專利名稱：金結(jié)合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及金結(jié)合蛋白，含有該金結(jié)合蛋白的復(fù)合蛋白，和其在檢測其靶物質(zhì)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著最近半導(dǎo)體微加工技術(shù)的進展，通過使設(shè)備小型化使得半導(dǎo)體工業(yè)顯著發(fā)展。以光刻法為代表的微加工技術(shù)最近已經(jīng)達到了幾百納米的精加工精度。上述技術(shù)使用的材料和設(shè)備能夠有效地用于許多方面，并且預(yù)期用于光通信、電通信等以及生物技術(shù)和能量等許多領(lǐng)域。但是，當考慮在100納米或更小的規(guī)格上加工作為現(xiàn)有微加工技術(shù)的擴展時，除技術(shù)挑戰(zhàn)以外，工業(yè)應(yīng)用還面臨許多挑戰(zhàn)，包括與加工有關(guān)的時間和費用。隨著適用領(lǐng)域的增多，強烈需要制造精細結(jié)構(gòu)的新技術(shù)作為以上技術(shù)的替代。
在此情況下，已經(jīng)利用產(chǎn)生在原子或分子水平上控制的所需結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的自下而上方法代替常規(guī)自上而下加工技術(shù)對新材料積極進行了研究和開發(fā)。生產(chǎn)精細結(jié)構(gòu)的自下而上技術(shù)的例子包括其中在金屬表面上控制分子排列的分子裝置的研發(fā)，并且已經(jīng)研究了利用物質(zhì)自裝配的方法的應(yīng)用作為一種這樣的分子排列控制技術(shù)。該研究的最近的一個例子是，Lindsay等(Science，300p.1413，2003)利用自裝配單層檢測了分子轉(zhuǎn)換功能，在該單層中在其各自分子末端具有硫醇基的鏈烷硫醇和鏈烷二硫醇定位在金基板上。
眾所周知，以核酸和蛋白質(zhì)為代表的生物分子在原子水平控制下構(gòu)建為精確的結(jié)構(gòu)而發(fā)揮其功能。這些生物分子的性質(zhì)的應(yīng)用也已經(jīng)研究，以將這些生物分子應(yīng)用于多種裝置，在該裝置中生物分子排列在金屬、金屬氧化物或半導(dǎo)體基板上。生產(chǎn)基板上排列有生物分子的精細結(jié)構(gòu)的技術(shù)對于開發(fā)這種裝置的第一步是至關(guān)重要的。例如，當考慮在金基板上固定脫氧核糖核酸(DNA)或在上面固定具有各種功能的具有氨基酸序列的肽時，普遍地知道能夠化學(xué)合成該DNA或肽，并且用硫醇基(-SH)化學(xué)修飾這些物質(zhì)的末端，從而利用S-Au表面吸附將這些物質(zhì)設(shè)置在金基板上。利用這個事實，已經(jīng)對在金上固定有DNA或肽的實驗系統(tǒng)及其向裝置的轉(zhuǎn)化進行了研究。
另一方面，作為酶、抗體等起作用的蛋白質(zhì)具有高分子量。因此，化學(xué)合成這些具有高分子量的化合物以形成高級結(jié)構(gòu)而同時保持發(fā)揮其功能的能力是非常困難的。盡管當前進行了許多研究，但事實是同時具有高級結(jié)構(gòu)和所需功能的功能性蛋白質(zhì)在大多數(shù)情況下仍然未能合成(Science，302p.1364，2003)。當功能性蛋白質(zhì)被固定在基板材料上時，與基板的結(jié)合通常如下進行用以硅烷偶聯(lián)劑為代表的多種表面處理劑處理該基板，向該蛋白質(zhì)中引入能夠與經(jīng)受表面處理的該基板的表面結(jié)合的官能團(Proteomics，3p.254，2003)。然而已經(jīng)指出，這種將反應(yīng)性官能團引入功能性蛋白質(zhì)中通常通過化學(xué)修飾進行，并且非選擇性地確定引入位點。因此，該功能性蛋白質(zhì)以功能性較低的形狀被固定在基板上，并且可能由于該功能性蛋白質(zhì)的功能表達位點的修飾而使最終活性降低。
也可以通過基因工程方法向蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點以產(chǎn)生融合蛋白。作為一個例子，已知這樣一種方法，其中通過基因工程將所有位點或已知與低分子化合物生物素結(jié)合的(鏈霉)親和素的生物素結(jié)合位點引入所需蛋白質(zhì)的N-或C-末端，然后該所需蛋白質(zhì)表達為融合蛋白，隨后通過排列在所需基板表面上的生物素固定。
另外，最近公開了另一技術(shù)。在該技術(shù)中，由5個或更多氨基酸組成的肽能夠與用于固定的基板材料結(jié)合。該肽可以與所需蛋白質(zhì)融合產(chǎn)生融合蛋白，從而在基板上結(jié)合并固定所需蛋白質(zhì)。Belcher等披露了一種通過噬菌體展示方法由12個氨基酸組成的肽，該肽能夠特異性識別含有GaAs的某些晶體表面(Nature，405p.665，2000)，從而產(chǎn)生了利用生物材料自裝配的能力研究裝置的新的可能性。另外，Belcher等公開了用于其他半導(dǎo)體(PbS，CdS)的由7-14個氨基酸組成的肽的氨基酸序列(WO 03/029431)。Brown等披露了具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的肽的一些例子，該結(jié)構(gòu)具有由14個殘基組成的氨基酸序列的單元，顯示金親和力(Nature Biotechnology，15p.269，1997)。迄今通過上述噬菌體展示方法已經(jīng)獲得了具有對金屬(Au、Pt、Pd、Ag)、金屬氧化物(SiO2、ZnO、Cr2O3、Fe2O3)或半導(dǎo)體的親和力的許多其他肽。
通過對基板材料具有親和力的這種肽將需要的生物分子固定在基板上，由于生物分子之間或與不同基板之間的相互作用，也可以以自裝配方式構(gòu)建循環(huán)地具有所需功能和形狀的結(jié)構(gòu)。例如，Belcher等披露了一種技術(shù)，其中展示與ZnS顆粒結(jié)合的ZnS-親和性肽的M13噬菌體通過自裝配排列，從而產(chǎn)生液晶樣膜(Science，296892，2002)。
另外，一些實例顯示通過如上所述的基因工程產(chǎn)生了與基板結(jié)合位點融合的所需功能性蛋白質(zhì)，從而使該功能性蛋白質(zhì)可以固定在基板上功能性位點之外的所需位點。但是，當對基板材料具有親和力的肽直接或通過由幾個氨基酸組成的接頭連接到功能性蛋白質(zhì)末端，然后與固相(例如基板)結(jié)合而實現(xiàn)蛋白質(zhì)固定時，該功能性蛋白質(zhì)的活性位點(例如構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合位點的幾個氨基酸殘基)靠近基板并且與基板表面發(fā)生某些相互作用(例如靜電作用)，引起結(jié)構(gòu)改變等，導(dǎo)致可能不能充分發(fā)揮所需功能。甚至當接頭設(shè)計為更長時，在分子運動方面具有高自由度的作為接頭的肽仍然可能排列靠近功能性位點，其功能可能受到抑制。
由于上述問題，本發(fā)明人具有了一個想法，即上面固定有功能性聚合材料包括功能性蛋白質(zhì)接頭的基板結(jié)合位點需要具有功能性部分(支架)作為與基板保持一定距離而不抑制所固定的蛋白質(zhì)的所需活性的間隔區(qū)，以及與基板結(jié)合的位點。
作為具有這種支架的分子識別分子，最眾所周知的是抗體?？贵w是在自身防御機制中起作用的一類蛋白質(zhì)，其特異性識別并結(jié)合侵入動物體液中的外源物質(zhì)表面上的多種結(jié)構(gòu)，這些外源物質(zhì)然后被免疫系統(tǒng)解毒?？贵w的多樣性(用于結(jié)合多種外源物質(zhì)的具有不同氨基酸序列的抗體數(shù))據(jù)估計為每只動物有107至108個不同種類。其結(jié)構(gòu)是由具有兩個長鏈和兩個短鏈的多肽鏈形成的，長多肽鏈(重鏈)和短多肽鏈(輕鏈)分別被稱為重鏈和輕鏈。
這些重鏈和輕鏈各自具有可變區(qū)和恒定區(qū)。輕鏈是由一個可變區(qū)(VL)和一個恒定區(qū)(CL)的兩個結(jié)構(gòu)域組成的多肽鏈，而重鏈是由一個可變區(qū)(VH)和三個恒定區(qū)(CH1-CH3)的四個結(jié)構(gòu)域組成的多肽鏈。上述每個結(jié)構(gòu)域具有由大約110個氨基酸組成的圓柱形結(jié)構(gòu)，并且形成反向平行排列的β片層的層結(jié)構(gòu)，這種層結(jié)構(gòu)通過一個SS鍵結(jié)合，形成高度穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。而且，眾所周知，抗體與多種抗原種的結(jié)合是由上述每個可變區(qū)(VH或VL)的三個互補決定區(qū)(CDR)中氨基酸序列的多樣性引起的。CDR，三個為VH的，三個為VL的，被構(gòu)架區(qū)分開排列，并且識別目標識別位點中官能團的空間結(jié)構(gòu)，從而允許高特異性的分子識別。
上述CDR的多樣性歸因于當骨髓干細胞分化為作為抗體產(chǎn)生細胞的B淋巴細胞時在抗體基因座中發(fā)生的DNA重排。眾所周知，重鏈中由VH、D和JH基因片段組成的部分，和輕鏈中由Vλ或Vκ和Jλ或Jκ基因片段組成的部分，經(jīng)歷DNA重排，從而產(chǎn)生抗體。這種DNA重排在每個B細胞中獨立地發(fā)生，一個B細胞只產(chǎn)生一種抗體。但是，個體中的全體B細胞可以產(chǎn)生各種各樣的抗體。
迄今已經(jīng)利用抗體形成機制在動物免疫系統(tǒng)中人工產(chǎn)生了能夠與上述特定物質(zhì)結(jié)合的抗體，并且已經(jīng)應(yīng)用于多個工業(yè)領(lǐng)域。產(chǎn)生方法的一個例子是這樣一種方法，其中以固定間隔用目標抗原性物質(zhì)與佐劑一起免疫動物(例如兔、山羊或小鼠)，收集其血清中存在的抗體。如上獲得的抗體是幾種抗體的混合物，它識別免疫中所用抗原性物質(zhì)表面上的多種結(jié)構(gòu)。含有與一種抗原結(jié)合的幾種抗體的血清被稱為多克隆抗體。
另一方面，所要免疫的動物的脾臟中存在產(chǎn)生可與目標抗原結(jié)合的抗體的多種B淋巴細胞。將這種抗體形成B淋巴細胞與建立的腫瘤細胞融合，從而產(chǎn)生雜交瘤細胞。如上所述，一個B淋巴細胞產(chǎn)生一種抗體，并且建立了一個系統(tǒng)，它能夠傳代培養(yǎng)產(chǎn)生一種抗體的B淋巴細胞作為雜交瘤。如上所述產(chǎn)生的抗體被稱為單克隆抗體。
作為使用抗體的上述結(jié)構(gòu)作為錨的分子識別結(jié)構(gòu)，JP 05-055534A公開了識別兩種不同抗原的多結(jié)合抗體，和用其形成多層的方法。根據(jù)這種技術(shù)，能夠獲得識別第一抗原和第二抗原的融合抗體。另外，第一抗原、融合抗原和第二抗原連續(xù)排列在基板表面，從而允許不經(jīng)化學(xué)修飾而形成多層。但是，為了獲得其公開的融合蛋白，必須使用動物細胞，這就面臨關(guān)于成本效率和操作復(fù)雜性的問題。除此之外，當形成多層時，必須包括將可被融合蛋白識別的抗體排列在基板表面上的步驟。
已知通過用某種蛋白水解酶處理上述抗體獲得的抗體片段，F(xiàn)ab、Fab’或F(ab’)2，具有類似于親本抗體的結(jié)合抗原的能力。
同樣，對于上述VH、VL或作為其復(fù)合物的Fv，甚至由VH或VL組成的復(fù)合物，具有通過由幾個氨基酸組成的肽連接的一個區(qū)的羧基末端和另一個區(qū)的氨基末端的單鏈Fv(scFv)，或其類似物，已知具有類似于親本抗體的結(jié)合抗原的能力。
Skerra和Better披露了一種方法，其中當大腸桿菌表達抗體基因時產(chǎn)生Fab-型和Fv-型抗體片段，該抗體片段的N末端通過基因工程方法添加了分泌信號序列(Science，240P.1038，1988；Science，240p.1041，1988)。另外，JP 07-501451 A公開了一種多價抗原結(jié)合抗體及其產(chǎn)生方法，JP 08-504100 A公開了一種多價、多結(jié)合抗體及其產(chǎn)生方法。這兩種技術(shù)揭示了結(jié)合蛋白是含有與一種或多種抗原結(jié)合的抗體可變區(qū)部分(VH和/或VL)的蛋白質(zhì)。JP 07-501451公開了識別泛癌抗原TAG-72和熒光素的結(jié)合蛋白和識別它們兩者的一種雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列，以及編碼它們的堿基序列。JP 08-504100 A在實施例中公開了一種二價雙特異性結(jié)合蛋白，它由針對已知蛋白質(zhì)(細胞膜蛋白，癌抗原CEA，F(xiàn)cRY1等)或低分子化合物的抗體片段復(fù)合物組成。
然而，在上述公開內(nèi)容中，沒有公開關(guān)于直接識別和結(jié)合以無機物質(zhì)為代表的基板材料表面的結(jié)合蛋白的技術(shù)。因此，當生產(chǎn)在基板上排列結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)時，必須通過公知的方法進行這種排列，例如，包括化學(xué)修飾基板或上述結(jié)合蛋白以將該結(jié)合蛋白通過共價鍵排列在該基板上的方法。類似地，當結(jié)合蛋白與金屬或半導(dǎo)體物質(zhì)的細粒結(jié)合時，也必須化學(xué)修飾將要結(jié)合的顆粒或結(jié)合蛋白。這種化學(xué)修飾通常針對在蛋白質(zhì)分子中大量含有的氨基殘基或羧基，參與該反應(yīng)的位點是非選擇性的。因此，發(fā)揮所需活性的位點可以是基板結(jié)合的或標記的位點，結(jié)果，蛋白質(zhì)的所需活性可能降低。而且，這個問題可能不僅存在于向微裝置轉(zhuǎn)化的技術(shù)中，而且也存在于傳感元件如生物傳感器的生產(chǎn)中。因此，重要的是在基板上固定捕獲靶物質(zhì)的分子如抗體，而同時保持足以發(fā)揮其捕獲功能的分子定向。
正在進行研究，其中向具有類似于上述抗體的構(gòu)架的蛋白質(zhì)增加識別多樣性分子的能力。其例子包括anticolin(MolecularBiotechnology，74p.257，2001中的綜述)和III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(J.Mol.Biol，284p.1141，1998)。Anticolin是在脂籠蛋白(lipocalin)的基礎(chǔ)上改變的捕獲蛋白。脂籠蛋白是由160至180個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其在轉(zhuǎn)運和貯存具有低水溶性的物質(zhì)方面起作用。關(guān)于結(jié)構(gòu)，脂籠蛋白是由8個β片層組成的桶狀結(jié)構(gòu)。脂籠蛋白能夠通過連接8個β片層的4個環(huán)結(jié)構(gòu)識別和結(jié)合目標物質(zhì)。纖連蛋白通常是由不超過100個殘基的氨基酸組成的蛋白質(zhì)，它在細胞與胞外基質(zhì)的連接或細胞連接中起關(guān)鍵作用。如同上述兩種蛋白質(zhì)一樣，纖連蛋白是具有β片層結(jié)構(gòu)并且通過β片層之間的環(huán)結(jié)構(gòu)識別靶物質(zhì)的蛋白質(zhì)。通過將隨機氨基酸序列導(dǎo)入上述anticolin或纖連蛋白的β片層之間的環(huán)結(jié)構(gòu)中，構(gòu)建了新的結(jié)合蛋白。因為這些分子除分子識別位點外還具有由β片層組成的強分子結(jié)構(gòu)，所以這些分子通過與希望的功能性聚合材料融合而特異性識別和結(jié)合基板，從而使該聚合材料固定在該基板上。另外，預(yù)計這些分子也具有與基板保持一定距離，而不抑制所固定的聚合材料的所需活性的間隔區(qū)功能。但是還沒有關(guān)于以上述抗體為代表的具有組成穩(wěn)定的構(gòu)架的分子識別蛋白特異性識別和結(jié)合以金屬或半導(dǎo)體材料為代表的無機物質(zhì)的報道。
另一方面，在多種物質(zhì)(靶物質(zhì))的檢測領(lǐng)域中，迄今為止已經(jīng)建立了幾種對靶物質(zhì)的檢測和/或定量等方法，特別是對于蛋白質(zhì)如抗原和抗體，以及糖，凝集素，和核酸。例如，眾所周知，標記劑與特異性識別和結(jié)合作為靶物質(zhì)的糖或凝集素的抗體結(jié)合，從而允許通過該標記劑檢測或定量該靶物質(zhì)。通常，由金屬如金或有機材料如乳膠組成的細粒，被某個波長區(qū)的激發(fā)光激發(fā)熒光的熒光物質(zhì)，或以熒光物質(zhì)作為反應(yīng)產(chǎn)物的酶(例如HRP)，用作標記劑。標記蛋白質(zhì)如抗體的方法包括物理吸附法和化學(xué)鍵法，在化學(xué)鍵法中將反應(yīng)性官能團引入標記劑或待標記的物質(zhì)中，用作形成化學(xué)鍵的交聯(lián)點。
在下文中，將以檢測中使用的抗體作為例子描述現(xiàn)有技術(shù)。JP03-108115 B公開了通過將金細粒物理吸附到抗體上用金標記該抗體的方法的實施例。根據(jù)該方法，將單克隆抗體加入到預(yù)先調(diào)節(jié)的金膠體的分散體中，將整體進行離心沉淀，以除去上清液，將得到的溶液洗滌幾次，產(chǎn)生金標記的抗體。
然后將描述通過化學(xué)鍵法標記抗體的方法?？贵w具有蛋白質(zhì)的氨基或SH基。預(yù)先在標記劑中提供可與這些基團反應(yīng)的官能團，從而使標記劑如熒光物質(zhì)與待標記物質(zhì)如抗體之間形成化學(xué)鍵。該方法的一個例子包括這樣一種方法，該方法包括引入具有可與氨基反應(yīng)的N-羥基琥珀酰亞胺基、異硫氰酸酯基、硝基芳基鹵基或?；然臉擞泟V泛用作標記蛋白質(zhì)的交聯(lián)劑的N-羥基琥珀酰亞胺已知在pH 7或更高pH下可有效地與氨基反應(yīng)，并且形成高度穩(wěn)定的酰胺鍵(Biochemistry，Vol.11，pp.2291，1972)。蛋白質(zhì)上賴氨酸側(cè)鏈的α位和ε位的氨基在反應(yīng)中可以被琥珀酰亞胺基靶向。特別是，ε位的氨基被認為是琥珀酰亞胺的普通靶標。例如，當作為標記劑的金細粒與蛋白質(zhì)如抗體化學(xué)結(jié)合時，首先用一種化合物修飾金細粒，該化合物在一端具有至少一個SH基，而在另一端具有與蛋白質(zhì)的上述側(cè)鏈殘基高度反應(yīng)性的官能團。然后，該蛋白質(zhì)可以與該反應(yīng)性官能團交聯(lián)，與它們結(jié)合。但是，由于具有賴氨酸或游離α-氨基酸的殘基非選擇性地成為這些方法的反應(yīng)中的目標物，將要標記的蛋白質(zhì)如抗體的功能可能受到抑制。盡管已知FITC也是具有異硫氰酸酯基團的熒光物質(zhì)，但是類似于琥珀酰亞胺，將要標記的蛋白質(zhì)的所需性質(zhì)可能由于與氨基的非特異性反應(yīng)而減少。
此外，-SH基也可以作為交聯(lián)點。利用SH基的方法大致被分為馬來酰亞胺法和二硫吡啶法。馬來酰亞胺法是利用具有馬來酰亞胺作為與SH基選擇性反應(yīng)的基團的交聯(lián)劑的方法，已知其允許在溫和條件下選擇性交聯(lián)。例如，當所要結(jié)合的對象是抗體時，切割抗體分子鉸鏈區(qū)中二硫鍵的SH基與抗原識別部分無關(guān)，因此該抗體的特異性預(yù)計不受影響，即使SH基被修飾。該SH基用作交聯(lián)點，從而允許標記劑結(jié)合而不削弱所需的功能。然而，一個抗體在整個分子內(nèi)具有16個SS鍵，包括用于保持具有互補決定區(qū)(CDR)作為抗原識別部分的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的結(jié)構(gòu)的SS鍵。因此如果SS鍵的還原不是位點特異性進行的，其功能可能被削弱。
JP 04-070320 B公開了利用金屬硫蛋白或其片段的蛋白質(zhì)標記技術(shù)，金屬硫蛋白是能夠與多種金屬離子高親和力螯合的低分子量蛋白質(zhì)。在該申請中公開了一種技術(shù)，其中金屬硫蛋白在巰基部分與作為標記劑的金屬離子結(jié)合，并且在作為交聯(lián)點的另一官能團如胺基、羥基或羧基處與抗體等結(jié)合。盡管與金屬離子和與待標記物質(zhì)結(jié)合的位點在金屬硫蛋白中有區(qū)別，并且能夠與將要結(jié)合的相應(yīng)物質(zhì)結(jié)合，但是待標記的物質(zhì)的結(jié)合位點如其他交聯(lián)方法一樣不確定，并且如上所述的問題可能仍然存在。
此外，對于由于如上所述通過化學(xué)交聯(lián)的標記劑固定方法所引起的非選擇性修飾，解決的手段包括通過基因工程的修飾方法。也能夠產(chǎn)生融合蛋白，其中通過基因工程方法向蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點。已知的一個例子是這樣一種方法，其中通過化學(xué)法將低分子化合物生物素引入標記劑如熒光物質(zhì)的末端，并且通過基因工程將已知與上述生物素結(jié)合的完整(鏈霉)親和素或生物素結(jié)合位點引入所需蛋白質(zhì)的N末端或C末端，隨后表達為融合蛋白并且通過生物素-親和素鍵與標記劑結(jié)合。因此，低分子化合物被引入標記劑如熒光物質(zhì)中，并且通過基因工程產(chǎn)生了融合蛋白，在該融合蛋白中能夠識別和結(jié)合該低分子化合物的蛋白質(zhì)被引入所需蛋白質(zhì)中，從而引入了選擇性結(jié)合位點。
然而，上述公開的技術(shù)沒有公開任何關(guān)于選擇性識別和結(jié)合以無機物或標記劑為代表的基板材料表面的結(jié)合蛋白分子的技術(shù)。因此，當生產(chǎn)結(jié)合蛋白或復(fù)合蛋白排列在基板上的結(jié)構(gòu)時，必須用公知方法進行這種排列，例如，包括化學(xué)修飾基板或上述結(jié)合蛋白以將該結(jié)合蛋白通過共價鍵排列在基板上的方法。類似地，當結(jié)合蛋白與金屬或半導(dǎo)體物質(zhì)的細粒和標記劑結(jié)合時，也必須化學(xué)修飾將要結(jié)合的細?；蚪Y(jié)合蛋白。這種化學(xué)修飾通常針對蛋白質(zhì)分子中大量包含的氨基殘基或羧基，并且參與該反應(yīng)的位點是非選擇性的。因此，發(fā)揮所需活性的位點可以是基板結(jié)合的或標記的位點，結(jié)果，蛋白質(zhì)的所需活性可能降低。
而且，這個問題可能不僅存在于向微裝置轉(zhuǎn)化的技術(shù)中，而且也存在于傳感元件如生物傳感器的生產(chǎn)中。因此，重要的是將捕獲靶物質(zhì)的分子如抗體固定在基板上，而同時保持充分發(fā)揮其捕獲功能的分子定向。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的能夠與金結(jié)合的蛋白質(zhì)是具有金親和力的蛋白質(zhì)，其特征在于包含金結(jié)合位點，該金結(jié)合位點含有金抗體的至少一部分。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種金結(jié)合復(fù)合蛋白，包含(1)第一結(jié)構(gòu)域，其含有具有金親和力的蛋白質(zhì)；和(2)第二結(jié)構(gòu)域，其含有具有對某些物質(zhì)的結(jié)合位點的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含基板和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其中該基板在其表面的至少一部分中含有金，該蛋白質(zhì)是具有上述構(gòu)造的金結(jié)合復(fù)合蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種編碼具有上述構(gòu)造的金結(jié)合復(fù)合蛋白的核酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了含有所述核酸的載體。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)具有上述構(gòu)造的結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟(1)制備所述基板；(2)生產(chǎn)所述金結(jié)合復(fù)合蛋白；和(3)將該金結(jié)合復(fù)合蛋白排列在該基板上。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒，包括用于形成具有上述構(gòu)造的結(jié)構(gòu)的基板和金結(jié)合復(fù)合蛋白，和用于檢測靶物質(zhì)與該結(jié)構(gòu)結(jié)合的檢測工具。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于用標記劑標記靶物質(zhì)的連接體，包括一個或多個與靶物質(zhì)結(jié)合的位點，和一個或多個與標記劑結(jié)合的位點，其中與靶物質(zhì)結(jié)合的位點和與標記劑結(jié)合的位點各自獨立地與將要結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合；且與標記劑結(jié)合的位點和與靶物質(zhì)結(jié)合的位點中的至少一個含有具有上述構(gòu)造的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測靶物質(zhì)的方法，其中靶物質(zhì)與標記劑結(jié)合并且被其標記，以檢測與該標記劑結(jié)合的靶物質(zhì)，包括以下步驟將標記劑通過具有上述構(gòu)造的連接體與靶物質(zhì)結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒，包括標記劑；具有上述構(gòu)造的連接體；和用于檢測該標記劑與靶物質(zhì)通過該連接體結(jié)合的狀態(tài)的檢測工具。
