專利名稱：一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工修飾的多肽，尤其是涉及一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白， 其為一種改變了天然鮭魚魚精蛋白氨基酸序列的多肽。
二背景技術(shù)：
魚精蛋白用作多聚陽(yáng)離子型抗菌肽和胰島素注射劑的組分，已經(jīng)長(zhǎng)期應(yīng)用 于食品防腐和臨床。魚精蛋白也被用作乳品添加劑，增加酪蛋白的耐酸性，減 少酪蛋白在酸性條件下的沉淀，同時(shí)抑制乳品中雜菌污染。具有安全、無(wú)殘留 和營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。應(yīng)用最多的是鮭魚魚精蛋白。鮭魚魚精蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌 有抑制作用，但和常用的防腐劑相比其抑制作用比較弱，特別是缺少對(duì)革蘭氏 陰性菌的抑制作用，而革蘭氏陰性細(xì)菌又是食品加工業(yè)中最需殺滅和抑制的有 害菌。酸性條件下通過(guò)添加魚精蛋白減少酪蛋白沉淀的能力較弱。
長(zhǎng)期以來(lái)試圖提高魚精蛋白抗菌活性的研究不斷，采用的方法包括添加其 它組分，結(jié)合其它組分，修飾其中的氨基酸殘基，替換其中的氨基酸殘基等。
對(duì)于抗菌肽，例如來(lái)自昆蟲、蜘蛛等動(dòng)物的抗菌肽，大都因?yàn)榭咕芰Φ?下而無(wú)法推廣使用。如何用人工的方法，特別是通過(guò)氨基酸殘基序列的改變提 高這些抗菌肽的抗菌能力是當(dāng)務(wù)之急。目前的難點(diǎn)在于無(wú)法確定抗菌肽抗菌能 力和它們的氨基酸殘基序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。如果找到或者確立天然抗菌肽的氨基酸殘基序列和它們抗菌能力關(guān)系，實(shí)際的合成，包括化學(xué)、生物合成方法 已經(jīng)不是困難的事情，例如化學(xué)合成中的固相合成，不僅做到了儀器自動(dòng)化， 手工化學(xué)合成也比較容易。通過(guò)對(duì)天然多肽，例如抗菌肽原有氨基酸殘基序列 的不斷改變并提高它們的生物活性， 一旦取得突破，隨之可以獲得用于生物合 成的新基因，如此生物合成不僅降低合成成本，而且生物和活性更強(qiáng)。
魚精蛋白歷經(jīng)幾十年臨床和食品工業(yè)使用，安全性基礎(chǔ)好，氨基酸殘基序 列長(zhǎng)度較小、其中組成的氨基酸種類較少，化學(xué)合成容易，成本低，容易應(yīng)用 推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白，其抑制革蘭氏陽(yáng)性菌 活性提高，同時(shí)具有抑制革蘭氏陰性菌能力，可以進(jìn)一步減少酸性條件下酪蛋 白沉淀。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白，其特征在于氨基酸序列為
PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR。
上述氨基酸序列合成的方法包括化學(xué)、生物從頭合成以及化學(xué)、生物法的 部分切割后獲得。
一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白，其特征在于經(jīng)修飾后的鮭魚魚精蛋白用于 增加抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的能力；用于抑制革蘭氏陰性菌；用于增加防止和減少 酸性條件下酪蛋白沉淀的能力。
上述應(yīng)用包括用作抗菌肽、防腐劑或增稠劑以及疫苗、抗體或試劑。與現(xiàn)有天然鮭魚魚精蛋白和其它魚精蛋白改造相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效 果如下
1、 本發(fā)明沒(méi)有額外添加其它物質(zhì)；
2、 本發(fā)明沒(méi)有對(duì)原有的氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾，例如添加其它化學(xué)基團(tuán)；
3、 本發(fā)明沒(méi)有改變天然魚精蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度；
4、 本發(fā)明沒(méi)有增加魚精蛋白的正凈電荷，反而減少了兩個(gè)正電荷；
5、 經(jīng)修飾后的鮭魚魚精蛋白抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的能力增加；
6、 對(duì)革蘭氏陰性菌也有抑制作用。
7、 防止和減少酸性條件下酪蛋白的沉淀的能力增加。 四

圖l為質(zhì)譜分析結(jié)果圖； 圖2為純度檢測(cè)結(jié)果圖。
五具體實(shí)施例方式
本發(fā)明替換了天然鮭魚魚精蛋白氨基酸序列中的兩個(gè)氨基酸將原來(lái)的序 列PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSR改變成為PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR。即 將原來(lái)第21、 22位的兩個(gè)精氨酸(RR)替換為兩個(gè)絲氨酸(SS)。如此修改后， 在魚精蛋白羧基末端新產(chǎn)生一個(gè)緊鄰連續(xù)精氨酸區(qū)域的絲氨酸簇。減少魚精蛋 白序列中的精氨酸殘基數(shù)量等于減少了魚精蛋白的正電荷。替換后的絲氨酸增 加了魚精蛋白的疏水性。在連續(xù)出現(xiàn)的精氨酸(精氨酸簇) 一側(cè)或兩側(cè)集中出 現(xiàn)數(shù)個(gè)絲氨酸(絲氨酸簇)的現(xiàn)象同樣存在于天然酪蛋白中。這樣的結(jié)構(gòu)被認(rèn) 為是酪蛋白攜帶鈣離子的內(nèi)在機(jī)制。也被認(rèn)為是數(shù)種酪蛋白之間形成酪蛋白膠 粒的分子基礎(chǔ)。對(duì)于多聚陽(yáng)離子抗菌肽，通常認(rèn)為增加正電荷有利于提高抗菌能力。但本發(fā)明證實(shí)，這種認(rèn)識(shí)不完全正確。革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的細(xì)胞壁結(jié) 構(gòu)不同。
