一種治療高膽固醇血癥的融合蛋白制備及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種新型融合蛋白的制備及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 高膽固醇血癥以脂蛋白代謝紊亂或血脂紊亂，尤以血液膽固醇低密度脂蛋白 (LDL)升高為特征，可致卒中、冠心病、下肢血管病以及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。目前，治療藥 物主要為他汀類藥物，該類藥物可明顯降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)，LDL-C水平與冠 心病的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。因此，降低LDL-C是目前降脂治療指南中的首選目標(biāo)。但是，高膽固 醇血癥的治療現(xiàn)狀不容樂觀，大部分高危和極高?；颊呔催_(dá)到LDL-C目標(biāo)值，即便使用 最好的他汀類藥物或增加藥物劑量也不能使其達(dá)標(biāo)。究其原因，臨床長期使用他汀類藥物 治療可刺激一種絲氨酸蛋白酶一前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)的表達(dá)，PCSK9為低密 度脂蛋白受體（LDL-R)的負(fù)調(diào)節(jié)劑，在與肝細(xì)胞表面的LDL-R結(jié)合后可加速其降解，導(dǎo)致肝 細(xì)胞以及LDL-R對膽固醇的攝取下降，進(jìn)而增加循環(huán)的LDL-C水平，最終影響患者的治療效 果。由此，PCSK9也成為治療高膽固醇血癥的重要靶點(diǎn)。
[0003] 針對PCSK9,國外已發(fā)展多個(gè)治療性單克隆抗體，且均在臨床試驗(yàn)中顯示良好的療 效，如賽諾菲與Regeneron聯(lián)手開發(fā)的alirocumab，安進(jìn)公司同類產(chǎn)品evolocumab，均顯著 降低健康受試者、家族性高脂血癥患者和非家族性高膽固醇血癥患者的LDL-C水平；對于 他汀類藥物效果不佳的患者，在注射單克隆抗體后其血液LDL-C水平也降低40% -72%。
[0004] 單抗良好的治療效果鼓舞人們思考并發(fā)展更多針對PCSK9的新藥，如研究發(fā)現(xiàn)， 重組可溶性LDL-R的EGF-A區(qū)可以阻斷PCSK9與LDL-R的結(jié)合及相互作用，并達(dá)到降低膽 固醇的目的；專利（【申請?zhí)枴?0128003049. 9)公開了一種結(jié)合PCSK9的多肽及其使用方法， 包括表皮生長因子結(jié)構(gòu)域（EGF-A)及其突變體，以及與PCSK9高親和結(jié)合的能力。此外，通 過反義核酸以及RNA干擾在基因水平也能明顯阻斷PCSK9的作用，甚至采用小分子化合物 抑制PCSK9的mRNA表達(dá)，也能明顯降低膽固醇的作用。顯然，各種阻斷PCSK9的方法均可 能成為治療性單抗之后的抗PCSK9新藥。
[0005] 本發(fā)明提供了一種重組可溶性EGF-A突變體融合蛋白，該融合蛋白能高親和結(jié)合 PCSK9,并能有效抑制PCSK9生物活性，最終發(fā)揮降低膽固醇的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種融合蛋白，該融合蛋白針對LDLR中EGF (A)區(qū)的氨基酸 替換/突變與人IgG FC融合蛋白（用3mEGF-FC表示），增強(qiáng)EGF-FC與PCSK9的結(jié)合作用， 有效抑制PCSK9活性。
[0007] 本發(fā)明提供的融合蛋白由DNA重組技術(shù)或基因工程手段實(shí)現(xiàn)，并由以下通式表 示：
[0008] X-連接肽-Y-連接肽-Z-連接肽-IgG Fc片段；其中，X、Y、Z為人LDLR(低密度 脂蛋白受體）中EGF(A)多肽突變體；連接肽為（GGGGS)n。
[0009] 本發(fā)明提供的融合蛋白，由人LDLR中EGF(A)區(qū)多肽突變體與人免疫球蛋白Fe片 段連接形成融合蛋白，其具體序列如下：
[0010] EGF(A)多肽突變體的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :1、3、5所述；
[0011] IgGl Fe的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO : 15所述；
[0012] IgG2 Fe的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO : 17所述；
[0013] IgG3 Fe的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO : 19所述；
[0014] IgG4 Fe的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :21所述。
[0015] 3mEGF-FC融合蛋白核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :23所述。
[0016] 編碼所述上述融合蛋白核苷酸序列如下：
[0017] EGF(A)的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :2、4、6所述；
[0018] IgGl Fe的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO : 16所述；
[0019] IgG2 Fe的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO : 18所述；
[0020] IgG3 Fe的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :20所述；
[0021] IgG4 Fe的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :22所述。
[0022] 3mEGF-FC融合蛋白核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :24所述。
[0023] 本發(fā)明同時(shí)提供了上述核酸序列的表達(dá)載體，其能在所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中復(fù)制表 達(dá)。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種制備融合蛋白的方法，將上述表達(dá)載體引入合適的表達(dá)系 統(tǒng)，從而進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)。