根據(jù)本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白包括金結(jié)合位點和結(jié)構(gòu)部分。因此，當與金結(jié)合蛋白連接和結(jié)合的功能性物質(zhì)被固定在金基板表面時，這種固定不影響該功能性物質(zhì)的原始功能。而且，因為在固定中未使用試劑，該功能性物質(zhì)未經(jīng)受任何影響其功能的化學(xué)反應(yīng)。此外，通過與金基板保持距離，該功能性物質(zhì)不會與基板發(fā)生影響其功能的相互作用。
另外，本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白包括至少與金和某些物質(zhì)結(jié)合的幾個結(jié)合位點。這允許一種結(jié)構(gòu)形成至少由以下部分組成的分層體(i)在其表面至少一部分中含有金的基板，(ii)本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白，和(iii)能夠與本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白結(jié)合的某種物質(zhì)。在這種情況下，因為本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白具有空間穩(wěn)定的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的β片層結(jié)構(gòu)，在金基板和該某種物質(zhì)之間能夠保持間距，而與金或金以外的物質(zhì)(例如標記劑)結(jié)合的金結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域(例如第二結(jié)構(gòu)域)不會與含金基板發(fā)生某些相互作用，并且能夠保持結(jié)合能力。而且，這允許形成極薄且精細的分層結(jié)構(gòu)。利用本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的這些特性，可以獲得一種檢測裝置。例如，在薄金層中提供能夠與所需物質(zhì)結(jié)合的本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白，并且能夠制造用于所需物質(zhì)的傳感元件。其檢測方法能夠提供光學(xué)手段，例如，應(yīng)用表面等離振子共振的手段。
另一方面，當提供含金物質(zhì)作為標記劑時，可以使用本發(fā)明的金結(jié)合蛋白作為連接體，用于將含金標記劑與靶物質(zhì)結(jié)合。根據(jù)作為連接體的這種形式，可以獲得以下所述的典型效果。
第一個效果是，金結(jié)合蛋白具有一個或多個各自與靶物質(zhì)和標記劑結(jié)合的位點，每個結(jié)合位點彼此獨立地與將要結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合，從而提供一種極佳的連接體，該連接體能夠標記靶物質(zhì)，并且不顯示所標記的物質(zhì)與靶物質(zhì)結(jié)合的能力降低，這種降低被認為是常規(guī)標記方法中由標記劑結(jié)合引起的問題。第二個效果是，連接體是生物聚合物，更特別的是蛋白質(zhì)，因此預(yù)期具有高親和力，這是由于靶物質(zhì)表面與蛋白質(zhì)的幾個氨基殘基相互作用而引起的。第三個效果是，連接體是抗體可變區(qū)，預(yù)期具有結(jié)合特異性，因為在由高級結(jié)構(gòu)確定的構(gòu)造中限定了結(jié)合位點。第四個效果是，標記劑是含有金的物質(zhì)，從而不僅能夠測定樣品的散射光的量，而且除了應(yīng)用增強拉曼或局部等離振子原理的光學(xué)測量以外還能夠利用其電學(xué)性質(zhì)進行電測定。第五個效果是，使用本發(fā)明的連接體，可以提供同時或任選地增加有靶物質(zhì)/連接體/標記劑的檢測方法和檢測試劑盒。


圖1是一張示意圖，顯示本發(fā)明的復(fù)合蛋白的一個實施例中一種結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。
圖2A和2B是示意圖，分別顯示本發(fā)明的復(fù)合蛋白的一個實施例中一種結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。
圖3是一張示意圖，顯示本發(fā)明的復(fù)合蛋白的一個實施例中一種結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。
圖4A和4B是示意圖，分別顯示本發(fā)明的復(fù)合蛋白的一個實施例中一種結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。
圖5是一張示意圖，顯示本發(fā)明的復(fù)合蛋白的一個實施例中一種結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。
圖6是一張示意圖，顯示本發(fā)明的復(fù)合蛋白的一個實施例中一種結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。
圖7是一張示意圖，顯示本發(fā)明的復(fù)合蛋白的一個實施例中一種結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。
圖8是一張示意圖，顯示本發(fā)明的復(fù)合蛋白的一個實施例中一種結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。
圖9是顯示SPR評價本發(fā)明獲得的VL的一個實施例的圖。
圖10是顯示SPR評價本發(fā)明獲得的VH的一個實施例的圖。
圖11是用于說明本發(fā)明實施例的載體的示意圖。
圖12A和12B是用于說明本發(fā)明實施例的載體的示意圖。
圖13是用于說明本發(fā)明實施例的載體的示意圖。
圖14是用于說明本發(fā)明實施例的載體的示意圖。
圖15是用于說明本發(fā)明實施例的載體的示意圖。
圖16是用于說明本發(fā)明實施例的載體的示意圖。
圖17是顯示SPR評價本發(fā)明獲得的scFv的一個實施例的圖。
圖18是實施例21中的SPR圖。
圖19是實施例31中的GPC圖。
圖20是實施例32中的SPR圖。
圖21是實施例34中的SPR圖。
圖22是實施例36中的SPR圖。
圖23是實施例37中的GPC圖。
圖24是實施例38中的SPR圖。
圖25是實施例40中的GPC圖。
圖26是實施例42中含有金細粒的溶液的吸附曲線。
圖27是比較實施例3中的SPR圖。
圖28是比較實施例4中的SPR圖。
發(fā)明最佳實施方式在下文中將描述根據(jù)本發(fā)明的金結(jié)合蛋白，應(yīng)用該金結(jié)合蛋白的復(fù)合蛋白，及其應(yīng)用。
(1)金結(jié)合蛋白抗體本發(fā)明的金結(jié)合蛋白包括抗體的至少一部分。如本發(fā)明所示用于結(jié)合金的抗體的例子包括所有脊椎動物的淋巴細胞產(chǎn)生的具有金親和力的抗體，和一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有在該抗體的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并且在結(jié)構(gòu)和功能上與該抗體具有關(guān)系，即，保持需要的金親和力。盡管抗體根據(jù)其性質(zhì)(免疫或物理)的分類分為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，但是該分類中的任何抗體都可以在本發(fā)明中使用。而且，這些抗體可以形成多聚體。例如，IgA形成二聚體，IgM形成五聚體，只要它們是能夠與金結(jié)合的形狀就沒有問題。金結(jié)合抗體的獲得。另外，抗體也可以是IgW和IgY，只要它們用于體外應(yīng)用。
作為獲得本發(fā)明的金結(jié)合抗體的方法，可以適當?shù)剡x擇和進行制備抗血清的技術(shù)和通過細胞融合產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)，這些技術(shù)已經(jīng)常規(guī)進行。例如，用本發(fā)明中所要結(jié)合的金細粒對適于免疫的動物進行免疫，在證實抗體效價升高后，從血清中收集抗體。上述免疫通常用如下的方法進行，其中將作為抗原的金細粒用適當?shù)娜軇┤缟睇}水溶液稀釋至合適的濃度，將該溶液，必要時與弗氏完全佐劑一起，靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用于動物，共3至4次，間隔為1至2周。這樣免疫的動物在最后一次免疫3天后解剖，使用從切下的脾臟中獲得的脾細胞作為免疫細胞。用于免疫的金細粒的大小優(yōu)選為10nm或更小，更優(yōu)選2nm或更小。另外，更優(yōu)選地，金細粒與蛋白質(zhì)如血清白蛋白共價連接，使其成為半抗原。至此，預(yù)計難以產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原也作為某種蛋白質(zhì)抗原的一部分被識別，并且通過該抗原與蛋白質(zhì)抗原之間形成復(fù)合物誘導(dǎo)它的產(chǎn)生。
獲得的抗體可以是多克隆的，但是，也可以作為單克隆抗體提供，從而允許選擇對金具有高特異性的克隆。單克隆抗體可以通過克隆產(chǎn)生它的細胞而獲得。通常，免疫球蛋白形成細胞，例如從接受免疫的動物中采集的脾細胞，與腫瘤細胞融合，從而形成雜交瘤(Gulfre G.，Nature 266.550-552，1977)。例如，腫瘤細胞包括骨髓瘤細胞，如小鼠來源的骨髓瘤P3/X63-AG8.653(ATCC No.CRL-1580)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/0，Sp2)、NSO、PAI、FO或BW5147，大鼠來源的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.，和人源骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、DIR11或CEM-T15。
在篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細胞時，該細胞在滴定板中培養(yǎng)，在觀察到增殖的孔中培養(yǎng)上清液與上述金細粒的反應(yīng)性可以通過例如酶免疫試驗來測定，如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫溶劑測定(ELISA)或免疫沉淀。或者，也可以用表面等離振子共振(SPR)裝置定量測定金親和力。
抗體片段本發(fā)明所述的抗體片段是指單克隆抗體的一部分的區(qū)域，其具體例子包括F(ab′)2、Fab’、Fab、Fd、抗體的可變片段(Fv)、單鏈Fv(scFv)、二硫鍵穩(wěn)定的Fv(dsFv)和由重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)組成的單結(jié)構(gòu)域抗體(dAv)。
此處所用的“F(ab′)2”和“Fab′”可以通過用例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶作為蛋白水解酶處理抗體獲得。它們是指通過在抗體鉸鏈區(qū)中兩個重鏈(H鏈)之間存在的二硫鍵附近消化而產(chǎn)生的抗體片段。例如，當用木瓜蛋白酶處理IgG時，該IgG在鉸鏈區(qū)中兩個H鏈之間存在的二硫鍵的上游被切開，產(chǎn)生兩個同源片段，其中由輕鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)(CL)組成的輕鏈(L鏈)和由重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)1(CH1)組成的重鏈(H鏈)通過位于C末端區(qū)的二硫鍵結(jié)合在一起。這兩個同源抗體片段中的每一個被稱為Fab’。另外，當用胃蛋白酶處理IgG時，該IgG在鉸鏈區(qū)中兩個H鏈之間存在的二硫鍵的下游切開，從而產(chǎn)生在鉸鏈區(qū)中連接的比上述兩個Fab’略大的抗體片段。該抗體片段被稱為F(ab′)2。
本發(fā)明的金結(jié)合蛋白可以是上述的Fab’或F(ab′)2。該金結(jié)合蛋白也可以是Fd片段，其中VH和上述CH1結(jié)合在一起。
另外，該金結(jié)合蛋白可以是抗體的可變片段(Fv)或其部分，例如，構(gòu)成Fv的重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)或其部分。另一方面，對于由上述VH或VL組成的復(fù)合物，可以使用一個區(qū)的羧基末端和另一個區(qū)的氨基末端通過由幾個氨基酸組成的肽連接在一起的單鏈Fv(scFv)。優(yōu)選地，由上述scFv構(gòu)成的VH/VL(沒有具體順序)具有由一個或多個氨基酸組成的接頭。重要的是將氨基酸接頭的殘基長度設(shè)計為沒有抑制形成抗原與VH或VL結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)的結(jié)合力。作為一個具體例子，氨基酸接頭的長度通常為5-18個殘基，更廣泛地使用和研究15個殘基。這些片段可以通過基因工程方法獲得。
另外，盡管VH和VL中的任一個都可以是單結(jié)構(gòu)域dAb，但是該單結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)通常不穩(wěn)定，因此可以通過化學(xué)修飾如PEG修飾來穩(wěn)定。另外也可以使用camelid重鏈的可變區(qū)VHH(J.Mol.Biol，311p123，2001)和鉸口鯊(Nurse Shark)的免疫球蛋白樣分子IgNAR的可變區(qū)，IgNAR在體內(nèi)存在并且能夠作為只含重鏈的抗體起作用。另外，當使用以人和小鼠抗體為代表的由重鏈和輕鏈組成的抗體VH或VL作為如圖1至4所示的結(jié)構(gòu)域單元時，也可以利用僅含重鏈抗體的等同物引入VH/VL或類似的界面，以提高穩(wěn)定性。
金結(jié)合位點可包括選自下組的至少一個(1)抗體重鏈可變區(qū)(VH)，變體，及其一部分，和(2)抗體輕鏈可變區(qū)(VL)，變體，及其一部分。抗體重鏈可變區(qū)(VH)的優(yōu)選例子包括具有SEQ ID NO.1至48的氨基酸序列中至少一個的蛋白質(zhì)，抗體輕鏈可變區(qū)(VL)的優(yōu)選例子包括具有SEQ ID NO.49至57的氨基酸序列中至少一個的蛋白質(zhì)。可以同樣使用具有金親和力并且含有一個或多個氨基酸序列的蛋白質(zhì)，該氨基酸序列在SEQ ID NO.1至57的氨基酸序列每一個中具有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加。
具有金親和力的抗體片段的獲得通過酶處理獲得上述抗體用某些酶處理，以獲得一定程度地具有該抗體的抗原結(jié)合位點和抗原結(jié)合能力的抗體片段。例如，F(xiàn)ab片段或其類似物可以通過用木瓜蛋白酶處理所獲得的抗體而獲得。F(ab’)2片段或其類似物可以通過用胃蛋白酶處理所獲得的抗體而獲得。除上述酶法以外，也可以通過化學(xué)降解法產(chǎn)生上述抗體片段。該抗體片段可以沒有問題地使用，只要它具有與金結(jié)合的能力。
獲得根據(jù)本發(fā)明的VH或VL的上述Fab’、Fv或dAb的方法也可以是利用基因工程方法獲得。一個例子是這樣一種方法，在該方法中產(chǎn)生VH或VL的基因文庫，將其廣泛表達為蛋白質(zhì)，以根據(jù)對金或靶物質(zhì)的親和力選擇相應(yīng)基因?；蛭膸炜梢垣@自，例如，臍帶血、扁桃體、骨髓或外周血細胞或脾細胞。例如，從人外周血細胞中提取mRNA，并合成cDNA。然后，利用編碼人VH或VL的序列作為探針，產(chǎn)生人VH或VL的cDNA文庫。例如，能夠廣泛擴增人VH家族(VH1至7)的引物以及能夠擴增人VL的引物在本領(lǐng)域中已知。通過將引物與該VH或VL的每一個組合進行RT-PCR，得到編碼該VH或VL的基因?；蛘?，也能夠采用噬菌體展示法。在噬菌體展示法中，編碼VH、VL或含有它們的復(fù)合物(例如Fab、scFv)的基因文庫與編碼噬菌體外殼蛋白的基因結(jié)合，產(chǎn)生噬菌粒文庫，該噬菌粒文庫隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)，表達為具有多種VH或VL作為外殼蛋白一部分的噬菌體。這些噬菌體用于如上所述根據(jù)對金或靶物質(zhì)的親和力進行選擇。編碼由噬菌體展示為融合蛋白的VH或VL的基因由該噬菌體中的噬菌粒編碼，因此能夠通過DNA測序來鑒定。
本發(fā)明還包括編碼上述金結(jié)合蛋白的核酸。本發(fā)明進一步包括由核酸組成的組分，其作為將要表達為蛋白質(zhì)的基因載體提供，用于轉(zhuǎn)化宿主細胞(例如來源于大腸桿菌、酵母、小鼠或人的公知的蛋白質(zhì)表達細胞)，以允許上述金結(jié)合蛋白的表達。能夠由一種表達載體表達的本發(fā)明的金結(jié)合蛋白可以從整個抗體分子或其抗體片段F(ab’)2、Fab、Fv(scFV)、VH或VL或其復(fù)合物來選擇和設(shè)計。當一個表達載體編碼多個上述抗體片段時，每個抗體片段可以獨立地表達為單個多肽鏈。也可能構(gòu)建將這些抗體片段表達為一條多肽鏈的載體，該多肽鏈中結(jié)構(gòu)域連續(xù)地或者通過氨基酸連接。
在用于表達本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的載體的結(jié)構(gòu)中，可以根據(jù)所選擇的宿主細胞，通過整合入表達轉(zhuǎn)基因所必需的結(jié)構(gòu)例如已知的啟動子，來設(shè)計和構(gòu)建該載體?？梢愿鶕?jù)所選擇的宿主細胞按照已知啟動子等結(jié)構(gòu)來構(gòu)建該載體。當使用大腸桿菌等作為宿主細胞時，本發(fā)明的金結(jié)合蛋白或其組分作為外源基因產(chǎn)物被直接排出到細胞質(zhì)外部，從而減少了蛋白酶降解。而且，眾所周知，即使該外源基因產(chǎn)物對細菌有毒性，通過將該外源基因產(chǎn)物分泌到細菌外部也可以減輕它的作用。大多數(shù)穿過已知的胞質(zhì)膜或內(nèi)膜分泌的蛋白質(zhì)通常在其前體的N末端具有信號肽，在分泌過程中該信號肽被信號肽酶切下，使前體成為成熟蛋白質(zhì)。大多數(shù)信號肽具有堿性氨基酸、疏水性氨基酸和信號肽酶切割位點，它們位于N末端。
通過將編碼以pelB為代表的公知信號肽的核酸定位于編碼本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的核酸的5’側(cè)，可以分泌并表達該金結(jié)合蛋白。
本發(fā)明的幾種金結(jié)合蛋白或由多個抗體片段組成的幾種多肽鏈也可以各自獨立地插入一個載體中。在此情況中，編碼pelB的核酸可以位于每個結(jié)構(gòu)域或者編碼該多肽鏈的核酸的5’側(cè)，以利于分泌。或者，當金結(jié)合蛋白表達為由一個或多個結(jié)構(gòu)域組成的多肽鏈時，編碼pelB的核酸可以位于該多肽鏈的5’側(cè)，從而如上所述有利于分泌。其中如上所述在其N末端融合有信號肽的本發(fā)明的金結(jié)合蛋白可以從周質(zhì)部分和培養(yǎng)基上清液中純化。
為了方便純化表達的蛋白質(zhì)的程序，可以通過基因工程將用于純化的標簽排列在由抗體分子形成的多肽鏈、或者每個獨立的抗體片段、或連續(xù)連接的幾個抗體片段的N或C末端。上述用于純化的標簽的例子包括由六個連續(xù)組氨酸殘基組成的組氨酸標簽(下文稱為HisX6)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的谷胱甘肽結(jié)合位點。引入標簽的方法的例子包括將編碼用于純化的標簽的核酸插入上述表達載體中編碼金結(jié)合蛋白的核酸的5’或3’末端的方法；以及使用商業(yè)上可獲得的載體引入用于純化的標簽。
下文將描述利用上述表達載體產(chǎn)生本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的方法。用一種用于表達金結(jié)合蛋白的載體轉(zhuǎn)化公知的表達蛋白質(zhì)的宿主細胞，該載體根據(jù)宿主細胞設(shè)計，從而利用該宿主細胞中的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)將本發(fā)明的金結(jié)合蛋白或作為其成分的多肽鏈合成到該宿主細胞中。然后，可以從細胞內(nèi)部或細胞培養(yǎng)上清液中純化并由此獲得積累或分泌到宿主細胞外部或內(nèi)部的所需蛋白質(zhì)。例如，當使用大腸桿菌作為宿主細胞時，可以通過將編碼以pelB為代表的公知信號肽的核酸定位于編碼本發(fā)明金結(jié)合蛋白的核酸的5’側(cè)來構(gòu)建大腸桿菌，以利于向細胞質(zhì)外分泌和表達。
當構(gòu)成本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的幾個多肽鏈在本發(fā)明的一種表達載體中表達時，編碼pelB的核酸可以位于編碼每個多肽鏈的核酸的5’側(cè)，從而有利于其表達時向細胞質(zhì)外的分泌。其中如上所述在其N末端融合有信號肽的本發(fā)明的金結(jié)合蛋白，可以從周質(zhì)部分和培養(yǎng)基上清液中純化。在一種純化方法中，當用于純化的標簽是His-標簽時，可以使用鎳柱純化，當用于純化的標簽是GST時，可以使用固定的谷胱甘肽柱純化。
在細菌中表達的本發(fā)明的金結(jié)合蛋白也可以用不溶性顆粒獲得。在這種情況中，可以從細胞勻漿溶液中離心不溶性顆粒，在該溶液中從培養(yǎng)液中獲得的細菌用弗氏壓碎器或超聲波進行勻漿。獲得的不溶性顆粒部分可以用含有含尿素和鹽酸胍的公知變性劑的緩沖溶液溶解，然后在變性條件下用如上所述的柱純化。對于獲得的柱洗脫級分，變性劑的清除和活性結(jié)構(gòu)的重建可以通過重折疊程序進行?？梢赃m當?shù)厥褂萌魏喂椒ㄗ鳛橹卣郫B程序。更具體而言，根據(jù)所需蛋白質(zhì)可以使用分步透析法或稀釋法。
