護(hù)性抗體的識(shí)別來(lái)說(shuō)是必需的。18.藥物制劑，其包含權(quán)利要求4、5、6、7、8和9的至少一種肽或至少一種蛋白質(zhì)作為各種不同性質(zhì)的抗原的載體。19.權(quán)利要求1的命名為NMGBPSl-25的肽或其片段，其特征在于，其是用于診斷疾病的組分，在所述疾病中免疫應(yīng)答的靶標(biāo)是糖，所述糖具有通過(guò)(oc2-8)鍵連接的、N-取代的神經(jīng)氨酸重復(fù)單元的化學(xué)結(jié)構(gòu)。全文摘要本發(fā)明涉及制藥工業(yè)和生物技術(shù)學(xué)，特別地涉及用于針對(duì)細(xì)菌、病毒、癌癥或其他來(lái)源的疾病的疫苗抗原。本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)能夠保護(hù)或增加現(xiàn)有疫苗的保護(hù)譜并將其擴(kuò)展至抗不同病原體的制劑，其中使用由(α2-8)神經(jīng)氨酸的N-取代的重復(fù)單元形成的糖作為免疫應(yīng)答的靶標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明，分離出了幾種肽并鑒定為腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)B血清群的莢膜多糖的分子模擬物，所述莢膜多糖由(α2-8)N-乙酰基神經(jīng)氨酸的重復(fù)單元形成。在動(dòng)物生物模型中評(píng)估所述肽的免疫原性，證明了它們作為能夠誘導(dǎo)抗體的抗原的價(jià)值，所述抗體能夠特異性地識(shí)別B血清群的腦膜炎奈瑟氏球菌并顯示出抗所述細(xì)菌的殺菌活性。所得的本發(fā)明制劑可應(yīng)用于制藥工業(yè)，以作為用于人類使用的疫苗制劑。文檔編號(hào)A61K38/16GK101389643SQ200680053451公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期2006年12月28日優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日發(fā)明者E·古伊斯阿魯羅德里格斯,G·E·古伊倫尼爾托,G·奇內(nèi)亞圣地亞哥,H·E·加雷佩雷茲,N·F·圣地亞哥比斯波,O·雷伊斯阿考斯塔,T·梅南德斯麥迪納,Y·格魯斯雷阿申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心