[0025] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種藥物組合物，其由上述融合蛋白與藥學(xué)上可接受的載體 或賦形劑組成；所述藥物組合物的制劑形式優(yōu)選為注射劑、注射用凍干粉針。
[0026] 本發(fā)明還提供了上述融合蛋白在制備預(yù)防和治療高膽固醇血癥、家族性高膽固醇 血癥、由PCSK9誘發(fā)的代謝性疾病等疾病藥物中的用途。
[0027] 本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)載體，可以是重組真核表達(dá)載體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) 載體；也可以是重組病毒表達(dá)載體，優(yōu)選腺相關(guān)病毒或腺病毒載體。
[0028] 含有表達(dá)上述融合蛋白的宿主細(xì)胞，可以為DG44、CH0細(xì)胞及其亞系或293細(xì)胞及 其亞系。
【附圖說明】
[0029] 圖1本發(fā)明融合蛋白對PCSK9降解肝細(xì)胞LDL-R的影響
[0030] 圖2本發(fā)明融合蛋白對肝細(xì)胞攝取LDL-C的影響
【具體實(shí)施方式】
[0031] 提供以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而非對本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實(shí)施中所作的 任何變動(dòng)都將落在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
[0032] 實(shí)施例1融合蛋白的制備
[0033] 1、質(zhì)粒構(gòu)建
[0034] 1.1基因和引物合成
[0035] 表達(dá)序列通過下述合成的基因和引物重組至表達(dá)載體?；蚝鸵镉蓪I(yè)公 司北京金唯智公司合成，合成基因序列重組至質(zhì)粒載體PUC19中，命名為pUC19-EGFwt、 pUC19-mEGF 14、pUC19-mEGF16 和 pUC19-3M EGF。
[0036] 合成融合蛋白基因片段：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組融合蛋白，其特征在于所述融合蛋能夠結(jié)合PCSK9,抑制PCSK9生物活性， 其融合蛋白由以下通式表示： X-連接肽-Y-連接肽-Z-連接肽-IgG Fc片段；其中，X，Y，Z為LDLR(低密度脂蛋白 受體）的EGF(A)區(qū)（表皮生長因子結(jié)構(gòu)域）多肽突變體；連接肽為（GGGGS)η。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于多肽X為EGF (A)區(qū)第3位天冬酰胺被 任何氨基酸取代的多肽突變體；多肽Y由EGF(A)區(qū)）第16位半胱酰胺被任何氨基酸取代 的多肽突變體；多肽Z由EGF(A)區(qū)第26位亮氨酸被任何氨基酸取代的多肽突變體，及其組 合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的融合蛋白，其特征在于多肽X為EGF(A)區(qū)）第3位天冬 酰胺優(yōu)選被絲氨酸取代的多肽突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1，核苷酸序列為SEQ ID NO :2 ;多肽Y由EGF(A)區(qū)第16位半胱酰胺優(yōu)選被酪氨酸取代的多肽突變體，其氨基酸序列 為SEQ ID NO :3,核苷酸序列為SEQ ID NO :4 ;多肽Z由EGF㈧區(qū)第26位亮氨酸優(yōu)選被脯 氨酸取代的多肽突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO :5,核苷酸序列為SEQ ID NO :6,及其組 合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中連接肽含有由式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) η (式中，η是1?4的整數(shù)），表示的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中Fc片段為人IgGl Fc片段、IgG2 Fc片段、 IgG3 Fc片段和IgG4 Fc片段；其氨基酸序列為分別SEQ ID NO :15、17、19、21，核苷酸序列 為 SEQ ID NO :16、18、20、22。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 23的氨基酸序列組成 或由在SEQ ID NO: 23的氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被刪除，添加和/或取代的氨基酸 序列組成。
7. -種制備融合蛋的方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述的融合蛋白編碼DNA插入表 達(dá)載體，并將此載體引入合適的表達(dá)系統(tǒng)，并進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于由權(quán)利要求1中任一項(xiàng)所述融合蛋白 與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的制劑形式為注射 齊U、注射用凍干粉針。
10. 根據(jù)權(quán)利1-9所述，其特征在于融合蛋白用于預(yù)防和治療高膽固醇血癥、家族性高 膽固醇血癥、由PCSK9誘發(fā)的代謝性疾病等，以及與他汀類藥物的聯(lián)合應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種結(jié)合PCSK9的融合蛋白，其融合蛋白由以下通式表示：X-連接肽-Y-連接肽-Z-連接肽-IgG？Fc片段；其中，X，Y，Z為LDL-R(低密度脂蛋白受體)中EGF(A)區(qū)多肽突變體，連接肽為(GGGGS)n。本發(fā)明所提供的融合蛋白能高親和結(jié)合PCSK9，抑制PCSK9對肝細(xì)胞LDL-R的降解，增加肝細(xì)胞對LDL-C的攝取，使其在治療高膽固醇血癥、家族性高膽固醇血癥等疾病方面具有明顯的優(yōu)勢和良好的前景。
【IPC分類】A61P3-06, A61K47-48, A61K38-17, A61P3-00, C07K19-00, C12N15-63
【公開號】CN104558199
【申請?zhí)枴緾N201410454292
【發(fā)明人】付偉, 羅弟祥, 李生偉, 代燕平, 程琳, 高小平
【申請人】成都貝愛特生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年9月5日