本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的每個結(jié)構(gòu)域或每個多肽鏈可以在相同的細胞中表達，或者可以在用另一種宿主細胞表達后彼此共存地復(fù)合。
另外，使用編碼本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的載體，也可以利用細胞提取溶液在體外表達該蛋白質(zhì)。優(yōu)選使用的細胞提取溶液的例子包括大腸桿菌、麥胚和兔網(wǎng)織紅細胞。但是，用細胞提取溶液合成蛋白質(zhì)通常在還原條件下進行。因此，更優(yōu)選的是進行一些處理用于在抗體片段中形成二硫鍵。
在存在0.1％ Tween 20的緩沖液條件下，本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的優(yōu)選解離常數(shù)(KD)為10-6M或更低，更優(yōu)選10-8M或更低。本發(fā)明人已經(jīng)通過研究證實，在上述條件下，蛋白質(zhì)材料不能附著于金上，甚至對金具有較大非特異性附著的蛋白質(zhì)材料如BSA也是如此。如果KD值為10-6或更低，如上所述的非特異性粘附蛋白質(zhì)的附著行為完全能夠被區(qū)別開。另外，當KD值為10-8或更低時，金結(jié)合蛋白完全可以作為用于固定的錨分子。
抗體片段蛋白質(zhì)的表達金結(jié)合蛋白用需要的限制性內(nèi)切酶切割，例如在上述情況中用NcoI/NheI切割，得到編碼金結(jié)合抗體片段的DNA?？梢詫⑵鋵?dǎo)入公知的用于在宿主細胞中表達蛋白質(zhì)的質(zhì)粒中，從而得到抗體片段。例如，當使用大腸桿菌作為宿主細胞并且從胞外表達或周質(zhì)部分中收集所需的抗體片段時，可以在編碼上述抗體片段的基因的上游引入公知的信號肽。信號肽包括pelB。為了在表達后容易地從培養(yǎng)上清液或細菌部分中純化需要的蛋白質(zhì)，可以融合公知的用于純化的標簽。更具體而言，可以引入6個組氨酸殘基(HisX6)或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的谷胱甘肽結(jié)合位點，得到融合蛋白。對于His-標簽的情況，該融合蛋白可以用金屬螯合柱如鎳容易地純化。對于GST標簽的情況，可以用具有上面固定有谷胱甘肽的載體如Sepharose的柱進行純化。
或者，當在細菌中表達的所需蛋白質(zhì)不能用不溶性顆粒獲得時，該不溶性顆粒可以用含有尿素和鹽酸胍的公知緩沖溶液溶解，然后重折疊?？梢赃m當?shù)厥褂萌魏喂椒ㄗ鳛橹卣郫B方法。更具體而言，根據(jù)所需蛋白質(zhì)可以使用分步透析法或稀釋法。
如上所述獲得的抗體及其片段，例如Fab、(Fab’)2、Fc、VH或VL，或其復(fù)合物，甚至在其氨基酸序列中具有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加的，只要具有金親和力就沒有脫離本發(fā)明的范圍。
在存在0.1％ Tween 20的緩沖液條件下，本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的優(yōu)選解離常數(shù)(KD)為10-6M或更低，更優(yōu)選10-8M或更低。本發(fā)明人已經(jīng)通過研究證實，在上述條件下，蛋白質(zhì)材料不能附著于金上，甚至對金具有較大非特異性附著的蛋白質(zhì)材料如BSA也是如此。
如果KD值為10-6或更低，非特異性粘附蛋白質(zhì)的附著行為完全能夠被區(qū)別開。另外，當KD值為10-8或更低時，金結(jié)合蛋白完全可以作為用于固定的錨分子。
含有金的待結(jié)合物質(zhì)可以從在其表面的至少一部分中含有金的多種物質(zhì)中選擇并且使用含有金的待結(jié)合物質(zhì)。當通過免疫、淘選等選擇金結(jié)合蛋白時，待結(jié)合物質(zhì)的表面僅由金組成，用于排除清除與金以外的物質(zhì)附著的蛋白質(zhì)的污染。用于除表面以外的內(nèi)核基板的材料可以選擇并且使用(當然)金，以及多種其他已知材料。而且，待結(jié)合物質(zhì)優(yōu)選以顆粒形式提供，更優(yōu)選為1-100μmφ的細粒，從而使參與結(jié)合的比表面積增加，并且允許在淘選結(jié)束時通過離心容易地收集。另外，如下所述，待結(jié)合物質(zhì)可以是通過將金蒸發(fā)到多種商業(yè)上可獲得的塑料板中的任一種例如培養(yǎng)皿或96孔滴定板上而獲得的。在這種情況中，考慮金表面的濕潤區(qū)域和攪拌引起的分子擴散效應(yīng)，優(yōu)選地確定孔的大小和數(shù)目。
待結(jié)合物質(zhì)的形狀可以適當?shù)剡x擇及使用本領(lǐng)域所知的形狀，如扁平、球形、針狀或多孔的形狀。成型方法可以適當?shù)剡x自物理或化學(xué)蒸汽淀積法或使用氯化金的化學(xué)生產(chǎn)方法。獲得的含金表面可以預(yù)先用酸性溶液、堿性溶液、有機溶劑等洗滌，以便清除雜質(zhì)如氧化物層、副產(chǎn)物和污染物，并且具有需要的金暴露條件。
基板可以在多種應(yīng)用中使用的結(jié)構(gòu)能夠由金結(jié)合蛋白和在其表面至少一部分上形成金的基板獲得?？梢允褂镁哂腥我庑螤詈筒牧系幕澹灰谄浔砻嬷辽僖徊糠稚虾薪鸩⑶夷軌蛐纬杀景l(fā)明的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中使用的基板的材料可以是能夠形成本發(fā)明結(jié)構(gòu)的任何材料，包括選自下組的任何一種或多種或其復(fù)合物金屬，金屬氧化物，無機半導(dǎo)體，有機半導(dǎo)體，玻璃，陶瓷，天然聚合物，合成聚合物，塑料。本發(fā)明使用的基板的形狀可以是能夠形成本發(fā)明結(jié)構(gòu)的任何形狀，包括選自以下形狀的任何一種或多種板、顆粒、多孔體樣、突出、纖絲、圓柱和網(wǎng)狀形狀。
用于形成基板的有機聚合化合物的例子包括通過選自下組的可聚合單體聚合而生產(chǎn)的有機聚合化合物苯乙烯可聚合單體，如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、β-甲基苯乙烯、鄰甲基苯乙烯、間甲基苯乙烯，對甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯，對-正-丁基苯乙烯、對-叔丁基苯乙烯、對-正-己基苯乙烯、對-正-辛基苯乙烯、對-正-壬基苯乙烯、對-正-癸基苯乙烯、對-正-十二烷基苯乙烯、對甲氧基苯乙烯、和對苯基苯乙烯；丙烯酸酯可聚合單體，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸異丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸2-乙基己基酯、丙烯酸正辛酯、丙烯酸正壬酯、丙烯酸環(huán)己酯、丙烯酸芐酯、磷酸二甲酯丙烯酸乙酯、磷酸二乙酯丙烯酸乙酯、磷酸二丁酯丙烯酸乙酯、和2-苯甲酰氧基丙烯酸乙酯；甲基丙烯酸酯可聚合單體，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸異丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正戊酯、甲基丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸2-乙基己基酯、甲基丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸正壬酯、磷酸二乙酯甲基丙烯酸乙酯、和磷酸二丁酯丙烯酸乙酯；亞甲基脂肪族一元羧酸酯；乙烯基酯，如乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、和甲酸乙烯酯；乙烯基醚，如甲基乙烯基醚、乙基乙烯基醚、和異丁基乙烯基醚；和乙烯基可聚合單體，包括乙烯基酮，如甲基乙烯基酮、己基乙烯基酮和異丙基乙烯基酮。
此外，無機固體的例子可以包括但是當然不限于粘土礦物，如高嶺土、膨潤土、滑石和云母；金屬氧化物，如氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋅、磁鐵礦、鐵氧體、NbTa復(fù)合氧化物、WO3、In2O3、MoO3、V2O5和SnO2；不溶性無機鹽，如硅膠、羥基磷灰石和磷酸鈣凝膠；金屬，如金、銀、鉑和銅；半導(dǎo)體化合物，如GaAs、GaP、ZnS、CdS和CdSe；玻璃；硅；及其復(fù)合物。
可以用于形成本發(fā)明基板的膜和片的例子包括但當然不限于由塑料組成的膜，如聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、二醋酸酯、三醋酸酯、玻璃紙、賽璐珞、聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚酯；由如下成分組成的多孔聚合物膜聚氯乙烯、聚乙烯醇、乙酰纖維素、聚碳酸酯、尼龍、聚丙烯、聚乙烯和特氟綸；木制板；玻璃板；硅基板；織物，如棉花、人造絲、丙烯酸樹脂、絲和聚脂；紙，如優(yōu)質(zhì)紙、中質(zhì)紙、銅版紙、證券紙、再生紙、鋇白紙、高光澤印刷紙、瓦楞紙、和樹脂印相紙。注意這些膜和片的材料也可以是光滑的或不平的。
基板的例子包括由硅、二氧化硅、玻璃、石英玻璃等制成的基板，通過光刻、蝕刻和噴砂在基板中形成的微流通道和孔，或者具有在上面形成金、銀和鉑薄膜的表面的基板；由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯對苯二甲酸酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)等制成的基板，和通過模制技術(shù)在其中形成的微流通道和孔；碳納米管；碳納米孔(nanohones)、富勒烯(fullerenes)、金剛石或其聚集物；由鋁、碳、富勒烯、ZnO等構(gòu)成的納米晶須；中孔性薄膜、細粒、和由SiO2、鋁硅酸鹽、其他金屬硅酸鹽、TiO2、SnO2、Ta2O5等制成的單塊(monolith)結(jié)構(gòu)構(gòu)件；金、銀、銅、鉑等的細粒；磁鐵礦、鐵氧體、赤鐵礦、gammna赤鐵礦、磁赤鐵礦等的三氧化二鐵細粒；鋁/硅混合物膜和利用陽極氧化由其獲得的氧化硅納米結(jié)構(gòu)構(gòu)件；多孔氧化鋁薄膜；氧化鋁納米孔結(jié)構(gòu)；和硅納米絲，但不限于這些。
另外，可以根據(jù)預(yù)期用途不同地選擇本發(fā)明的基板的尺寸。
·靶物質(zhì)檢測試劑盒用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒可以用增加了對靶物質(zhì)的親和力的本發(fā)明金結(jié)合蛋白的構(gòu)造獲得。例如，用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒可以由以下成分構(gòu)成用于形成上述結(jié)構(gòu)構(gòu)件的基板和金結(jié)合復(fù)合蛋白；和用于檢測靶物質(zhì)與該結(jié)構(gòu)構(gòu)件結(jié)合的檢測組件。例如，能夠檢測含有金結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)與靶物質(zhì)的結(jié)合，使得金或含金的標記劑以與含金結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)加入靶物質(zhì)中，然后進行物理或化學(xué)方法，以檢測金或靶物質(zhì)。此外，當靶物質(zhì)含有金時，利用金結(jié)合蛋白對金的親和力使金結(jié)合蛋白與含金標記劑結(jié)合，然后檢測其結(jié)合狀態(tài)。在這種情況下，使用的標記可以是下面將在連接體的描述中描述的那些。而且，例如，可以根據(jù)物理值的變化，如光、電或熱的變化，檢測標記劑與金結(jié)合蛋白的結(jié)合。
另外，增加了對標記劑的親和力的結(jié)構(gòu)優(yōu)選地可以是利用下面所述金結(jié)合復(fù)合蛋白或金結(jié)合蛋白作為靶物質(zhì)與標記劑之間的結(jié)合體的結(jié)構(gòu)。
·表面等離振子共振裝置另外，含有金結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)與金的結(jié)合可以利用例如常規(guī)已知的表面等離振子共振測定裝置進行定量測定?？偟膩碚f，表面等離振子共振是一種測量玻璃基板上形成的金薄膜上折射率變化的方法，這種折射率變化是由金薄膜上自由電子之間的共振產(chǎn)生的共振角的變化以及入射光從玻璃一側(cè)以不超過總反射角的入射角在玻璃與金之間的邊界表面上產(chǎn)生的隱失波引起的。可以將測量的折射率的變化轉(zhuǎn)化為目標蛋白質(zhì)相對于金的量，然后評價。
·解離常數(shù)(KD)術(shù)語“解離常數(shù)(KD)”是指通過將“結(jié)合率(Ka)”除以“解離率(kd)”值獲得的數(shù)值。這些速率可以用作表示單克隆抗體或其片段對金的親和力的指標。這些速率可以用各種方法中的任一種分析。然而在本發(fā)明中，使用測量儀器Biacore2000(Amersham PharmaciaBiotech，Co.，Ltd.)，根據(jù)安裝在該儀器上的分析軟件，由標準曲線確定這些速率。
(2)金結(jié)合復(fù)合蛋白本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白包含兩個或多個結(jié)構(gòu)域。在這些結(jié)構(gòu)域中，至少一個結(jié)構(gòu)域含有如上所述構(gòu)建的金結(jié)合蛋白。復(fù)合蛋白的例子包括如下所述構(gòu)建的復(fù)合蛋白。
(a)一種復(fù)合蛋白，包括含如上所述構(gòu)建的金結(jié)合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域1和含具有特定物質(zhì)特異性結(jié)合位點的蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域2。
(b)一種復(fù)合蛋白，除了第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域之外，還包括與第一結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物的第三結(jié)構(gòu)域3和與第二結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物的第四結(jié)構(gòu)域4中的至少一個。
另外，第二至第四結(jié)構(gòu)域中的至少一個可以含有至少一個具有金親和力的蛋白質(zhì)。在該情況下，這些結(jié)構(gòu)域中的每一個可以通過引入如上所述構(gòu)建的金結(jié)合蛋白而構(gòu)建。而且，第一至第四結(jié)構(gòu)域也可以具有對目標結(jié)合物質(zhì)的親和力，它們的親和力可以在結(jié)構(gòu)域之間獨立地調(diào)節(jié)?；蛘?，兩個或多個結(jié)構(gòu)域可以具有相似的親和力。這些結(jié)構(gòu)域可以由具有不同親和力的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建。
此外，選自第一至第四結(jié)構(gòu)域中的至少兩個也可以包含于同一多肽鏈中。金結(jié)合復(fù)合蛋白的這種構(gòu)造的例子包括下列結(jié)構(gòu)。
(1)其中第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域形成一條多肽鏈的結(jié)構(gòu)。
(2)其中第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域通過一個或多個氨基酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)。
(3)其中第三結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域形成一條多肽鏈的結(jié)構(gòu)。
(4)其中第三結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域通過一個或多個氨基酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)。
(5)由含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的第一多肽鏈和含第三結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域的第二多肽鏈組成的結(jié)構(gòu)。
(6)由含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的第一多肽鏈和含第三結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的第三多肽鏈組成的結(jié)構(gòu)。
(7)由含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的第一多肽鏈和含第一結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域的第四多肽鏈組成的結(jié)構(gòu)。
(8)由至少含第一結(jié)構(gòu)域、第二結(jié)構(gòu)域和第三結(jié)構(gòu)域的一條多肽鏈組成的結(jié)構(gòu)。
(9)由至少含第一結(jié)構(gòu)域、第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域的一條多肽鏈組成的結(jié)構(gòu)。
(10)由含第一至第四結(jié)構(gòu)域的一條多肽鏈組成的結(jié)構(gòu)。
·金結(jié)合復(fù)合蛋白作為金結(jié)合復(fù)合蛋白的組分提供的蛋白質(zhì)是指含有至少一條多肽鏈的分子，該多肽鏈是通過使至少兩個氨基酸結(jié)合在一起而形成的，其中該多肽鏈能夠折疊為特定的三維結(jié)構(gòu)以發(fā)揮其內(nèi)在的功能(例如，轉(zhuǎn)換和分子識別)。另外，本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白是含有至少一個金結(jié)合位點以及至少一個對金或金以外其他物質(zhì)的結(jié)合位點的復(fù)合蛋白，因而顯示多價的親和力或多特異性。例如，該復(fù)合蛋白優(yōu)選地可包括具有金結(jié)合位點并且含有抗體輕鏈可變區(qū)(VL)或重鏈可變區(qū)(VH)至少一部分的第一結(jié)構(gòu)域，和具有對特定物質(zhì)(在下文中稱為靶物質(zhì))的結(jié)合位點并且含有VH或VL至少一部分的第二結(jié)構(gòu)域。在下文中，與金結(jié)合的VH和VL分別稱為VH(G)和VL(G)。與靶物質(zhì)結(jié)合的VH和VL分別稱為VH(T)和VL(T)。
抗體重鏈可變區(qū)(VH)和抗體輕鏈可變區(qū)(VL)是分別屬于抗體重鏈和抗體輕鏈的可變區(qū)。通常，抗體重鏈可變區(qū)(VH)和抗體輕鏈可變區(qū)(VL)中的每一個都是管狀結(jié)構(gòu)，并且由大約110個氨基酸組成，然后與以相反方向排列的β片層組形成分層結(jié)構(gòu)，而該層結(jié)構(gòu)利用單S-S鍵連接，形成極穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。另外，眾所周知可變區(qū)(VH或VL)是決定抗體與多種抗原結(jié)合的互補決定區(qū)(CDR)。VH和VL中各有三個CDR，它們彼此被具有多樣性較低的氨基酸序列的構(gòu)架區(qū)隔開，從而識別靶識別位點的官能團的空間排列，使得更高級地識別特定分子。
下文中將描述本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白的一個實施例。如圖1所示，金結(jié)合復(fù)合蛋白的最小單元包括第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域組合的例子包括如(a)所示的VH(G)-VH(T)、如(b)所示的VH(G)-VL(T)，如(c)所示的VL(G)-VH(T)和如(d)所示的VL(G)-VL(T)。在該實施例中，獨立地，第一結(jié)構(gòu)域與金結(jié)合，第二結(jié)構(gòu)域與靶物質(zhì)結(jié)合，在第一和第二結(jié)構(gòu)域之間不形成互補的結(jié)合位點。第一和第二結(jié)構(gòu)域可以是分別獨立的多肽鏈，或者它們可以連續(xù)地相互對齊和連接。為了簡化生產(chǎn)過程和功能表達，更優(yōu)選的實施方案是通過連續(xù)地連接多肽鏈而形成多肽鏈。對于通過連續(xù)連接第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域制備的多肽鏈，第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域可以直接彼此連接，或者可以通過由一個或多個氨基酸構(gòu)成的接頭5連接。由氨基酸組成的接頭優(yōu)選地是由1-10個氨基酸組成的，更優(yōu)選是由1-5個氨基酸組成的。當接頭具有11-15個氨基酸的長度時，第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域之間的互補結(jié)合(成為scFv)可以形成，因為這些結(jié)構(gòu)域由于排列而具有極少的限制。為了防止在VH和VL之間形成互補復(fù)合物，眾所周知通過縮短接頭的長度而在結(jié)構(gòu)域之間施加結(jié)構(gòu)限制是有效的。理想的是，當?shù)谝缓偷诙Y(jié)構(gòu)域中的每一個與靶物質(zhì)結(jié)合時造成的結(jié)構(gòu)改變不會影響所需的與靶物質(zhì)結(jié)合的能力。因此，有可能設(shè)置由第二種結(jié)構(gòu)如α-螺旋組成的接頭或插入與需要的結(jié)合特性無關(guān)的多肽，只要它們不顯著影響需要的特性或生產(chǎn)能力。
此外，本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白與第一結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物。它可包括含有VH或VL至少一部分的第三結(jié)構(gòu)域和/或含有VL或VH至少一部分的第四結(jié)構(gòu)域，該第四結(jié)構(gòu)域與第二結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物。更希望的是使第三結(jié)構(gòu)域與第一結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，從而與第一結(jié)構(gòu)域形成互補的金結(jié)合位點。
例如，當?shù)谝唤Y(jié)構(gòu)域是如圖2A和2B所示的VH(G)時，第三結(jié)構(gòu)域優(yōu)選的是能夠與第一結(jié)構(gòu)域形成FV的VL，更優(yōu)選的是形成一種結(jié)構(gòu)，使得通過連接第一結(jié)構(gòu)域和第三結(jié)構(gòu)域形成金結(jié)合位點。
如上所述，第一結(jié)構(gòu)域和第三結(jié)構(gòu)域形成Fv，以獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性并且預(yù)期防止由于結(jié)構(gòu)改變引起的功能減弱。此外，當?shù)谌Y(jié)構(gòu)域通過與第一結(jié)構(gòu)域連接形成金結(jié)合位點時，能夠預(yù)期結(jié)合能力進一步提高(例如，結(jié)合速率提高和解離速率受到抑制)。