本發(fā)明采用現(xiàn)有的化學(xué)固相合成法，儀器自動(dòng)合成，按照
"PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR"序列合成、純化和檢測(cè)，獲得修飾后 的鮭魚魚精蛋白。合成后的分子量和純度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。
試驗(yàn)時(shí)，用無(wú)菌蒸餾水稀釋成不同濃度的梯度；培養(yǎng)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性 菌，用作抑菌圈試驗(yàn)；購(gòu)置鮮牛奶，用檸檬酸調(diào)酸
實(shí)施例l:抑菌試驗(yàn)。
分別取3株革蘭氏陽(yáng)性菌和1株革蘭氏陰性菌的稀釋菌懸液0. 3 ml，在營(yíng) 養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中涂布成平板。在培養(yǎng)皿底面劃區(qū)備用。將蘸有不同濃 度的修飾后的鮭魚魚精蛋白溶液的濾紙片放到相應(yīng)的位置，并用鮭魚魚精蛋白 硫酸鹽做對(duì)照，用無(wú)菌水做空白對(duì)照。細(xì)菌平皿置37 。C恒溫培養(yǎng)48小時(shí)后， 觀察抑菌圈的有無(wú)與大小，測(cè)出MIC (抑菌最低濃度)。MIC越低，表示魚精蛋 白對(duì)該菌的抑菌力越強(qiáng)。(見(jiàn)表l)
表l
試驗(yàn)菌株
大腸桿菌金黃色葡萄球菌枯草桿菌四聯(lián)球菌
1000
腦
500
250
125
修飾后的鮭魚魚精蛋白 +
天然魚精蛋白 +
修飾后的鮭魚魚精蛋白 +
天然魚精蛋白 +
修飾后的鮭魚魚精蛋白 +
天然魚精蛋白 +
修飾后的鮭魚:^lWi" +
天然魚精蛋白 -
修飾后的鮭魚魚精蛋白 -
天然魚精蛋白 -
~~空白對(duì)照 -
+
+ + +
+ +
+ + + + + + +
+
+ + + +
(一szato趙資ffi鵬雜姻實(shí)施例2:減少酸性條件下酪蛋白沉淀試驗(yàn)
將IOOO ng/ml、 800 pg/ml、 500 |xg/ml、 250 ^g/ml、 125 |ag/ml五種不同 濃度梯度的修飾后的鮭魚魚精蛋白和天然鮭魚魚精蛋白硫酸鹽溶液各0.3ml添 加到35ml新鮮牛奶中，用8%檸檬酸在低于2(TC條件下調(diào)酸，査看牛奶產(chǎn)生沉 淀時(shí)的pH值，并設(shè)置一個(gè)不添加魚精蛋白的做空白對(duì)照。結(jié)果如下(見(jiàn)表2)
表2
魚精蛋白濃度1000fig/ml800 pg/ml500 )ig/ml250 (tg/ml125 pg/ml
修飾后的鮭魚魚精蛋白4.164.394.504.574.59
天然魚精蛋白4.474.514.554.594.60
空白對(duì)照4.60
氨基酸序列表
<120> Title :經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白 <130>AppFiIeReference :發(fā)明專利 <140> CurrentAppNumber : <141> CurrentFilingDate :_- —
Sequence
<213> OrganismName :人工序列 <400> PreSequenceString :
<212> Type : PRT <211>Length: 0
SequenceN咖e : Pro Arg Arg Arg Arg Ser Ser Ser Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg Pro Arg Val Ser Ser Ser Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg SequenceDescription :
權(quán)利要求
1、一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白，其特征在于氨基酸序列為PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白，其特征在于氨基 酸序列合成的方法包括化學(xué)、生物從頭合成以及化學(xué)、生物法的部分切割后獲 得。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白，其特征在于經(jīng)修 飾后的鮭魚魚精蛋白用于增加抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的能力；用于抑制革蘭氏陰性 菌；用于增加防止和減少酸性條件下酪蛋白沉淀的能力。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白，其特征在于上述 應(yīng)用包括用作抗菌肽、防腐劑或增稠劑以及疫苗、抗體或試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)修飾的鮭魚魚精蛋白，其抑制革蘭氏陽(yáng)性菌活性提高，同時(shí)具有抑制革蘭氏陰性據(jù)能力，可以進(jìn)一步減少酸性條件下酪蛋白沉淀。本發(fā)明氨基酸序列為PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR。氨基酸序列合成的方法包括化學(xué)、生物從頭合成以及化學(xué)、生物法的部分切割后獲得。經(jīng)修飾后的鮭魚魚精蛋白用于增加抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的能力；用于抑制革蘭氏陰性菌；用于增加防止和減少酸性條件下酪蛋白沉淀的能力。應(yīng)用包括用作抗菌肽、防腐劑或增稠劑以及疫苗、抗體或試劑。
文檔編號(hào)C07K14/46GK101613407SQ200910021978
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者威 王, 王聯(lián)結(jié), 超 鄧 申請(qǐng)人:陜西科技大學(xué)