此外，如圖2A所示，第一結(jié)構(gòu)域和第三結(jié)構(gòu)域可以分別作為獨立的多肽鏈提供，或者可以彼此連接形成多肽鏈(例如，第三結(jié)構(gòu)域-第一結(jié)構(gòu)域-第二結(jié)構(gòu)域，如圖2B的示意圖所示，可以適當?shù)卮_定結(jié)構(gòu)，以便對金和靶標發(fā)揮結(jié)合能力)。此外，作為另一個實施例，如圖3的示意圖所示的結(jié)構(gòu)可以允許。換句話說，它是由第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域組成的多肽鏈以及第三結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域組成的多肽鏈構(gòu)成的復(fù)合物。在該情況下，通過由第一和第三結(jié)構(gòu)域形成的Fv或Fv樣復(fù)合物實現(xiàn)與金的結(jié)合，然后第一結(jié)構(gòu)域作為通過第二結(jié)構(gòu)域與靶物質(zhì)結(jié)合的錨。
此外，本發(fā)明的金結(jié)合蛋白可以包括由VH或VL的至少一部分組成的第四結(jié)構(gòu)域，它與第二結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物。希望的是以互補的方式與第二結(jié)構(gòu)域一起形成對靶物質(zhì)的結(jié)合位點。例如，如圖4A的示意圖所示，當?shù)诙Y(jié)構(gòu)域是VL時，第四結(jié)構(gòu)域優(yōu)選的是能夠與第二結(jié)構(gòu)域形成Fv的VH。更優(yōu)選地，第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成針對靶物質(zhì)的結(jié)合位點。此外，如圖4B的示意圖所示，可以通過將第一、第二和第四結(jié)構(gòu)域連接在一起形成多肽鏈。
特別是如果蛋白質(zhì)通過第一結(jié)構(gòu)域表面的至少一部分與金基板結(jié)合，而同時通過第二和第四結(jié)構(gòu)域與靶物質(zhì)結(jié)合，并且當?shù)谝唤Y(jié)構(gòu)域與該基板結(jié)合時發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)改變，則通過設(shè)置接頭有可能使得對第二和第四結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力的影響最小化。
而且，本發(fā)明的金結(jié)合蛋白可以如圖5的示意圖所示構(gòu)建。即，它是由第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域組成的多肽鏈以及第一結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域組成的多肽鏈構(gòu)建的復(fù)合物。在此情況中，該復(fù)合物通過由第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域組成的Fv或Fv樣復(fù)合物與靶物質(zhì)結(jié)合，使第一結(jié)構(gòu)域作為錨，用于上述兩條多肽鏈與金結(jié)合。
此外，本發(fā)明的金結(jié)合蛋白可以包括第三和第四結(jié)構(gòu)域作為組成材料。如圖6的示意圖所示，第三和第四結(jié)構(gòu)域可以是分別獨立的多肽鏈?；蛘撸鐖D7的示意圖所示，它可以是通過在多肽鏈間連接而獲得的多肽鏈。當金結(jié)合蛋白作為連接的多肽鏈提供時，第三結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域可以直接連接在一起，或者可以如圖7所示通過由一個或多個氨基酸組成的接頭連接。接頭的長度可以限定為，如上所述，由氨基酸組成的接頭具有優(yōu)選1至10個氨基酸，更優(yōu)選1至5個氨基酸的氨基酸長度。
此外，如圖8的示意圖所示，第一至第四結(jié)構(gòu)域可以在一條多肽鏈中連接在一起。在這種情況中，這些結(jié)構(gòu)域的排列使得第一結(jié)構(gòu)域和第三結(jié)構(gòu)域能夠形成復(fù)合物，然后該復(fù)合物能夠與金結(jié)合，同時第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域能夠形成復(fù)合物，然后該復(fù)合物能夠與金和金以外的其他物質(zhì)結(jié)合。因此，接頭優(yōu)選地設(shè)置在結(jié)構(gòu)域之間。例如，1至5個氨基酸位于第一和第二結(jié)構(gòu)域之間或第三和第四結(jié)構(gòu)域之間。另外，15至25個氨基酸位于氨基酸的第二和第四結(jié)構(gòu)域之間。在類似的結(jié)構(gòu)中，第一和第二結(jié)構(gòu)域以及第三和第四結(jié)構(gòu)域中的每一個或兩個可以相互取代。
根據(jù)需要的金結(jié)合蛋白的性質(zhì)，如對金或靶標的親和力和長期穩(wěn)定性，可以適當?shù)剡x擇并且限定一條多肽鏈中每個結(jié)構(gòu)域的序列。
第一結(jié)構(gòu)域是，例如，含有選自SEQ ID No1至SEQ ID No57的至少一個氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域。在這些氨基酸序列的每一個中，只要該氨基酸保持其金親和力，即使該氨基酸序列具有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加，也沒有問題。此外，只要它顯示金親和力，即使該氨基酸序列為氨基酸序列的一個構(gòu)成部分，或者為其復(fù)合物，它也可以沒有任何問題地用作本發(fā)明的金結(jié)合蛋白。具有SEQ ID No1至SEQ ID No57的本發(fā)明VH的具體例子在SEQ ID No58至SEQ ID No74中表示。另外，本發(fā)明的VL的具體例子在SEQ IDNo75至SEQ ID No77中表示。
優(yōu)選地，第三結(jié)構(gòu)域含有選自SEQ ID No1至SEQ ID No57的一個或多個氨基酸。此外，第三結(jié)構(gòu)域更優(yōu)選地通過根據(jù)第一結(jié)構(gòu)域從SEQ ID No58至SEQ ID No77中適當?shù)剡x擇而限定。
本發(fā)明還包括編碼上述金結(jié)合復(fù)合蛋白的核酸。另外，本發(fā)明還包括由核酸組成的構(gòu)建體，作為載體用于轉(zhuǎn)化宿主細胞(例如來自大腸桿菌、酵母、小鼠、人等的公知的蛋白質(zhì)表達細胞)。編碼能夠構(gòu)成本發(fā)明金結(jié)合蛋白的第一和第三結(jié)構(gòu)域的示例性核酸序列在SEQ ID No98至SEQ ID No116中表示。
能夠由上述一種表達載體表達的本發(fā)明金結(jié)合蛋白的每個結(jié)構(gòu)域可以通過從1至4中選擇而設(shè)計。當一種表達載體由本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的多個結(jié)構(gòu)域編碼時，每個結(jié)構(gòu)域可以表達為獨立的多肽鏈。另外，可以獲得表達為一條多肽鏈的載體結(jié)構(gòu)，其中結(jié)構(gòu)域直接或者通過氨基酸結(jié)合。此外，可以根據(jù)所選擇的宿主細胞，通過向表達所需結(jié)構(gòu)中引入轉(zhuǎn)基因，如已知的啟動子，設(shè)計和構(gòu)建用于本發(fā)明金結(jié)合蛋白的表達載體的結(jié)構(gòu)?？梢愿鶕?jù)所選擇的宿主細胞，參照已知啟動子等的結(jié)構(gòu)來構(gòu)建載體的結(jié)構(gòu)。而且，當使用大腸桿菌等作為宿主細胞時，本發(fā)明的金結(jié)合蛋白是外來基因產(chǎn)物，被快速清除到細胞質(zhì)外，從而減少了蛋白酶的分解。此外，當基因產(chǎn)物可能對細菌細胞有毒時，通過分泌到細胞體外有可能減弱其作用。通常，大多數(shù)穿過已知細胞膜或內(nèi)膜分泌的蛋白質(zhì)在其N末端上具有肽酶的信號肽。在分泌步驟中，信號肽酶切割該蛋白質(zhì)，使其成為成熟蛋白質(zhì)。許多信號肽在其N末端具有堿性氨基酸、疏水性氨基酸和信號肽酶的酶切位點。
通過將編碼以單肽pelB為代表的公知信號肽的核酸排列在編碼本發(fā)明金結(jié)合復(fù)合蛋白的核酸的5’末端上，可以表達并分泌該肽鏈。另外，構(gòu)成本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白的每個結(jié)構(gòu)域或由兩個或多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的多肽鏈可以獨立地插入一個載體中。在這種情況下，將編碼pelB的核酸排列在編碼每個結(jié)構(gòu)域或多肽鏈的核酸的5’末端上，以促進分泌。為了將該多肽鏈表達為由一個或多個結(jié)構(gòu)域組成的多肽鏈，同樣，通過將編碼pelB的核酸排列在該多肽鏈的5’末端上可以促進這種多肽鏈的分泌。這樣，在其N末端融合有信號肽的本發(fā)明的金結(jié)合蛋白，或者作為其組分的結(jié)構(gòu)域，可以從周質(zhì)部分和培養(yǎng)物的上清液中純化。另外，鑒于在純化表達的蛋白質(zhì)時易于進行，可以通過基因工程方法將純化標簽排列在每個獨立結(jié)構(gòu)域上或通過組合兩個或多個結(jié)構(gòu)域形成的多肽鏈的N或C末端上。該純化標簽可以是由連續(xù)排列的6個組氨酸殘基組成的組氨酸標簽(在下文中稱為Hisx6)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的谷胱甘肽結(jié)合位點，等等。作為引入該標簽的方法，例如，這樣一種方法，其中將編碼純化標簽的核酸插入表達載體中編碼金結(jié)合蛋白的核酸的5’或3’末端，或者利用商業(yè)上可獲得的載體引入純化標簽的方法。
下文將描述利用上述表達載體產(chǎn)生本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白的方法。
本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白或作為其組分提供的多肽鏈如下合成將根據(jù)宿主細胞設(shè)計的用于表達金結(jié)合復(fù)合蛋白的載體轉(zhuǎn)化到用于表達常規(guī)已知蛋白質(zhì)的宿主細胞中；利用該宿主細胞中的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)在該宿主細胞中產(chǎn)生需要的蛋白質(zhì)。之后，從細胞內(nèi)部或細胞培養(yǎng)上清液中純化積累或分泌到宿主細胞內(nèi)部或外部的目標蛋白質(zhì)。
例如，在使用大腸桿菌作為宿主細胞的情況下，將編碼以pelB為代表的常規(guī)已知信號肽的核酸排列在編碼本發(fā)明金結(jié)合復(fù)合蛋白的核酸的5’末端，從而有利于分泌型表達。為了利用一種表達載體表達兩個或多個多肽鏈以獲得組成本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白的每個結(jié)構(gòu)域，將編碼pelB的核酸排列在編碼每個多肽鏈的核酸的5’末端，以利于向細胞質(zhì)外的分泌。這樣，可以從周質(zhì)部分和培養(yǎng)上清液中純化本發(fā)明的金結(jié)合蛋白，其中單一肽在其N末端融合。作為一種純化方法，當純化標簽是His標簽，并且當柱是鎳螯合柱或GST時，可以利用谷胱甘肽固定柱進行純化。
另外，在細菌細胞中表達的本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白可以以不溶性顆粒的形式獲得。在此情況下，從培養(yǎng)基中獲得的細菌細胞可以用弗氏壓碎器或超聲波破碎，然后從細胞勻漿溶液中離心不溶性顆粒。將獲得的不溶性顆粒部分溶解在含有公知變性劑包括尿素和鹽酸胍的緩沖液中，然后在如上所述的變性條件下過柱純化。獲得的柱洗脫級分可以進行重折疊，以除去變性劑，并重新構(gòu)建活性結(jié)構(gòu)。使用的重折疊方法可以從本領(lǐng)域公知的任何方法中適當?shù)剡x擇。特別是，根據(jù)目標蛋白質(zhì)，可以使用系列稀釋法、稀釋法等。
本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的每個結(jié)構(gòu)域或每個多肽鏈可以在同一宿主細胞中表達，然后復(fù)合，或者用其他宿主細胞表達，并使其共存，從而形成復(fù)合物。
此外，使用編碼本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的載體，可以從細胞提取物中體外表達蛋白質(zhì)。在此適當使用的細胞提取物包括大腸桿菌、麥胚和兔網(wǎng)織紅細胞。但是，在上述無細胞提取物中的蛋白質(zhì)合成一般在還原條件下進行。因此，更優(yōu)選的是進行任何一種處理，以在抗體片段中形成二硫鍵。
在存在0.1％ Tween 20的緩沖液條件下，本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白具有10-6M或更低，更優(yōu)選10-8M或更低的解離常數(shù)(KD)。在上述條件下，本發(fā)明人已經(jīng)研究并證實被認為顯示與金具有較高吸附的蛋白質(zhì)材料均不能吸附到金上。當Kd值為10-6M或更低時，它與具有非特異性吸附性的蛋白質(zhì)的吸附行為完全能夠區(qū)別開。此外，10-8M或更低允許完全能夠作為用于固定的錨分子。
作為獲得具有與含金靶物質(zhì)結(jié)合能力的本發(fā)明抗體重鏈可變區(qū)(VH)或抗體輕鏈可變區(qū)(VL)的一種方法，有這樣一種方法，包括制備上述VH或VL的基因文庫；將其廣泛地表達為蛋白質(zhì)；在蛋白質(zhì)與基因之間建立對應(yīng)關(guān)系，以根據(jù)對金或靶物質(zhì)的親和力選擇一個。上述基因文庫可以從臍帶血、扁桃體、骨髓、外周血細胞、脾細胞等獲得。例如，從人外周血細胞中提取mRNA以制備cDNA。然后，利用人VH-或VL-編碼序列作為探針，制備人VH或VL的cDNA文庫。例如，能夠廣泛擴增每一家族的人VH家族(VH1-7)的引物和能夠擴增人VL的引物在本領(lǐng)域中公知。將每個VH或CL、引物組合在一起進行RT-PCR，以獲得VH-或VL-編碼基因?；蛘?，可以使用噬菌體展示方法。噬菌體展示方法包括將用于編碼VH、VL或含有VH或VL的復(fù)合物(例如Fab、scFv)的基因文庫與編碼噬菌體外殼蛋白的基因相組合；制備噬菌粒文庫；將該噬菌粒文庫轉(zhuǎn)化入大腸桿菌；表達為含有不同VH或VL作為外殼蛋白的部分的噬菌體。使用這些噬菌體，以及上述描述，能夠根據(jù)對金或靶物質(zhì)的親和力進行選擇。在噬菌體中表達為融合蛋白的編碼VH或VL的基因在該噬菌體的噬菌粒中編碼。因此，它可以通過DNA序列分析詳細說明。
此外，從用金或靶物質(zhì)免疫的動物中采集產(chǎn)生目標抗體的細胞，然后可以使用如上所述相同的引物測定VH或VL的堿基序列或氨基酸序列。
此外，可以根據(jù)已知抗體或其片段中可變區(qū)的氨基酸序列針對靶物質(zhì)設(shè)計本發(fā)明的第三和第四結(jié)構(gòu)域。另外，當沒有獲得針對靶物質(zhì)的抗體或其片段時，通過在獲得其抗體后分析氨基酸序列如上所述進行設(shè)計是可能的。第三結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域可以是構(gòu)成本發(fā)明的金結(jié)合蛋白的那些結(jié)構(gòu)域。這樣，用如此獲得的VH或VL堿基序列制備本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白。
·含金的結(jié)合物作為用于通過免疫、淘選等選擇金結(jié)合蛋白的結(jié)合物，可以使用前面在金結(jié)合蛋白情況中舉例說明的那些。
·基板本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白可以與基板組合，以提供能夠在多種用途中使用的結(jié)構(gòu)。能夠用于這些用途的基板是前面對于金結(jié)合蛋白舉例說明的那些。
·靶物質(zhì)本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白由具有金親和力的結(jié)構(gòu)域和具有靶物質(zhì)親和力的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，因此利用蛋白質(zhì)作為復(fù)合蛋白檢測靶物質(zhì)是可能的。作為檢測對象提供的靶物質(zhì)可以是在使用抗原/抗體反應(yīng)的相應(yīng)程序中作為抗原提供的任何分子。例如，靶物質(zhì)可以大致分類為非生物物質(zhì)和生物物質(zhì)。
具有高工業(yè)應(yīng)用價值的非生物材料的例子包括PCB和二噁英，它們是具有不同氯取代數(shù)目和位置的環(huán)境污染物，和破壞內(nèi)分泌的物質(zhì)，即所謂的環(huán)境激素(例如六氯苯、五氯酚、2，4，5-三氯乙酸、2，4-二氯苯氧代乙酸、氨基連三唑、阿特拉津、甲草胺、六氯環(huán)己烷、對硫磷、氯丹、氧氯丹(oxychlordane)、九氯(nanochlor)、1，2-二溴-3-氯丙烷、DDT、開樂散、艾氏劑、異狄氏劑、狄氏劑、硫丹(benzoepin)、七氯、七氯環(huán)氧化物、馬拉硫磷、滅多蟲、甲氧氯、滅蟻靈、除草醚、毒殺芬、氟樂靈、烷基酚(碳原子數(shù)為5-9)、壬基苯酚、辛基壬基苯酚(octynonylphenol)、4-辛基苯酚、雙酚A、二-2-乙基己基鄰苯二甲酸酯、丁基苯基鄰苯二甲酸酯、鄰苯二甲酸二正丁基酯、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯、鄰苯二甲酸二乙酯、苯并芘、2，4-二氯苯酚、二-2-乙基己基己二酸酯、二苯甲酮、4-硝基甲苯、八氯苯乙烯、涕滅威、苯菌靈、開蓬(十氯酮)、manzeb(代森錳鋅)、代森錳、代森聯(lián)、賽克津、氯氰菊酯、順式氰戊菊酯(esfenvalerate)、氰戊菊酯、撲滅司林、乙烯菌核利(vinclozolin)、代森鋅、福美鋅、鄰苯二甲酸二戊酯、鄰苯二甲酸二己酯和鄰苯二甲酸二丙酯)。
生物材料包括選自核酸、蛋白質(zhì)、糖鏈、脂質(zhì)和其復(fù)合物的生物材料，更特別地包括選自核酸、蛋白質(zhì)、糖鏈和脂質(zhì)的生物材料。特別地，本發(fā)明可以應(yīng)用含有選自下組任一物質(zhì)的任何材料DNA、RNA、適配子(aptamer)、基因、染色體、細胞膜、病毒、抗原、抗體、凝集素、半抗原、激素、受體、酶、肽、神經(jīng)鞘糖脂和鞘脂。另外，產(chǎn)生上述“生物物質(zhì)”的細菌或細胞本身也可以是作為本發(fā)明中目標“生物物質(zhì)”的靶物質(zhì)。
蛋白質(zhì)的具體例子包括所謂的疾病標志。其例子包括α-胎蛋白(AFP)，作為肝細胞癌(原發(fā)性肝癌)、肝母細胞瘤、轉(zhuǎn)移性肝癌和卵黃囊瘤的標志，它是胎兒期肝細胞產(chǎn)生的并且存在于胎兒血中的酸性糖蛋白；PIVKA-II，它是在肝實質(zhì)疾病過程中出現(xiàn)的異常凝血酶原，并且發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中特異性出現(xiàn)；BCA225，為原發(fā)性晚期乳腺癌和再發(fā)及轉(zhuǎn)移性乳腺癌的標志，它是對于乳腺癌免疫組化特異的抗原糖蛋白；堿性胎兒蛋白(BFP)，為卵巢癌、睪丸腫瘤、前列腺癌、胰腺癌、膽管癌、肝細胞癌、腎癌、肺癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的標志，它是在人胎兒血清、腸和腦細胞提取物中發(fā)現(xiàn)的堿性胎兒蛋白；CA15-3，為進行性乳腺癌、再發(fā)性乳腺癌、原發(fā)性乳腺癌和卵巢癌的標志，它是一種糖鏈抗原；CA19-9，為胰腺癌、膽管癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和卵巢癌的標志，它是一種糖鏈抗原；CA72-4，為卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌和胰腺癌的標志，它是一種糖鏈抗原；CA125，為卵巢癌(特別是漿液性囊腺癌)、子宮體腺癌、輸卵管癌、子宮頸腺癌、胰腺癌、肺癌和結(jié)腸癌的標志，它是一種糖鏈抗原；CA130，為上皮卵巢癌、輸卵管癌、肺癌、肝細胞癌和胰腺癌的標志，它是一種糖蛋白；CA602，為卵巢癌(特別是漿液性囊腺癌)、子宮體腺癌和子宮頸腺癌的標志，它是一種核心蛋白抗原；CA54/61(CA546)，為卵巢癌(特別是粘漿液性囊腺癌)、子宮體腺癌和子宮頸腺癌的標志，它是一種母細胞核糖鏈相關(guān)抗原；目前最廣泛地用于輔助癌癥診斷的癌胚抗原(CEA)，目前作為腫瘤相關(guān)標志抗原最廣泛地用于輔助診斷癌癥，如結(jié)腸癌、胃癌、直腸癌、膽管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宮癌和泌尿系統(tǒng)癌；DUPAN-2，為胰腺癌、膽管癌、肝細胞癌、胃癌、卵巢癌和結(jié)腸癌的標志，它是一種糖鏈抗原；彈性蛋白酶1，為胰腺癌、胰池(pancreaticcisterna)和膽管癌的標志，它是存在于胰臟中的外分泌胰蛋白水解酶，它特異性水解結(jié)締組織的彈性纖維彈性蛋白(構(gòu)成動脈壁、肌腱等)；免疫抑制酸性蛋白(IAP)，為肺癌、白血病、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、腎癌、膽管瘤、胃癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌和惡性淋巴瘤的標志，它是以高濃度存在于人類癌癥患者腹脾水或血清中的糖蛋白；NCC-ST-439，為胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝細胞癌、肺腺癌、和胃癌的標志，它是一種糖鏈抗原；γ-精漿蛋白(γ-Sm)，為前列腺癌的標志，它是一種糖蛋白；前列腺特異性抗原(PSA)，它是從人類前列腺組織中提取的一種糖蛋白質(zhì)，并且僅存在于前列腺組織中，因此是前列腺癌的標志；前列腺酸性磷酸酶(PAP)，用作前列腺癌的腫瘤標志，它是在酸性pH下水解由前列腺分泌的磷酸鹽的酶；神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)，為肺癌(特別是肺小細胞癌)、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、胰島癌、咽喉小細胞癌、胃癌、腎癌和乳腺癌的標志，它是在神經(jīng)組織和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中特異性存在的糖酵解酶；鱗狀細胞癌相關(guān)抗原(SCC抗原)，為子宮癌(子宮頸鱗癌)、肺癌、食管癌、頭頸癌和皮膚癌的標志，它是從子宮頸鱗癌的肝轉(zhuǎn)移灶中提取并純化的蛋白質(zhì)；唾液酰LeX-i抗原(SLX)，為肺腺癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、卵巢癌和子宮癌的標志，它是一種糖鏈抗原；SPan-1，為胰腺癌、膽管癌、肝癌、胃癌和結(jié)腸癌的標志，它是一種糖鏈抗原；組織多肽鏈抗原(TPA)，為食管癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、肝細胞癌、膽管癌、胰腺癌、肺癌和子宮癌的標志，它是單鏈多肽鏈，與其他腫瘤標志結(jié)合尤其可用于估計進行性癌癥和再發(fā)的預(yù)測/治療進程觀察；唾液酰Tn抗原(STN)，為卵巢癌、轉(zhuǎn)移性卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌、膽道系統(tǒng)癌、胰腺癌和肺癌的標志，它是一種母細胞核碳水化合物抗原；細胞角蛋白(CYFRA)，為一種有效的腫瘤標志，用于檢測肺非小細胞癌，特別是肺鱗狀細胞癌；胃蛋白酶原(PG)，為胃潰瘍(特別是低位胃潰瘍)、十二指腸潰瘍(特別是再發(fā)的和難治性病例)、布倫納腺瘤(Brunner′s gland oma)、Dzo ringer Ellison綜合征和急性胃炎的標志，它是作為蛋白水解酶分泌到胃液中的兩種胃蛋白酶(PG I，PG II)的無活性前體，作為分泌到胃液中的蛋白水解酶；C-反應(yīng)蛋白(CRP)，它是組織損傷和感染引起的在血漿中改變的急性期反應(yīng)物，當由于急性心肌梗塞等在心肌中發(fā)生壞死時顯示高水平；血清淀粉樣蛋白A蛋白(SAA)，它是組織損傷和感染引起的在血漿中改變的急性期反應(yīng)物；肌紅蛋白，為急性心肌梗塞、肌營養(yǎng)不良、多肌炎攻和皮肌炎的標志，它是分子量約為17,500的血紅素蛋白，主要存在于心肌和骨骼肌中；肌酸激酶(CK)(3種同工酶，來源于骨骼肌的CK-MM型，來源于腦和平滑肌的CK-BB型，和來源于心肌的CK-MB型，和線粒體同工酶或免疫球蛋白結(jié)合型CK(macroCK))，為急性心肌梗塞、甲狀腺機能減退、進行性肌營養(yǎng)不良和多肌炎的標志，它是主要存在于骨骼肌或心肌的可溶性部分中的一種酶，由于細胞損傷而遷移到血液中；肌鈣蛋白T，為橫紋肌溶解、心肌炎、心肌梗塞和腎衰竭的標志，它是分子量為39,000的蛋白質(zhì)，與橫紋肌細肌絲上的肌鈣蛋白I和C形成肌鈣蛋白復(fù)合物，并且參與肌肉收縮的調(diào)節(jié)；心室肌肌球蛋白輕鏈I，為急性心肌梗塞、肌營養(yǎng)不良和腎衰竭的標志，它是在骨骼肌和心肌中均含有的蛋白質(zhì)，其測量值的升高意味著骨骼肌和心肌的疾病或壞死；或者作為應(yīng)激標記最近受到越來越多關(guān)注的嗜鉻粒蛋白A、硫氧還蛋白和8-OhdG。
用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒本發(fā)明的金結(jié)合復(fù)合蛋白可以用于組成檢測靶物質(zhì)的試劑盒。例如，用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒可以這樣構(gòu)成，其包括在第二結(jié)構(gòu)域和任選使用的第四結(jié)構(gòu)域中利用特異性結(jié)合靶物質(zhì)的抗體及其變體的金結(jié)合復(fù)合蛋白，具有含金表面的基板；和用于檢測通過金結(jié)合復(fù)合蛋白固定在基板上的靶物質(zhì)的檢測工具。通過金結(jié)合復(fù)合蛋白固定在金基板上的靶物質(zhì)可以用上述表面等離振子共振裝置檢測?？梢允褂眠@樣一種方法，其中使用在其一部分中含有金的基板作為標記劑來檢測靶物質(zhì)。上述金結(jié)合復(fù)合蛋白可以用作介導(dǎo)這種金基板、標記劑和靶物質(zhì)的物質(zhì)。使用識別和結(jié)合靶物質(zhì)的抗體片段形成的金結(jié)合復(fù)合蛋白能夠在本發(fā)明中使用。
實施例下面將要詳細描述作為本發(fā)明一個實例的能夠與金結(jié)合的蛋白質(zhì)的獲得和評價。但是，本發(fā)明不限于“實施例”中所述的內(nèi)容。
實施例1(抗體重鏈可變區(qū)VH文庫的制備)使用來源于成人外周血B淋巴細胞的Fab文庫作為模板，利用下列引物，按照PCR推薦方法(TAKARA BIO INC，LA試劑盒)，將VH編碼基因進行DNA復(fù)制。引物如下。
·反向引物(SEQ ID No78)5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′(SEQ ID No79)5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTYCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′(SEQ ID No80)5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGSTRCAGCTGCAGSAGTCRGG-3′(SEQ ID No81)
5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSARGTGCAGKTGGTGGAGTCTGG-3′(SEQ ID No82)5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGG-3′(SEQ ID No83)5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGSAGTGGGG-3′·正向引物(SEQ ID No84)5′-ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3′(SEQ ID No85)5′-ATTCTCGACTGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3′(SEQ ID No86)5′-ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3′(SEQ ID No87)5′-ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3′(1)用Fab文庫作為模板，用引物通過PCR擴增VH編碼基因。PCR條件95℃×10min(94℃×1min，60℃×2min，72℃×2min)×35個循環(huán)，72℃×6min。
(2)制備如圖11所示通過改進pLUCK(Biochem Biophys ResCommun.218，pp682，1996)的多克隆位點而獲得的質(zhì)粒pRA-XX作為蛋白質(zhì)表達載體。(在HindIII后排列有編碼pelB的核苷酸序列作為信號肽。然后在NcoI和EcoRI之間以NheI/SacII/SpeI的順序排列限制性內(nèi)切酶位點。編碼His×6的核苷酸序列設(shè)置于SacII/SpeI之間。另外，氨芐青霉素抗性基因、T7啟動子、lac操縱子和T7終止序列與pluck相同)。
(3)按照推薦方法用限制性內(nèi)切酶在NcoI/NheI(均獲自NewEngland Biolabs)之間切割PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒。
用限制性內(nèi)切酶切割的質(zhì)粒的溶液過自旋柱400HR(AmashamScience)。
(4)用限制性內(nèi)切酶切割的PCR片段的溶液利用商業(yè)上可獲得的凝膠純化試劑盒(SV Gel and PCR Clean-up系統(tǒng)Promega)純化。
(5)應(yīng)用商業(yè)上可獲得的T4連接酶試劑盒(Roche)按照供應(yīng)商推薦的方法將上述兩條片段混合，然后連接。結(jié)果獲得如圖12A所示的VH編碼基因插入載體。
(6)用該連接產(chǎn)物通過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌DS12S株。大規(guī)模制備質(zhì)粒。
(7)系列稀釋這些質(zhì)粒溶液，每份溶液都通過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。向溶液中加入700μL LB培養(yǎng)基，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)溶液以6,000rpm離心5分鐘，然后棄去650μL上清液。
(8)將剩余的上清液和沉淀部分懸浮，將該懸浮液接種于LB/Amp平板上。然后整個置于37℃過夜。結(jié)果最終獲得含有約5×105個克隆的抗體VH文庫。
(9)然后，從三個103倍稀釋平板上任意選擇1,000個菌落，根據(jù)以下步驟制備蛋白質(zhì)粗提物。每個菌落在3mL LB/amp液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，整體在28℃下振蕩培養(yǎng)6小時。然后，加入IPTG至終濃度為1mM，整體再振蕩培養(yǎng)12小時。
(10)接著，通過離心(10,500rpm×5min)獲得培養(yǎng)物部分和上清液細菌部分。
(11)將得到的細菌部分加至在冰中冷卻的200μL滲透溶液(0.5M蔗糖，1M Tris-HCl(pH 8.0)，0.5mM EDTA)中并懸浮，整體置于冰中10分鐘。然后加入1mL冷卻的無菌水，整體置于冰中1小時。將產(chǎn)物離心(6,000rpm×30min)后，將上清液置于透析袋(MWCO 10,000)中，使用Tris+0.1％Tween 20溶液(20mM Tris，500mM NaCl)作為外部溶液透析18小時，每6小時更換一次外部溶液。
用上述步驟中獲得的透析內(nèi)部溶液作為模板用于篩選金結(jié)合抗體重鏈可變區(qū)(VH)。
實施例2(金結(jié)合抗體重鏈可變區(qū)(VH)的篩選)制備沉積有金(厚度為100nm)的96孔滴定板作為篩選金結(jié)合抗體重鏈可變區(qū)(VH)的基板。將250μL實施例1中獲得的1,000份樣品溶液分配到各孔中，該滴定板輕輕振蕩1小時。棄去上清液后，倒置該滴定板并在紙巾上輕拍10次除去水。進行洗滌步驟，包括向每孔加入200μL Tris+0.1％Tween 20；輕輕振蕩滴定板10分鐘。該操作重復(fù)3次。將200μL通過用Tris+0.1％Tween 20溶液以1∶10,000稀釋HRP結(jié)合的抗-His抗體(Invitrogen)而制備的抗體溶液分配到各孔中，輕輕振蕩滴定板1小時。然后進行與洗滌步驟相同的操作。將各100μL HRP底物和作為顯色劑的檢測試劑1和2(Amasham Science)分配到各孔中，輕輕振蕩滴定板1小時。檢測魯米諾化學(xué)發(fā)光水平。
如上所述觀察到化學(xué)發(fā)光的15個樣品菌落在1.5mL LB/amp.中傳代培養(yǎng)，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。利用SV MiniPrep DNA純化系統(tǒng)(Promega)從得到的細菌中純化質(zhì)粒。如上所述獲得的17個展示VL的噬菌粒的DNA序列按照下列方法測定。測序引物設(shè)置于表達載體的VH編碼基因上游的pelB序列部分。測序引物如下。
pelB-back(SEQ ID No88)5′-ccgct ggatt gttat tactc gc-3′用上述引物和測序反應(yīng)試劑盒和供應(yīng)商推薦的反應(yīng)溶液組合物進行BigDye-PCR反應(yīng)。溫度循環(huán)為96℃×3min→(94℃×1min→50℃×1min→68℃×4min)×30個循環(huán)。然后，利用測序儀(377，ABI制造)測定通過乙醇沉淀純化的PCR產(chǎn)物的堿基序列。結(jié)果獲得SEQ ID No.58至74的每個序列。
實施例3(抗體輕鏈可變區(qū)VL文庫的制備)按照與實施例1中相同的方法，由人外周血細胞Fab文庫制備VL基因文庫。引物如下。
·反向引物
(SEQ ID No89)5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCC-3′(SEQ ID No90)5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATRTTGTGATGACYCAGWCTCC-3′(SEQ ID No91)5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGWTGACGCAGTCTCC-3′(SEQ ID No92)5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCGWGHTGACCCAGTCTCC-3′·正向引物(SEQ ID No93)5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTT GGTCCC-3′(SEQ ID No94)5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3′(SEQ ID No95)5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTT GGTCCC-3′(SEQ ID No96)5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTT GGTCCC-3′(SEQ ID No97)5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCG TGTCCC-3′另外，類似地制備將要使用的質(zhì)粒，不同之處在于在如實施例1的(2)中制備用于蛋白質(zhì)表達的質(zhì)粒時將NcoI/SacII之間的NheI改變?yōu)镹otI。另外，用實施例1步驟(11)結(jié)束時獲得的VL蛋白透析內(nèi)部溶液作為模板用于篩選金結(jié)合抗體輕鏈可變區(qū)(VL)。
實施例4(金結(jié)合抗體輕鏈可變區(qū)(VL)的篩選)金結(jié)合的VL的篩選以與實施例2相同的方法進行，不同之處在于用實施例3中獲得的樣品作為篩選樣品。結(jié)果，獲得SEQ ID No.75至77的每個序列。
在下文中，從實施例1的人外周血細胞Fab基因文庫中制備噬菌粒，并篩選金結(jié)合的VL或VH。
實施例5(展示VL的親金噬菌體組的篩選)按照下列方法制備展示VL的噬菌體文庫，并且選擇能夠與金結(jié)合的噬菌體組。
(1)用于VL展示的噬菌粒利用來源于成人外周血B淋巴細胞的Fab文庫作為模板，利用SEQ ID No.89至97的引物復(fù)制VL編碼基因。此外，用作M13噬菌體外殼蛋白的PIII蛋白的N末端的部分缺失，并且使用以使得VL蛋白融合并表達的方式制備的展示VL的噬菌粒文庫(圖12B)(Biochem Biophys Res Commun.1996，218，pp682)。
(2)展示VL片段的噬菌體文庫的制備1)轉(zhuǎn)化通過電穿孔(外加電壓1.5KV，電阻186Ω，電容50μF)用1μL VL編碼基因文庫(350ng/μL)轉(zhuǎn)化40μL大腸桿菌DH12S。然后按照下列程序制備展示VL的噬菌體文庫。
2)培養(yǎng)(i)轉(zhuǎn)化后將800μL LB培養(yǎng)基加至DH12S溶液中，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)1小時(140rpm)。
(ii)將20mL培養(yǎng)溶液加至LB培養(yǎng)基+終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素(LB/amp.)中，整體在37℃下培養(yǎng)3-4小時。
(iii)加入40μL M13K07作為輔助噬菌體，整體在100rpm振蕩下再培養(yǎng)1小時。
(iv)加入50mg/mL卡那霉素溶液，至終濃度為50μg/mL，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)(100rpm)。
3)展示VL的噬菌體文庫的收集(i)將5mL 20％PEG/500mM NaCl加入培養(yǎng)溶液中，整體置于冰中1小時或數(shù)小時。
(ii)通過離心(6,500rpm×35min)小心除去上清液。
(iii)將沉淀物懸浮在500μL PBS緩沖液中，制備展示VL的噬菌體溶液。
4)展示VL的噬菌體文庫的滴度評價(i)將10μL JM109甘油貯存液加至LB中，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)。
(ii)用LB培養(yǎng)基系列稀釋3)中制備的展示VL的噬菌體溶液。
(iii)將10μL系列稀釋的(×10-6至10-10)溶液加到750μL(a)OD600約為0.5的培養(yǎng)溶液中，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)1小時。
(iv)離心(6,000rpm×5min)除去700μL培養(yǎng)上清液。
(v)通過移液稀釋剩余的培養(yǎng)上清液和沉淀物。然后將該懸浮液接種于LB/amp.平板上，整體置于37℃下過夜。
(vi)計數(shù)具有100個或更少菌落的稀釋濃度平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)，將其定義為展示VL的噬菌體文庫的滴度值。
得到的展示VL的噬菌體文庫溶液5×109cfu/μL(3)使用金細粒的VL淘選用如上所述制備的噬菌體文庫溶液和金細粒(1.5μmΦSigma-Aldrich制造)重復(fù)根據(jù)下列方法的淘選操作5輪，用于選擇展示金結(jié)合VL的噬菌體組。
1)結(jié)合實驗(i)將10μL金細粒溶液(50mg/PBS 1ml)和PBS+0.1％Tween20(PBST)加至無菌Eppendorf管(1.5mL)中的噬菌體溶液(體積為使該溶液中的噬菌體總數(shù)為1,010cfu)，使得總體積為1,000μL，獲得的產(chǎn)物作為結(jié)合反應(yīng)溶液。
(ii)該結(jié)合反應(yīng)溶液在室溫下保持30分鐘，同時輕輕旋轉(zhuǎn)。
(iii)離心(10,000rpm×5min)(ii)中獲得的產(chǎn)物，小心棄去培養(yǎng)上清液。
2)洗滌(非特異性吸附物的洗滌)
(i)將500μL PBST加入Eppendorf管中的金細粒中，整體在室溫下保持10分鐘，同時輕輕旋轉(zhuǎn)。
(ii)進行離心(10,000rpm×5min)，小心除去洗滌上清液。
(iii)上述(i)和(ii)均重復(fù)10次。
3)酸洗脫和酸洗脫級分的滴度評價吸附到2)中獲得的金細粒上的噬菌體的滴度按照下列程序評價。
3)-1酸洗脫(i)將115μL 0.2M Gly-HCl(pH 2.2)加入洗滌后的金細粒中，整體在垂直旋轉(zhuǎn)的同時保持1分鐘。
(ii)進行離心(10,000rpm×5min)，收集上清液作為酸洗脫級分。
(iii)加入15μL 1M Tris-HCl以中和收集的酸洗脫級分。
(iv)系列稀釋中和后的1μL酸洗脫溶液，按照滴度評價方法測定滴度值。
(v)剩余的酸洗脫級分與金細粒級分快速混合，再次懸浮該混合物。
3)-2滴度評價以與(2)-3)、4)相同的方法進行滴度評價，獲得下列結(jié)果。
第1輪9.8×102cfu第2輪1.0×103cfu第3輪7.8×102cfu第4輪1.3×103cfu第5輪1.1×104cfu4)再感染和噬菌體擴增直到第4輪，用吸附到3)中獲得的金細粒上的噬菌體組再感染大腸桿菌，以擴增噬菌體的數(shù)目，用于制備噬菌體溶液，以備隨后的淘選。
(i)大腸桿菌JM109在20mL LB培養(yǎng)基中37℃(140rpm)振蕩培養(yǎng)，用于再感染和噬菌體擴增。
(ii)將3)中獲得的金細粒的懸浮液加至OD600為0.3至0.5的(a)中的大腸桿菌培養(yǎng)溶液中，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)1小時(140rpm)。
(iii)加入氨芐青霉素至終濃度為100μg/mL，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)2小時。
(iv)加入40μL輔助噬菌體M13K07，整體在37℃下培養(yǎng)1小時，振蕩速度降至100rpm。
(v)加入卡那霉素至終濃度為50μg/mL，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。
(vi)通過與(2)-3)、4)相同的操作收集培養(yǎng)上清液中的噬菌體，以制備噬菌體溶液。此外，評價該噬菌體溶液的滴度值，以證實噬菌體已經(jīng)擴增。
擴增后獲得的滴度值顯示如下。
第1輪2.4×109cfu第2輪8.1×108cfu第3輪1.8×109cfu第4輪1.1×1010cfu(4)噬菌體ELISA1)用于ELISA的金沉積基板的制備使用與實施例2相同的沉積有金(厚度為100nm)的96孔滴定板(BD，聚苯乙烯)作為噬菌體ELISA的基板。
2)展示VL的噬菌體單克隆的制備按照下列程序，從在(3)-4)第5輪滴度評價中104倍稀釋平板上表達的11個菌落中收集噬菌粒。
(i)每一菌落用20mL LB/amp在37℃下培養(yǎng)。
(ii)加入40μL輔助噬菌體M13K07，整體在37℃下培養(yǎng)1小時，振蕩速度降至100rpm。
(iii)加入卡那霉素至終濃度為50μg/mL，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。
(iv)通過與(2)-3)、4)相同的操作收集培養(yǎng)上清液中的噬菌體，以制備噬菌體溶液。此外，評價該噬菌體溶液的滴度值，以證實噬菌體已經(jīng)擴增。
擴增后獲得的滴度值顯示如下。
No.13.8×109cfuNo.29.0×108cfuNo.32.4×109cfuNo.41.0×109cfuNo.59.7×107cfuNo.64.4×108cfuNo.76.2×109cfuNo.88.9×107cfuNo.91.4×109cfuNo.101.1×1010cfuNo.114.9×109cfu3)噬菌體溶液的制備用2)中獲得的每種噬菌體溶液制備各200μL稀釋系列，其中根據(jù)下列組成，滴度值從109cfu以10倍連續(xù)降低。
展示VL的噬菌體溶液xμLSuper封閉緩沖液(PIERCE)20μL0.5％Tween 20/PBSx/5μLPBS180-(6x/5)μL4)ELISA(i)將各80μL系列稀釋的展示VL的噬菌體溶液分配到金沉積的滴定板上，該滴定板在振蕩器上輕輕振蕩1小時。
(ii)除去噬菌體溶液，向每孔中分配90μL PBST，整體攪拌10分鐘，然后除去洗滌上清液。該操作重復(fù)3次。
(iii)向各孔中分配75μl HRP-抗M13免疫球蛋白/SBB/PBS溶液(1/1,000∶1∶10)，該滴定板在振蕩器上輕輕振蕩1小時。
(iv)棄去免疫球蛋白溶液的上清液。然后，以90μL/孔的體積分配PBST，整體攪拌10分鐘。該洗滌操作重復(fù)3次。
(v)檢測試劑1和2(Amasham BIOSCIENCE)分別以35μL/孔的體積分配，使整體反應(yīng)，同時輕輕攪拌1分鐘。
(vi)測量魯米諾的發(fā)光強度。提供具有高發(fā)光強度的No.1、No.2和No.3作為金結(jié)合的展示VL的噬菌體克隆。
為了闡明金結(jié)合VL的堿基和氨基酸序列，從上述4個噬菌體克隆中分離噬菌粒。然后，制備表達載體來表達蛋白質(zhì)，從而在表面等離振子共振(SPR)金基板上證實結(jié)合親和力。
實施例6(親金VL蛋白的獲得)(1)噬菌粒的收集按照下列程序，從與實施例5之(3)-4)第5輪滴度評價中104倍稀釋平板上表達的No.7相對應(yīng)的菌落中收集噬菌粒。
(i)每個菌落使用1.6mL LB/amp.在37℃下培養(yǎng)過夜。
(ii)使用MiniPrep SV plus DNA純化系統(tǒng)(promega)按照供應(yīng)商推薦的方法收集噬菌粒。
(2)表達載體的制備根據(jù)下列結(jié)構(gòu)構(gòu)建表達上述3種VL蛋白的表達載體。實施例1的圖11所示的pRA-XX和(1)中獲得的噬菌粒分別使用NcoI和NotI通過限制性內(nèi)切酶反應(yīng)切割。將得到的VL片段插入pRA-XX中制備質(zhì)粒pRA-VLNo，n(n克隆編號)，該質(zhì)粒將VL編碼核酸表達為融合蛋白(圖13)。
(3)蛋白質(zhì)的表達和純化如上所述獲得的用于表達VL蛋白的3種載體用來表達VL蛋白。
1)轉(zhuǎn)化用上述表達載體轉(zhuǎn)化40μL BL21(DE3)感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化在這樣的條件下進行在冰中→42℃×90sec→冰中進行熱休克。將750μL LB培養(yǎng)基加入通過熱休克轉(zhuǎn)化的BL21溶液中，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)1小時。之后，以6,000rpm離心5分鐘，棄去650μL培養(yǎng)上清液。將剩余的培養(yǎng)上清液和作為沉淀物的細胞部分攪拌并且接種于LB/amp.平板上，整體置于37℃過夜。
2)預(yù)培養(yǎng)隨機選擇平板上的菌落，在3.0mL LB/amp.培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)過夜。
3)主培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)液在750ML 2×YT培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，在28℃下繼續(xù)培養(yǎng)。當OD600大于0.8時，加入IPTG至終濃度為1mM，在28℃下進一步培養(yǎng)過夜。
4)純化(i)硫酸銨沉淀將3)中獲得的培養(yǎng)液以6,000rpm離心30min獲得培養(yǎng)上清液。稱量得到的培養(yǎng)上清液的重量。然后逐漸加入重量為培養(yǎng)上清液重量60％的硫酸銨。然后將產(chǎn)物在4℃下攪拌過夜。
(ii)脫鹽將(i)中獲得的溶液以8,000rpm離心20min，棄去上清液。向得到的沉淀物加入并且浸沒在15mL 20mM Tris/500mM NaCl(下文中稱為Tris溶液)中4℃過夜進行溶解。然后將得到的溶液加至用于透析的纖維素管中(Sanko Junyaku Co.，Ltd.生產(chǎn))，用Tris溶液作為外部溶液在4℃下透析進行脫鹽(外部溶液每6小時更換一次)。
(iii)金屬螯合柱使用His-Bind(Novagen生產(chǎn))作為金屬螯合柱載體。柱的調(diào)整、加樣和洗滌步驟都按照供應(yīng)商推薦的方法在4℃下進行。作為目標的His標簽融合的VL蛋白的洗脫用500mM咪唑/Tris溶液進行。
洗脫液的SDS-PAGE(丙烯酰胺15％)證實該洗脫液具有一條帶，并且被純化。用Tris溶液作為外部溶液再次透析該洗脫液，以除去該洗脫液中的咪唑。此外，通過將外部溶液更換為磷酸鹽緩沖液(下文稱為PBS)進行緩沖液的替換，以制備用于SPR的VL蛋白溶液。
實施例7(SPR測定)實施例6獲得的VL蛋白的金結(jié)合親和力利用SPR測定。BIAcore2000(BIAcore制造)用作SPR測定裝置。同一家公司的金沉積的玻璃基板SIA-kit Au用作與該蛋白質(zhì)結(jié)合的金基板。
測定在下列條件下進行。
運行緩沖液PBST溫度25℃流速20μL/min樣品VL蛋白/PBST注射量20μL獲得證實結(jié)合親和力的結(jié)合曲線(圖9)。
實施例8(VL蛋白的堿基和氨基酸序列的測定)按照下列方法測定如上所述獲得的VL No.7的DNA序列。
測序引物設(shè)置在VL編碼基因上游的pelB序列部分。測序引物如下。
pelB-back(SEQ ID No88)5′-ccgct ggatt gttat tactc gc-3′以與實施例2相同的方法使用上述引物和測序反應(yīng)試劑盒和供應(yīng)商推薦的反應(yīng)溶液組合物進行BigDye-PCR反應(yīng)。溫度循環(huán)為96℃×3min→(94℃×1min→50℃×1min→68℃×4min)×30個循環(huán)→4℃。然后利用測序儀(377，ABI制造)測定通過乙醇沉淀純化的PCR產(chǎn)物的堿基序列。獲得如下結(jié)果。No.7具有與實施例12的SEQ ID No76相同的堿基序列。
實施例9(親金VH-展示噬菌體組的篩選)根據(jù)下列方法制備VH-展示噬菌體文庫，以選擇具有金結(jié)合親和力的噬菌體組。
(1)用于展示VH的噬菌粒以與實施例1相同的方法，使用來源于成人外周血B淋巴細胞的Fab文庫作為模板，以與實施例1相同的方法使用SEQ ID No.80至89的引物。這樣，VH編碼基因被復(fù)制。而且，用作M13噬菌體外殼蛋白的PIII蛋白的N末端部分缺失，并且使用以使得VH蛋白融合并且表達的方式制備的展示VH的噬菌粒文庫(圖12A)。
(2)展示VH的噬菌體文庫的制備除了使用(1)中獲得的產(chǎn)物以外，展示VH的噬菌體文庫以與實施例5之(2)相同的方法制備。得到的展示VH的噬菌體文庫溶液1×109cfu/μL。
(3)使用金細粒的VH淘選除了使用以上(2)中制備的噬菌體文庫溶液以外，用于選擇展示金結(jié)合VH的噬菌體組的淘選以與實施例5之(3)相同的方法進行。
1)結(jié)合實驗下面進行了類似于實施例5之2)的洗滌和之3)的酸洗脫和滴度評價。
第1輪9.8×102cfu第2輪1.0×103cfu第3輪7.8×102cfu4)再感染和噬菌體擴增再感染和噬菌體擴增以與實施例5相同的方法進行。擴增后獲得的滴度值如下所示。
第1輪2.4×109cfu第2輪8.1×108cfu(4)噬菌體ELISA1)用于ELISA的金沉積基板的制備使用與實施例5相同的基板作為用于噬菌體ELISA的基板。
2)展示VL的噬菌體單克隆的制備按照與實施例1相同的方法從VH淘選操作第3輪滴度評價中104倍稀釋平板上表達的20個菌落中收集噬菌粒。得到的展示VH的噬菌體單克隆溶液的滴度值如下所示。
No.13.8×109cfuNo.29.0×108cfuNo.32.4×109cfuNo.41.0×109cfuNo.59.7×107cfuNo.64.4×108cfuNo.76.2×109cfuNo.88.9×107cfuNo.91.4×109cfuNo.101.1×1010cfuNo.114.9×109cfuNo.129.0×108cfuNo.132.4×109cfuNo.141.0×109cfuNo.159.7×107cfuNo.164.4×108cfuNo.176.2×109cfuNo.188.9×107cfuNo.191.4×109cfuNo.201.1×1010cfu3)噬菌體溶液的制備使用2)中獲得的每種噬菌體溶液制備各200μL稀釋系列，其中根據(jù)下列組成將滴度值從109cfu以10倍連續(xù)降低。
展示VL的噬菌體溶液xμL可溶性VL溶液(50ng)xμLSuper封閉緩沖液(PIERCE)20μL0.5％Tween 20/PBSx/5μLPBS179-(6x/5)μL
4)噬菌體ELISA噬菌體ELISA通過與實施例1相同的操作進行。提供發(fā)光強度均高于用于比較的VH文庫溶液的3個克隆作為金結(jié)合的展示VH的噬菌體克隆(Nos.2、4和6)。
實施例10(親金VH蛋白的獲得)從上述三個噬菌體克隆中分離噬菌粒，然后制備其表達載體以表達蛋白質(zhì)，從而在表面等離振子共振(SPR)金基板上證實結(jié)合親和力。此外，闡明了這些金結(jié)合VH的各自的堿基和氨基酸序列。
(1)噬菌粒的收集根據(jù)如下程序從對應(yīng)于第三輪滴度評價中在104倍稀釋平板上表達的15個克隆的菌落中收集噬菌粒。
(a)每個菌落在1.6mL LB/amp.中37℃培養(yǎng)過夜。
(b)利用MiniPreps SV plus DNA純化系統(tǒng)(promega)，根據(jù)供應(yīng)商推薦的方法收集噬菌粒。
(2)表達載體的制備表達上述3種VL蛋白的表達載體根據(jù)下列結(jié)構(gòu)構(gòu)建。
通過改變PET-15b(Novagen)的多克隆位點制備pUT-XX。pUT-XX和以上(1)中獲得的噬菌粒各自使用NcoI和NotI通過限制性內(nèi)切酶反應(yīng)切割。將得到的VH片段插入pUT-XX中制備質(zhì)粒pRA-7sn(n上述噬菌體克隆編號)，該質(zhì)粒將VH編碼核酸表達為融合蛋白(圖14)。
(3)蛋白質(zhì)的表達和純化通過進行上述程序(在各系統(tǒng)中在下面所述的蛋白質(zhì)表達和純化步驟中處理表達載體)獲得3種VH(7s2、7s4和7s6)。
1)轉(zhuǎn)化用上述2種表達載體轉(zhuǎn)化40μL不同的BL21(DE3)感受態(tài)細胞溶液。在如下條件下進行轉(zhuǎn)化在冰中→42℃×90sec→在冰中進行熱休克。將750μL LB培養(yǎng)基加入通過熱休克轉(zhuǎn)化的BL21溶液中，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)1小時。之后以6,000rpm離心5min，棄去650μL培養(yǎng)上清液。將剩余的培養(yǎng)上清液和作為沉淀物的細胞部分攪拌并且接種到LB/amp.平板上，整體置于37℃過夜。
2)預(yù)培養(yǎng)隨機選擇平板上的菌落，用3.0mL LB/amp.培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)過夜。
3)主培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)液在750ML 2×YT培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，在28℃下繼續(xù)培養(yǎng)。當OD600大于0.8時，加入IPTG至終濃度為1mM，在28℃下培養(yǎng)過夜。
4)純化通過下列步驟從不溶性顆粒部分中純化目標多肽鏈。
(i)不溶性顆粒的收集以上3)中獲得的培養(yǎng)液以6,000rpm離心30min，以獲得沉淀物作為細菌部分。將產(chǎn)物懸浮于冰中的Tris溶液(20mM Tris/500mMNaCl)中。得到的懸浮液用弗氏壓碎器勻漿，以獲得勻漿溶液。然后，以12,000rpm離心勻漿溶液15min，除去上清液獲得沉淀物作為不溶性顆粒部分。
(ii)不溶性顆粒部分的溶解向(i)中獲得的不溶性部分加入并且浸沒在10mL 6M鹽酸胍/Tris溶液中過夜。然后產(chǎn)物以12,000rpm離心10min以獲得上清液作為溶解的溶液。
(iii)金屬螯合柱使用His-Bind(Novagen生產(chǎn))作為金屬螯合柱載體。柱的調(diào)整、加樣和洗滌步驟都按照供應(yīng)商推薦的方法在室溫(20℃)下進行。作為目標的His標簽融合的VL蛋白的洗脫用60mM咪唑/Tris溶液進行。洗脫液的SDS-PAGE(丙烯酰胺15％)證實該洗脫液具有一條帶，并且被純化。
(iv)透析使用6M鹽酸胍/Tris溶液作為外部溶液在4℃下透析上述洗脫液，以除去洗脫液中的咪唑，從而獲得上述多肽鏈溶液。
(v)重折疊按照與上述相同的方法，VHg-VLh和VHh-VLg的多肽鏈溶液分別按照下列用于除去鹽酸胍的步驟透析(4℃)，以進行蛋白質(zhì)的重折疊。
a)根據(jù)每種多肽鏈的摩爾吸收系數(shù)和ΔO.D.(280nm-320nm)水平，使用6M鹽酸胍/Tris溶液制備濃度為7.5μM的樣品(稀釋后的體積為10ml)。然后加入β-巰基乙醇(還原劑)至終濃度為375μM(50-倍蛋白質(zhì)濃縮)，用于在暗室中在室溫下還原4小時。將樣品溶液加入透析袋(MWCO14,000)中，提供作為用于透析的樣品。
b)將用于透析的樣品浸沒在作為外部溶液的6M鹽酸胍/Tris溶液中，在輕輕攪拌下透析6小時。
c)以分步方式將外部溶液的鹽酸胍溶液濃度減至3M，然后減至2M。樣品在每一濃度的外部溶液中透析6小時。
d)向Tris溶液中加入終濃度為375μM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和終濃度為0.4M的L-Arg，然后加入以上3)中的2M透析外部溶液，使鹽酸胍濃度為1M。樣品在pH已經(jīng)用NaOH調(diào)節(jié)為8.0(4℃)的外部溶液中在輕輕攪拌下透析12小時。
e)通過與d)相同的操作制備鹽酸胍濃度為0.5M的L-Arg Tris溶液，并且再透析12小時。
f)最后，在Tris溶液中透析12小時。透析7)完成后，以10,000rpm離心約20分鐘，以分離聚集物和上清液。
通過將外部溶液改變?yōu)榱姿峋彌_液(下文中稱為PBS)將如上所述獲得的3種VH溶液進行緩沖液更換，以制備用于SPR的VH蛋白溶液。
實施例11(SPR測定)實施例10中獲得的VH蛋白的金結(jié)合親和力以與實施例7相同的方法利用SPR測定。對于7s2、7s4和7s6獲得證實結(jié)合親和力的結(jié)合曲線。圖10顯示代表性實施例。通過曲線擬合獲得下列KD。
7s2KD＝5.0×10M-8
7s4KD＝8.0×10M-97s6KD＝3.0×10M-7實施例12(VH蛋白的堿基和氨基酸序列的測定)如上所述獲得的3個展示VH的噬菌粒各自的DNA序列通過與實施例2相同的方法測定。測序引物設(shè)置于位于VH編碼基因上游的pelB序列部分。使用實施例2的測序引物，并且根據(jù)相同的程序進行透析，獲得三種不同的序列。實施例10中獲得的那些序列對應(yīng)于SEQ ID No.59至61。
實施例13(利用SPR對VH/VL復(fù)合物進行的金結(jié)合實驗)制備PBST溶液，其中含有各50nM實施例6中獲得的VL克隆No.7和實施例10中獲得的VH克隆7s2，并且在4℃下保持一天。SPR測定按照與實施例7相同的方法用混合溶液進行。結(jié)果，在比實施例7或?qū)嵤├?1更低的濃度下證實有金結(jié)合親和力。該結(jié)果提示克隆的混合形成復(fù)合物(Fv)，由于其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而提高了結(jié)合親和力(圖3)。
實施例14(金結(jié)合scFv的獲得)按照如下程序制備由實施例6中獲得的VL克隆No.7和實施例10中獲得的VH克隆7s2組成的scFv。
(1)表達載體的制備能夠表達融合蛋白的表達載體，能夠由VL(No.7)編碼基因、接頭(GGGGS)×3、VH(7s4)編碼基因和His×6(下文稱為His標簽)連續(xù)翻譯。
一種具體制備方法在圖15中顯示。
使用下列引物。
scFv-B(SEQ ID No117)5′-NNNNNCCATGGCCGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGGGGCAGCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT-3′scFv-F(SEQ ID No118)5′-NNNNNCCGCGGAACCATTCAGATCCTCTTCT-3′
(2)蛋白質(zhì)的表達和純化下面使用如上所述獲得的用于表達scFv蛋白的載體表達和純化scFv蛋白。
1)蛋白質(zhì)表達用上述表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，使用2xYT培養(yǎng)基在28℃下進行培養(yǎng)。在O.D.600＝約0.8時用終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)表達，產(chǎn)物振蕩培養(yǎng)過夜。細菌體以6,000rpm離心20min獲得培養(yǎng)上清液部分和細菌部分。這些樣品根據(jù)公知的方法電穿孔，利用SDS-PAGE證實目標蛋白質(zhì)的表達量。結(jié)果表明向培養(yǎng)上清液部分中的分泌極少。鑒于此，為了從細菌部分中純化目標蛋白，按照下列程序制備樣品。首先，將細菌體重懸浮于15mL PBS中，向該懸浮液中進一步添加25mL PBS，利用弗氏壓碎器將該混合物勻漿。得到的勻漿溶液以12,000rpm離心15min獲得作為不溶性顆粒的沉淀部分。將得到的不溶性顆粒浸入6M鹽酸胍/Tris溶液中過夜，并且溶解，獲得用于金屬螯合柱的樣品。
2)通過金屬螯合柱純化用6M鹽酸胍/5mM咪唑/Tris溶液作為運行緩沖液，以與實施例2相同的方法進行純化，不同之處為洗脫時的咪唑濃度設(shè)置為100mM；展開溫度設(shè)置為室溫(20℃)。
3)透析將2)中獲得的洗脫級分加到用于透析的纖維素管中(SankoJunyaku Co.，Ltd.制造)，使用6M鹽酸胍/1mM EDTA/Tris溶液作為外部溶液在4℃下透析(每6小時更換一次外部溶液)。
4)蛋白質(zhì)的重建用Tris溶液將3)中獲得的scFv溶液調(diào)節(jié)為7.5μM，提供作為模板。重建scFv結(jié)構(gòu)，同時通過相對于上述溶液減少外部溶液中的鹽酸甘氨酸濃度逐漸降低內(nèi)部溶液中的鹽酸胍濃度。
(a)使用6M鹽酸胍/Tris溶液制備濃度為7.5μM的樣品，其摩爾吸收系數(shù)和O.D.(280nm)根據(jù)目標蛋白質(zhì)的氨基酸序列估計。
(b)然后加入β-巰基乙醇(還原劑)至終濃度為375μM，然后在暗室中在室溫下還原4小時。
(c)將樣品裝入如上所述相同的透析袋中，整體置于外部溶液(6M鹽酸胍/Tris溶液)中，4℃透析約6小時。
(d)之后每6小時更換外部溶液，共兩次。更換時，在樣品透析的同時，以分步方式將外部溶液的鹽酸胍溶液濃度減至3M，然后減至2M。
(e)然后向Tris溶液中加入氧化型谷胱甘肽(GSSG)至終濃度為375μM以及L-Arg至終濃度為0.4M，然后添加以上(d)中的透析外部溶液(2M)至鹽酸胍濃度為1M。樣品在pH已經(jīng)用NaOH調(diào)節(jié)為8.0(4℃)的外部溶液中透析約12小時。
(f)按照與(e)相同的操作制備0.5M鹽酸胍/Tris溶液，并且在4℃下透析約12小時。
(g)最后，在4℃下透析約12小時，同時將外部溶液換為Tris溶液。
(h)透析完成后，產(chǎn)物以10,000rpm離心約20min，以分離聚集部分和上清液部分。該上清液部分進行SDS-PAGE電泳，以證實目標蛋白質(zhì)在上清液部分中為可溶的。結(jié)果獲得了具有VL No.7克隆和VH 7s2的scFv。
實施例15(利用SPR評價scFv的金結(jié)合親和力)實施例14中獲得的scFv蛋白的金結(jié)合親和力利用SPR按照與實施例8相同的方法測定。獲得顯示金結(jié)合親和力的結(jié)合曲線(圖17)。
實施例16(Au特異性的證實)證實了實施例15中獲得的scFv蛋白的金特異性。將金以大小為70μmφ(厚度為50nm)的環(huán)形模式沉積在大小為3mm×5mm的硅基板上作為確證基板?；灞砻嬉来谓诋惐?、丙酮和鹽酸中，每種溶液10分鐘，進行表面清洗(每次更換溶液時，表面用去離子水清洗并且干燥)。基板浸沒在通過將實施例6中獲得的scFv溶液調(diào)節(jié)至1μM而制備的溶液中1小時。然后，在PBST中輕輕攪拌10分鐘清洗基板。該操作重復(fù)3次，然后棄去洗滌溶液。然后將基板浸沒在100nM抗-His標簽抗體/PBST溶液中，同時在該溶液中輕輕攪拌1小時。然后，在PBST中輕輕攪拌10分鐘清洗基板。該操作重復(fù)3次，然后棄去洗滌溶液。此外，將基板浸沒在100μM視紫紅質(zhì)結(jié)合的抗-IGg抗體/PBST溶液中，同時在該溶液中輕輕攪拌1小時。然后在PBST中輕輕攪拌10分鐘清洗基板。該操作重復(fù)3次，然后棄去洗滌溶液。之后，用熒光顯微鏡觀察該基板。結(jié)果，在沉積有金的環(huán)形部分觀察到熒光，而在硅部分沒有觀察到熒光。因此，實施例15中獲得的scFv的金特異性得到證實。
比較實施例1金沉積的硅基板按照與實施例16相同的操作進行處理，不同之處在于該基板用1μM scFv處理。用熒光顯微鏡觀察該基板，結(jié)果在硅部分和沉積有金的環(huán)形部分都沒有觀察到熒光。
實施例17(親氧化硅肽融合的金結(jié)合蛋白的制備)在上述實施例的scFv的C末端具有親氧化硅肽IPHVHHKHPHV的蛋白質(zhì)按照下列步驟制備。
(1)表達載體的制備(a)以上述實施例(實施例14)中獲得的pUT-scFv(VL#No，7×7s4)作為模板，利用下列引物進行PCR。
SiscFv-B(SEQ ID No119)5′-NNNNNCCATGGCCCAGGTGCAGTTGGTGGAGT-3′SiscFv-F(SEQ ID No120)5′-NNNNNCCGCGGCACGTGGGGGTGCTTGTGGTGCACGTGCATGGGGATAACCATTCAGATCCTCTTCT-3′利用商業(yè)上可獲得的PCR試劑盒(TAKARA BIO INC，LA-標簽試劑盒)按照供應(yīng)商推薦的方案進行PCR。
(b)得到的PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖電泳。然后，應(yīng)用凝膠提取試劑盒(Promega)通過粗純化從凝膠中獲得約400bp的PCR片段。序列證實該片段具有目標堿基序列。
(c)pUT-scFv(7s4)和以上(b)中獲得的PCR片段用NotI/SacII酶切。然后進行瓊脂糖電泳以純化載體側(cè)和插入側(cè)的目標片段。
(d)將以上(c)中獲得的純化的核酸片段以載體∶插入片段＝1∶5的比例混合，然后以與實施例1相同的方法進行連接反應(yīng)。
下面，通過與實施例6相同的方法進行轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的收集和插入片段的證實。
(3)蛋白質(zhì)的表達和純化蛋白質(zhì)的表達和純化使用如上所述獲得的用于表達的質(zhì)粒通過與實施例10相同的方法進行，從而獲得目標蛋白質(zhì)。
實施例18(金-和HEL-結(jié)合蛋白的獲得)(1)金結(jié)合VH編碼核酸片段的調(diào)節(jié)使用下列引物gVH-B(SEQ ID No121)5′-NNNNN CCATGG CCGAC CAGG TGCAG TTGGT GGAGT CT-3′gVH-F(SEQ ID No122)5′NNNNN GCTAG C GGAGA CGG TGACCAGGGT-3′制備金結(jié)合的VH(下文稱為VHg)，用于引入一種載體，該載體在金結(jié)合的VH(SEQ ID No61)的5’末端側(cè)排列有限制性內(nèi)切酶NcoI酶切位點，在其3′末端側(cè)排列有限制性內(nèi)切酶NheI酶切位點。然后，按照供應(yīng)商推薦的比例使用商業(yè)上可獲得的PCR試劑盒進行PCR，獲得約350bp的堿基對。使用商業(yè)上可獲得的測序反應(yīng)試劑盒和反應(yīng)溶液組合物，利用上述VHB-F進行BigDye-PCR反應(yīng)。溫度循環(huán)設(shè)置為96℃×3min→(94℃×1min→50℃×1min→68℃×4min)×30個循環(huán)→4℃，以證實獲得了含有編碼目標VH的堿基序列的片段。
(2)金結(jié)合VL編碼核酸片段的調(diào)節(jié)按照與(1)相同的方法獲得核酸片段，不同之處在于使用下列引物
gVL-B(SEQ ID No123)NNNNN GCTAGC GGTGGCGGTGGCTCT GAAATTGTGTT GACGCAGTCT，和gVL-F(SEQ ID No124)NNNNN CCGCG GCACG TTTAA TCTCC AGTCG TGT制備金結(jié)合的VL(下文稱為VLg)(SEQ ID No99)，用于插入一種載體，該載體在金結(jié)合的VL(SEQ ID No76)的5′末端側(cè)排列有限制性內(nèi)切酶NheI酶切位點和編碼接頭(GGGGS)的核酸，并且在其3′末端側(cè)排列有His×6和限制性內(nèi)切酶SacII酶切位點，從而證實獲得了具有目標VL的堿基序列的片段。
(3)HEL-結(jié)合VH編碼核酸片段的調(diào)節(jié)按照與(1)相同的方法獲得核酸片段，不同之處在于使用下列引物hVH-B(SEQ ID No126)5′-NNNNN CCATGG CCGAC GATATCCAGCTGCAGGAGTCGGGCCC-3′，和hVH-F(SEQ ID No127)5′NNNNN GCTAG C GGAGA CGG TGACGTCTGT-3制備HEL-結(jié)合的VH(下文稱為VHh)，用于引入一種載體，該載體在HEL-結(jié)合的VH(SEQ ID No125)的5′末端側(cè)排列有限制性內(nèi)切酶NcoI酶切位點，并且在其3′末端側(cè)排列有限制性內(nèi)切酶NheI酶切位點，從而證實該片段具有目標VL的堿基序列。
(4)HEL-結(jié)合VL編碼核酸片段的調(diào)節(jié)按照與(1)相同的方法獲得核酸片段，不同之處在于使用下列引物hVL-B(SEQ ID No129)NNNNNGCTAGCGGTGGCGGTGGCTCTGATATCGTCCTGACCCAGAG，和hVL-F(SEQ ID No130)NNNNN CCGCG GCCTT GATCT CCAGC TTGGT GC制備HEL-結(jié)合的VL(下文稱為VLh)，用于引入一種載體，該載體在HEL-結(jié)合的VL(SEQ ID No128)的5′末端側(cè)排列有限制性內(nèi)切酶NheI酶切位點和編碼接頭(GGGGS)的核酸，并且在其3′末端側(cè)排列有His×6和限制性內(nèi)切酶SacII酶切位點，從而證實該片段具有目標VL的堿基序列。
實施例19(表達載體的制備)使用以上4種核酸片段根據(jù)下列結(jié)構(gòu)構(gòu)建2種表達載體。
(1)用于表達VHg-VLh的載體(pGHEL)的制備(圖15)(i)VHg的插入質(zhì)粒pUT-XX用限制性內(nèi)切酶NcoI/NheI(均由New EnglandBiolabs生產(chǎn))切割，并且經(jīng)過自旋柱400HR(Amasham Science)。然后用限制性內(nèi)切酶NcoI/NheI類似地切割VHg，酶切片段用商業(yè)上可獲得的凝膠純化試劑盒(SV Gel and PCR Clean-up系統(tǒng)Promega)純化。上述2個片段用商業(yè)上可獲得的T4連接酶試劑盒(Roche)按照供應(yīng)商推薦的方法混合，然后連接。
用連接溶液通過熱休克轉(zhuǎn)化40μL JM109感受態(tài)細胞(Promega)。將產(chǎn)物接種在LB/氨芐青霉素(amp.)平板上，整體置于37℃過夜。
然后將平板上的任一菌落在3mL液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。之后，利用商業(yè)上可獲得的MiniPreps試劑盒(Plus Minipreps DNA純化系統(tǒng)Promega)收集質(zhì)粒。
使用gVH-F通過測序方法證實得到的質(zhì)粒的堿基序列。這樣證實了目標片段已經(jīng)插入。
(ii)VLH的插入以上1)中獲得的質(zhì)粒pUT-VHg用限制性內(nèi)切酶NheI/SacII切割，并且過自旋柱400HR(Amasham Science)。然后，類似地用限制性內(nèi)切酶NheI/SacII切割VLh。然后按照與以上(a)相同的方法進行連接，證實獲得了用于表達VHg-VLH的質(zhì)粒(用于證實的引物為hVL-F)。
(2)用于表達VHh-VLg的載體(pHGOLD)的制備(圖16)(iii)VHh的插入按照與以上(i)相同的方法將VHh插入質(zhì)粒pUT中，證實得到的質(zhì)粒為目標質(zhì)粒(用于證實的引物為hVH-F)。
(iv)VLg的插入按照與以上(b)相同的方法將VLg插入以上(iii)獲得的質(zhì)粒中，通過與1)相同的方式證實得到的質(zhì)粒為用于表達VHH-VLg的目標載體pHGOLD(用于證實的引物為gVL-F)。
實施例20(蛋白質(zhì)的表達和純化)用于表達實施例19之(ii)中獲得的VHg-VLh和實施例19之(iv)中獲得的VHh-VLg的多肽鏈的表達載體在各自的系統(tǒng)中通過下面所述的表達和純化蛋白質(zhì)的步驟進行處理，獲得為多肽鏈VHg-VLh和VHh-VLg。
1)轉(zhuǎn)化用上述表達載體轉(zhuǎn)化不同的40μL BL21(DE3)感受態(tài)細胞溶液。在如下條件下進行轉(zhuǎn)化在冰中→42℃×90sec→冰中進行熱休克。將750μL LB培養(yǎng)基加入通過熱休克轉(zhuǎn)化的BL21溶液中，整體在37℃下振蕩培養(yǎng)1小時。之后，以6,000rpm離心5min，棄去650μL培養(yǎng)上清液。剩余的培養(yǎng)上清液和作為沉淀物的細胞部分進行攪拌并且接種到LB/amp.平板上，整體置于37℃過夜。
2)預(yù)培養(yǎng)隨機選擇平板上的菌落，在3.0mL LB/amp.培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)過夜。
3)主培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)液在750ML 2×YT培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，在28℃下繼續(xù)培養(yǎng)。當OD600大于0.8時，加入IPTG至終濃度為1mM，在28℃下培養(yǎng)過夜。
4)純化通過以下步驟從不溶性顆粒部分中純化目標多肽鏈。
(i)不溶性顆粒的收集將以上3)中獲得的培養(yǎng)液以6,000rpm離心30min獲得沉淀物作為細菌部分。將產(chǎn)物懸浮在置于冰中的15ml Tris溶液(20mMTris/500mM NaCl)中。得到的懸浮液用弗氏壓碎器勻漿，獲得細菌勻漿溶液。然后將細菌勻漿溶液以12,000rpm離心15min，除去上清液，獲得沉淀物作為不溶性顆粒部分。
(ii)不溶性顆粒部分的溶解向以上(i)中獲得的不溶性部分加入并且浸沒在10mL 6M鹽酸胍/Tris溶液中過夜。然后產(chǎn)物以12,000rpm離心10min，獲得上清液作為溶解的溶液。
(iii)金屬螯合柱使用His-Bind(Novagen生產(chǎn))作為金屬螯合柱載體。柱的調(diào)整、加樣和洗滌步驟都按照供應(yīng)商推薦的方法在室溫(20℃)下進行。作為目標的His標簽融合多肽鏈的洗脫用60mM咪唑/Tris溶液進行。洗脫液的SDS-PAGE(丙烯酰胺15％)證實該洗脫液具有一條帶，并且被純化。
(iv)透析使用6M鹽酸胍/Tris溶液作為外部溶液在4℃下透析上述洗脫液，以除去洗脫液中的咪唑，從而獲得上述各個多肽鏈溶液。
(v)重折疊按照與上述相同的方法，VHg-VLh和VHh-VLg的多肽鏈溶液分別按照下列步驟使用脫氯化氫的胍透析(4℃)，進行蛋白質(zhì)的重折疊。
(a)根據(jù)每種多肽鏈的摩爾吸收系數(shù)和ΔO.D.(280nm-320nm)，使用6M鹽酸胍/Tris溶液制備濃度為7.5μM的樣品(稀釋后的體積為10ml)。然后加入β-巰基乙醇(還原劑)至終濃度為375μM(50-倍蛋白質(zhì)濃縮)，然后在暗室中在室溫下還原4小時。將樣品溶液加入透析袋(MWCO14,000)中，提供作為用于透析的樣品。
(b)將用于透析的樣品浸沒在作為外部溶液的6M鹽酸胍/Tris溶液中，在輕輕攪拌下透析6小時。
(c)以分步方式將外部溶液的鹽酸胍溶液濃度減至3M，然后減至2M。樣品在每一濃度的外部溶液中透析6小時。
(d)向Tris溶液中加入終濃度為375μM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和終濃度為0.4M的L-Arg，然后加入以上(c)中的2M透析外部溶液，使鹽酸胍濃度為1M。樣品在pH已經(jīng)用NaOH調(diào)節(jié)為8.0(4℃)的外部溶液中在輕輕攪拌下透析12小時。
(e)通過與(d)相同的操作制備鹽酸胍濃度為0.5M的L-ArgTris溶液，并且再透析12小時。
(f)最后，在Tris溶液中透析12小時。
(g)透析完成后，以10,000rpm離心約20分鐘，以分離聚集物和上清液。
(vi)二聚化級分的純化將以上(v)中獲得的各5μM多肽鏈(VHg-VLh，VHh-VLg)溶液混合，并且置于4℃下過夜。然后獲得在Sephadex 75柱(柱緩沖液20mM Tris，500mM NaCl，流速1ml/min)中二聚化的相當于60kDa的級分(從注射起約18分鐘)。這提供了用于SPR測定的樣品。
實施例21(通過SPR測定評價金結(jié)合親和力)實施例20中獲得的二聚化蛋白質(zhì)級分對于金的結(jié)合親和力利用SPR測定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作為SPR測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA-kit Au作為金基板(該級分結(jié)合到上面)。在下列條件下進行測定。使用500 nM(如上所述根據(jù)吸光度計算)實施例15中獲得的二聚化蛋白質(zhì)級分作為樣品。
運行緩沖液0.1％Tween 20/Tris溶液TBST溫度25℃流速20μL/min樣品注射量40μL獲得顯示金結(jié)合親和力的結(jié)合曲線(圖18)。
實施例22(通過SPR測定評價對HEL的結(jié)合親和力)樣品在實施例21中進行了金結(jié)合親和力的SPR評價后，繼續(xù)注射1μM HEL溶液，利用SPR測定金結(jié)合的二聚化蛋白質(zhì)級分對HEL的結(jié)合親和力。獲得顯示對于HEL的結(jié)合親和力的結(jié)合曲線(圖18)。
實施例23(Au特異性的證實)實施例22中獲得的，金結(jié)合蛋白和HEL已經(jīng)結(jié)合到上面的SPR芯片的金基板，接著用來進行如下實驗。向上述金基板注射1μM抗-HEL抗體/PBST溶液。之后，用該基板用PBST清洗。而且，向該基板注射1μM視紫紅質(zhì)結(jié)合的抗-IGg抗體/PBST溶液。之后，該基板用PBST洗滌。從SPR裝置中取出上述SPR芯片，用熒光顯微鏡觀察該基板。結(jié)果，在金基板上的SPR的流動通道上觀察到熒光。
比較實施例2使用未用過的金沉積基板進行與實施例23相同的操作。結(jié)果，在金基板上沒有觀察到熒光。
實施例24制備通過實施例20之(i)至(v)的步驟獲得的重旋的多肽鏈，獲得5μM VHg-VLh/Tris溶液。
實施例25實施例24中獲得的VHg-VLh/Tris溶液用Tris溶液稀釋至500nM，按照與實施例20相同的方法評價對金基板的結(jié)合親和力。而且，繼續(xù)注射1μM HEL溶液，以測定金結(jié)合的二聚化蛋白質(zhì)級分對HEL的結(jié)合親和力。獲得顯示對金和HEL的結(jié)合親和力的結(jié)合曲線。
實施例26在實施例25中，使0.5μM抗-HEL抗體VL/Tris溶液共存，整體靜置過夜，制備樣品。
實施例27按照與實施例15相同的方法，通過SPR評價實施例26制備的樣品對金基板的結(jié)合親和力。而且，按照與實施例16相同的方法，繼續(xù)注射1μM HEL，以便通過SPR測定對樣品的結(jié)合親和力。獲得顯示結(jié)合親和力的結(jié)合曲線。
實施例28(HEL檢測免疫色譜裝置的準備)用于檢測HEL的免疫色譜裝置如檢測本發(fā)明方法的實施例所述準備。
1)用于免疫層析的、上面固定有抗-HEL抗體的多孔載體的制備將硝酸纖維素片(BAS-85，Schleicher & Schuell生產(chǎn))切成5mm×30mm的小片。在距小片末端10mm處以0.5mg/mL的量直線施加0.5mg/mL抗-HEL抗體溶液(Nippon Biotest Labo生產(chǎn))，從而制備檢測位點。將該小片置于室溫下2小時，使液體干燥，由此將抗體固定在小片上。該小片在1％脫脂奶(Difco生產(chǎn))/PBST溶液中振蕩2小時，封閉。之后，將小片置于室溫下，制備用于免疫層析的載體。
2)金標抗-HEL抗體片段和反載體(hold-back carrier)的制備(i)金標抗-HEL抗體片段的制備使用實施例20制備的金/HEL雙特異性抗體片段，按照下列步驟制備如題所述的片段。
加入金細粒(粒徑50nm，Tanaka Kikinzoku生產(chǎn))分散體，與實施例20制備的金/HEL雙特異性抗體片段充分混合，在室溫下反應(yīng)3小時。產(chǎn)物以12,000rpm離心5min，以除去未反應(yīng)的金/HEL雙特異性抗體片段，然后除去上清液，獲得沉淀物。將得到的沉淀物懸浮于1.0mL PBST中。并且在上述條件下進行離心。將得到的沉淀物懸浮在1.0mL 1％BSA/PBST中。
(ii)金標抗-HEL抗體片段反載體的制備使大小為5mm×5mm的Bemliese無紡布(Asahi KaseiCorporation制造)浸漬5μL金標抗-HEL抗體片段溶液和5μL各種堿基的10％水溶液，風干，制備金標抗-HEL抗體片段反載體。
3)試片(test piece)型免疫層析裝置的準備將以上2)(ii)中制備的金標抗-HEL抗體片段反載體與以上1)中制備的用于免疫層析的載體在距該用于免疫層析的載體一端可達2.5mm處重疊。并且，將用于浸漬液體樣品的載體(526號濾紙，Advantec Toyo生產(chǎn))與該抗體片段反載體重疊。另外，將用于浸漬過量樣品部分的載體(526號濾紙)與用于免疫層析的載體在距該用于免疫層析的載體另一端可達5mm處重疊。最后，用膠帶粘貼于后側(cè)以穩(wěn)定此整體，由此制成了試片型免疫層析裝置。使用標準HEL溶液的測試證實抗-HEL抗體固定部分呈紅色。
實施例29(電測量儀器的準備)顯示了使用金電極檢測蛋白質(zhì)的方法的一個實施例。
1)將2個金電極置于玻璃基板上。兩個電極之間的距離設(shè)置為20μm。將20μL 0.1％聚-L-賴氨酸(Sigma-Aldrich)水溶液滴加至電極之間的空隙上，整體放置3小時。
然后，用水洗滌該基板。之后，該基板用乙醇洗滌3次并且干燥。
2)然后，根據(jù)Proteomics，3，pp254(2003)所述，將抗-HEL多克隆抗體(ROCKLAND)固定在以上(a)中獲得的玻璃基板上，3)使實施例20制備的金/HEL雙特異性抗體片段的PBST溶液和20-nm金納米顆粒(Tanaka Kikinzoku生產(chǎn))相互反應(yīng)(PBST溶液用于比較)。
4)向1)中獲得的固定有抗-HEL抗體的基板上添加1μMHEL/PBS溶液。
5)然后，向3)中獲得的產(chǎn)物中加入2)中獲得的金結(jié)合蛋白溶液。
6)將4)中獲得的基板用PBS溶液洗滌3次。之后，將該基板浸在銀增強溶液(Sigma-Chemical)中5分鐘，然后用水洗滌。證實與僅有PBST的對比樣品相比，電極之間的電阻降低。
實施例30(用于在酵母中表達VHg-VHh蛋白的載體的制備)(1)NheI-VHh-SacII片段的制備用實施例19中制備的pHGold作為模板通過PCR制備在其末端具有NheI/SacII的VHh片段。
使用如下引物。
NheI-VHh_f(SEQ ID No131)NNNNNGCTAGCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT
VHh-sacII_r(SEQ ID No132)NNNNNCCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT按照供應(yīng)商推薦的方法用上述引物進行pfu-turbo的PCR。得到的PCR反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠(2％)電泳，證實獲得了約350bp的片段。
(2)VHg-VHh DNA片段的制備將以上(1)中獲得的VHh片段引入實施例19中制備的pGHEL的VLh部分中。
將(1)中獲得的PCR片段和pGHEL用NheI/SacII(均由TAKARABIO INC.生產(chǎn))切割。限制性內(nèi)切酶反應(yīng)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員推薦的方法進行。將得到的反應(yīng)溶液進行瓊脂糖電泳，然后凝膠純化(PCR片段瓊脂糖2％，pGHEL瓊脂糖1％)。凝膠純化使用上述凝膠純化試劑盒。
已經(jīng)證實，如上所述在限制性內(nèi)切酶反應(yīng)后獲得的PCR片段具有約350bp的PCR片段和3,000bp的質(zhì)粒片段，下面按照與實施例19相同的方法獲得一種新質(zhì)粒。
利用測序儀測定得到的質(zhì)粒的堿基序列，以證實其堿基序列為目標堿基序列(該質(zhì)粒被命名為pHgHh)。
(3)酵母表達質(zhì)粒的插入按照供應(yīng)商推薦的相同方法進行PCR。
用pPCIZαA(Invitrogen)作為酵母(巴斯德畢赤酵母(Pichiapastris))表達質(zhì)粒。利用EcoRI和SacII在該質(zhì)粒的多克隆位點處引入靶基因。
使用(2)中獲得的pHgHh作為模板，通過PCR制備將要引入的基因。
引物為，7s4-fW-EcoRls(SEQ ID No133)AAGCTGAATTCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTHELVH-SacII-r(SEQ ID No134)
NNNNNCCGCGGAGACGGTGACGAGGGT得到的PCR片段和pPCIZαA用EcoRI和SacII依次切割，通過凝膠純化按照上述相同的方法獲得每個目標片段。
按照上述方法進行連接。連接反應(yīng)溶液按照與上述相同的方法轉(zhuǎn)化，并且接種于瓊脂平板上。在此情況下的瓊脂平板為色氨酸10g/酵母提取物5g/NaCl 5g/瓊脂15g/L中添加Zeocin至濃度為25μg/L。在此條件下選擇的菌落在液體培養(yǎng)基(色氨酸10g/酵母提取物5g/NaCl 15g，Zeocin 25μg/L)中37℃培養(yǎng)過夜。收集質(zhì)粒后，利用測序儀證實序列，獲得表達VHg-VHhVH_金接頭(GGGGS)-VH_HEL的質(zhì)粒作為該實施例的目標(提供為pPCIZ-αHH)。
實施例31(VHg-VHh蛋白的表達/純化)VHg-VHh的表達使用Easy select Pichia表達試劑盒Ver.G(Invitrogen)進行。轉(zhuǎn)化子的制備和蛋白質(zhì)的制備和純化(金屬螯合柱)均按照本領(lǐng)域技術(shù)人員推薦的方法進行。通過金屬螯合柱獲得的5mL 1M咪唑洗脫級分用Tris緩沖液(20mM Tris/200mM NaCl，1mM EGTApH 7.9)作為外部溶液在4℃下透析。每6小時更換一次外部溶液，總共更換3次。
隨后使用Sephadex75(Amasham Bioscience)，在4℃下通過凝膠過濾進行純化(緩沖液條件50mM Tris-HCl，200mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0，流速0.7mL/min)。獲得的級分濃縮后，使用SDS-PAGE(丙烯酰胺17.5％)和HRP-融合的抗-His抗體進行與上述相同的western印跡分析。從而指示了目標蛋白質(zhì)的級分，并且純化為單一條帶。分級分離提示該級分為約25kDa的單體蛋白質(zhì)的峰，然后進行如下的評價(圖19)。
實施例32(利用SPR評價對金的結(jié)合親和力)實施例31中獲得的蛋白質(zhì)級分對金的結(jié)合親和力利用SPR測定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作為SPR測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA-kit Au作為結(jié)合該級分的金基板。在下列條件下進行測定。使用500nM(如上所述根據(jù)吸光度計算)實施例20中獲得的蛋白質(zhì)級分作為樣品。該實施例的條件與實施例21相同。獲得顯示金結(jié)合親和力的結(jié)合曲線(圖20)。
實施例33(VHg-VHh蛋白變體-1的制備)以實施例30中獲得的質(zhì)粒pPCIZ-α7s4作為模板，使用QC試劑盒(STRATAGENE生產(chǎn))獲得VHg變體(SEQ ID No135或136)用作實施例30的金結(jié)合VH的V37L、G44E和L45R。使用如下引物通過3次操作獲得目標質(zhì)粒。連續(xù)地，每次操作向一個位點插入突變。
用于向第一位點插入突變的PCR引物V37F-f(SEQ ID No137)TTACTGGATCAACTGGTTCCGCCAGATGCCCGGV37F-r(SEQ ID No138)CCGGGCATCTGGCGGAACCAGTTGATCCAGTAA用于向第二位點引入突變的PCR引物G44E-f(SEQ ID No139)CAGATGCCCGGCAAAGAACTGGAATGGATGGGGG44E-r(SEQ ID No140)CCCCATCCATTCCAGTTCTTTGCCGGGCATCTG用于向第三位點引入突變的PCR引物L45F-f(SEQ ID No141)GCCCGGCAAAGAAAGGGAATGGATGGGGATGL45F-r(SEQ ID No142)CATCCCCATCCATTCCCTTTCTTTGCCGGGC突變的插入根據(jù)序列證實。從轉(zhuǎn)化到蛋白質(zhì)表達的程序與實施例31相同。使用約25kDa的單體蛋白質(zhì)峰進行如下的評價。
實施例34(利用SPR評價對金的結(jié)合親和力)實施例33中獲得的蛋白質(zhì)級分對金的結(jié)合親和力利用SPR測定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作為SPR測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA-kit Au作為結(jié)合該級分的金基板。在下列條件下進行測定。使用500nM(如上所述根據(jù)吸光度計算)實施例33中獲得的蛋白質(zhì)級分作為樣品。該實施例的條件與實施例21相同。獲得顯示金結(jié)合親和力的結(jié)合曲線(圖21)。
實施例35(VHg-HEL scFv蛋白變體的制備)進行替換，以獲得與HEL結(jié)合的scFv(SEQ ID No143或144)融合而不是與實施例31的HEL結(jié)合VH融合的蛋白質(zhì)。使用Journalof Biological chemistry，2003，279，pp8979所示的已經(jīng)引入HEL結(jié)合scFv編碼基因的質(zhì)粒作為模板，通過PCR獲得編碼HEL結(jié)合的scFv的DNA片段。PCR按照與本領(lǐng)域技術(shù)人員所推薦的相同的方法進行，并且使用下列引物。
scFv-f(SEQ ID No145)NNNNCCATGCCCGATATCGTCCTGACCCAGscFv-r(SEQ ID No146)AGCTACCGCGGAGACGGTGACGAGGGT限制性內(nèi)切酶反應(yīng)之后的程序與實施例30相同，由此獲得目標質(zhì)粒。
根據(jù)序列證實得到的質(zhì)粒含有靶基因序列。從轉(zhuǎn)化到蛋白質(zhì)表達的程序與實施例31相同。這樣獲得了約39kDa的單體蛋白質(zhì)。
實施例36(利用SPR評價對金和HEL的雙結(jié)合親和力)實施例35中獲得的蛋白質(zhì)級分對金的結(jié)合親和力利用SPR測定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作為SPR測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA-kit Au作為結(jié)合該級分的金基板。在下列條件下進行測定。使用500nM(如上所述根據(jù)吸光度計算)實施例31中獲得的蛋白質(zhì)級分作為樣品。該實施例的條件與實施例21和22相同。獲得顯示金結(jié)合親和力的結(jié)合曲線(圖22)。
實施例37(用于表達VHg變體-VLh的質(zhì)粒的制備)將由SEQ ID No147和148表示的DNA序列引入實施例19中獲得的表達質(zhì)粒(pGHEL)的金結(jié)合VH編碼序列中。一種插入方法包括使用上述Quick Change試劑盒(Stratagene)，并且用pGHEL作為模板。已經(jīng)證實獲得的質(zhì)粒具有靶序列。然后，按照與實施例20相同的方法利用獲得的質(zhì)粒進行蛋白質(zhì)的表達和純化以及與VHh-VLg的二聚化。
分子量約為50kDa的蛋白質(zhì)級分利用SephadexG75分級分離(圖23)。
A14P-f(SEQ ID No147)GAGCAGAGGTGAAAAAGCCAGGGGAGTCTCTGAAGA14P-r(SEQ ID No148)CTTCAGAGACTCCCCTGGCTTTTTCACCTCTGCTC實施例38(利用SPR評價對金和HEL的雙結(jié)合親和力)實施例37中獲得的蛋白質(zhì)級分對金的結(jié)合親和力利用SPR測定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作為SPR測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA-kit Au作為結(jié)合該級分的金基板。在下列條件下進行測定。使用500nM(如上所述根據(jù)吸光度計算)實施例37中獲得的蛋白質(zhì)級分作為樣品。該實施例的條件與實施例21相同。獲得顯示金結(jié)合親和力的結(jié)合曲線(圖24)。
實施例39(表達VHg-VLg四聚體的質(zhì)粒的制備)除了將實施例30的VHh更換為VHg編碼基因片段以外，按照與實施例30相同的方法制備pPCIZ-αVHg2。
用實施例10中獲得的pRA2-7s4作為模板用于制備在上述操作中使用的編碼VHg的DNA片段，并且使用下列引物作為引物VHg-f(SEQ ID No149)NNNNNGCTAGC GGCGGGGGCGGTAGC CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTVHg-r(SEQ ID No150)NNNNNCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT。
根據(jù)序列證實獲得了目標質(zhì)粒。
實施例40(VHg-VLg蛋白的制備)靶蛋白通過與實施例31相同的步驟純化。純化由VHg-VHg二聚體組成的分子量約為25kDa的蛋白質(zhì)(圖25)。
實施例41(表達VHg-VLg四聚體的質(zhì)粒的制備)除了將用于連接實施例39的VHg-VHg的接頭GGGGS更換為GS以外，按照與實施例30相同的方法制備pPCIZ-αVHg4。
實施例10中獲得的pRA2-7s4作為模板用于制備在上述操作中使用的編碼VHg的DNA片段，并且使用下列引物作為引物VHg4-f(SEQ ID No151)NNNNNGCTAGC GGCAGC CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTVHg4-r(SEQ ID No152)NNNNNCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT。
根據(jù)序列證實獲得了目標質(zhì)粒。
實施例42(金細粒凝集反應(yīng))在實施例40和44中獲得的每種蛋白質(zhì)的500μM/PBST溶液中，金細粒(20nmφTanaka Kikinzoku生產(chǎn))在室溫下溫育。無論使用哪種蛋白質(zhì)都觀察到金細粒的凝集。另外，還觀察到金細粒/蛋白質(zhì)混合物的光譜(λmax)隨時間變化，觀察到擴大半個帶寬。獲得的結(jié)果提示金細粒之間的距離縮短(圖26)。
比較實施例3使用500nM BSA代替500nM HEL進行與實施例36相同的操作。與BSA的結(jié)合未被證實。顯示實施例35中獲得的對于金的蛋白質(zhì)以特異性方式與HEL結(jié)合(圖27)。
比較實施例4使用SPR測定法用抗-HEL抗體(Rockland生產(chǎn))評價直接固定在金基板上的蛋白質(zhì)的結(jié)合能力。
(1)在PBS中制備10μM HEL(2)以1μl/min注射100μl在(1)中獲得的溶液。吸附的抗體的信號為1907 R.U.
(3)以與(2)相同的方式注射1％酪蛋白PBS溶液(4)進而，以20μl/ml注射40μl 1％酪蛋白PBS溶液，并且證實金基板被封閉。
(5)隨后以20μl/min注射40μl 1μM，獲得圖28所示的結(jié)果。
結(jié)果，鍵HEL分子的信號為11 R.U.，而固定在金基板上的抗體的信號為1907 R.U.?？紤]到固定處的結(jié)構(gòu)和假定一種抗體分子在基板上捕獲一種抗體，抗體捕獲靶物質(zhì)的速度計算為約6％。
另一方面，上述實施例顯示本發(fā)明的20-40％的蛋白質(zhì)捕獲抗原。而且，在上述實施例中捕獲傳感器分子的蛋白質(zhì)的固定不需要任何特殊試劑或過程，暗示本發(fā)明的固定方法優(yōu)于常規(guī)的物理吸附法。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供具有一個或多個金結(jié)合位點和特定物質(zhì)結(jié)合位點的金結(jié)合蛋白；包括上面固定有該金結(jié)合蛋白的金基板的結(jié)構(gòu)；和使用它們的檢測裝置。
在由上面固定了應(yīng)用本發(fā)明獲得的金結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)組成的檢測裝置中，該蛋白質(zhì)固定在特異性識別金的結(jié)合位點處作為基板。因此，識別特定物質(zhì)(靶物質(zhì))的蛋白質(zhì)的結(jié)合位點不固定在該基板上，而且該蛋白質(zhì)被定位，同時確保距基板的距離。結(jié)果，靶物質(zhì)結(jié)合位點使基板對其結(jié)合能力的影響最小化，由此該蛋白質(zhì)有效且高定位地固定在該基板上。
即，提示本發(fā)明能夠用于利用各種生物物質(zhì)的功能改善產(chǎn)品的性能，該生物物質(zhì)將有機物質(zhì)如生物物質(zhì)固定在基板表面，以利用該有機物質(zhì)的各種生理功能，該產(chǎn)品的代表為生物傳感器和生物反應(yīng)器。
同時，本發(fā)明提供了一種用于標記靶物質(zhì)的連接體，包括一個或多個與靶物質(zhì)結(jié)合的位點；和一個或多個與標記的物質(zhì)結(jié)合的位點，其特征在于各自的結(jié)合位點彼此獨立地與將要結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合。本發(fā)明的應(yīng)用使得能夠不使用常規(guī)化學(xué)交聯(lián)方法而標記靶蛋白。結(jié)果，對各種蛋白質(zhì)對靶物質(zhì)的結(jié)合親和力的影響，在標記時關(guān)心的影響，能夠最小化，并且能夠提高生產(chǎn)效率。即，本發(fā)明能夠用于利用各種生物物質(zhì)的功能改善產(chǎn)品的性能，該產(chǎn)品如生物傳感器，其將連接體固定在基板表面上，并且利用該連接體的各種生理功能。
本申請要求2004年3月31日申請的日本專利申請2004-108388號的優(yōu)先權(quán)，該日本申請在此引入作為參考。
序列表序列表<110>佳能株式會社<120>金結(jié)合蛋白及其用途<130>10001551WOCN01<150>JP2004-108388<151>2004-03-31<160>152<170>MS-WORD<210>1<211>5<212>PRT<213>人<400>5Asp Tyr Tyr Met Asp1 5<210>2<211>177<212>PRT<213>人<400>2Ser Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Thr Arg Tyr Gly Asp Ser Val Arg1 5 10 15Gly<210>3<211>9<212>PRT<213>人<400>3Glu Leu Asp Gly Gly Phe Phe Asp Phe1 51 5<210>4<211>5<212>PRT<213>人<400>4Gly His Trp Met His1<210>5<211>1717<212>PRT<213>人<400>5Arg Ile Asp Glu His Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val1 5 1 5 1015Asn Gly<210>6<211>15<212>PRT<213>人<400>6Leu Gly Phe Ile Thr Pro Glu Val Val His Trp Ser Ser Asp Ile1 5 10 151 5 1015<210>7<211>5<212>PRT<213>人<400>7Arg Phe Tyr Trp Asn1 5
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cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaatcctg acagtggtgg aacaaactat 180gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240atggacctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtat gttactgtgc gagagggtcc 300cgatataaca gtggctggta ttactttgac tactggagcc ggggaaccct ggtcaccgtc 360tcctca 366<210>113<211>360<212>DNA<213>人<220>
<223>d10p2<400>113caggtgcagc tacaggagtg gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60acctgcgctg tctctggtgg caccatcagc agtcctacct ggtggaattg ggtccgccag 120cccccaggga aggggctgga gtggattggc gaaatctatc atagtggaac ctcccaccac 180aacccgtccc tcaagaatcg agtcacctta tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240ctgaagctga actctatgac cgccgcggac acggccgtgt atttctgtac gagactggat 300ttcgattccc cactcggtat ggacgcctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360<210>114<211>327<212>DNA<213>人<220>
<223>dVL4<400>114gacatcgtga tgacccggtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc acctatttaa attggtatca gcagaaagca 120gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccctca 180aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcgaac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgtgcg 327<210>115<211>330<212>DNA<213>人<220>
<223>dVL7<400>115gaaattgtgt tgacgcagtc tccatcttct gtgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60atcacttgtc gggcgagtga ggatgttaac agctggttag cctggtatca gcagaagcca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt tcaaccaatt tgcaaggtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gacgtggatc tgggacacac tttactttca ccatcaacgg cctgcagcct 240gaagatattg caacatatta ctgtaaatat tttgatgctc tccctccggt caccttcggc 300caagggacac gactggagat taaacgtgcg 330<210>116<211>345<212>DNA<213>人<220>
<223>dVL10<400>116gacatcgtgc tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60atcaactgca cgtccagcca gagtctttta tacacctcca acaataagaa ctacttaact 120tggtaccaac agaaaccagg gcagcctcct aaactcctca tttactgggc atctacccgg 180gaattcggcg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240atcaacagcc tgcaggctga agatgtggcg acttattact gtcagcaata ttctgatcct 300cctcccactt tcggcggagg gaccaagctg gagatcaaac gtgcg 345<210>117<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>scFv-B<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>117nnnnnccatg gccgggggcg ggggcagcgg gggcgggggc agcgggggcg ggggcagcca 60ggtgcagttg gtggagtct79<210>118<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>scFv-F<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>118nnnnnccgcg gaaccattca gatcctcttc t 31<210>119<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SiscFv-B<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>119nnnnnccatg gcccaggtgc agttggtgga gt 32<210>120<211>6667<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SiscFv-F<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>120nnnnnccgcg gcacgtgggg gtgcttgtgg tgcacgtgca tggggataac cattcagatc 60ctcttct 6766<210>121<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>gVH-B<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>121nnnnnccatg gccgaccagg tgcagttggt ggagtct 37
<210>122<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>gVH-Phe<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>122nnnnncggcc gtgacggtga ccagggtgcc 30<210>123<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>gVL-B<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>123nnnnngctag cggtggcggt ggctctgaaa ttgtgttgac gcagtct 47<210>124<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>gVL-Phe<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>124nnnnnccgcg gcacgtttaa tctccagtcg tgt 33<210>125<211>112<212>PRT<213>雞<400>125Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln15 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Thr Thr Ser Asp15 10 15Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Met35 40 45Gly Tyr Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu65 70 75 80Asp Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Ash Trp Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser100 105 110<210>126<211>42<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>hVH-B<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>126nnnnnccatg gccgacgata tccagctgca ggagtcgggc cc 42<210>127<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hVH-Phe<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>127nnnnngctag cggagacggt gacgtctgt 29<210>128<211>108<212>PRT<213>雞<400>128Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly15 10 15Asn Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn20 25 30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Thr35 40 45Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr65 70 75 80Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Ala100 105<210>129<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hVL-B<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>129nnnnngctag cggtggcggt ggctctgata tcgtcctgac ccagag 46<210>130<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hVL-Phe
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>130nnnnnccgcg gccttgatct ccagcttggt gc 32<210>131<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NheI-VHh_f<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>131nnnnngctag ccaggtgcag ttggtggagt ct 32<210>132<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VHh-SacII_r<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>132nnnnncccgc ggatgaggag acggtgacca gggtt 35<210>133<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>7s4-fw-EcoRls<400>133aagctgaatt ccaggtgcag ttggtggagt ct 32<210>134<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HELVH-SacII-r<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>134nnnnnccgcg gagacggtga cgagggt27<210>135
<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FER-7s4編碼DNA<400>135caggtgcagt tggtggagtc tggagcagag gtgaaaaagg ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaagg gatctggata cagctttccc agttactgga tcaactggtt ccgccagatg120cccggcaaag aaagggaatg gatggggatg atctatcctg ctgactctga taccagatat180agcccgtcct tccaaggcca cgtcaccatc tcagccgaca agtccatcaa caccgcctac240ctgcaatggg ccggcctgaa ggcctcggac accgccatat attactgtgc gagacttgga300attggtggga ggtacatgtc tagatggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357<210>136<211>119<212>PRT<213>重組蛋白<220>
<223>FER-7s4<400>136Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ala Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Ser Tyr20 25 30Trp Ile Asn Trp Phe Arg Gln Met Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Met35 40 45Gly Met Ile Tyr Pro Ala Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ala Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Leu Gly Ile Gly Gly Arg Tyr Met Ser Arg Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>137<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>V37F-f<400>137ttactggatc aactggttcc gccagatgcc cgg 33<210>138<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>V37F-r<400>138ccgggcatct ggcggaacca gttgatccag taa 33<210>139<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>G44E-f<400>139cagatgcccg gcaaagaact ggaatggatg ggg 33<210>140<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>G44E-r<400>140ccccatccat tccagttctt tgccgggcat ctg 33<210>141<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>45F-f<400>141gcccggcaaa gaaagggaat ggatggggat g31<210>142<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>45F-r<400>142catccccatc cattcccttt ctttgccggg c31<210>143<211>708<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HEL結(jié)合的單鏈-Fv編碼DNA<400>143gatatcgtcc tgacccagag cccggcgacc ctctcggtca cccccggcaa ctcggtgtcc 60ctctcgtgcc gcgcctcgca gtcgatcggc aacaacctcc actggtatca gcagaagtcg120cacgagagcc cgcgcctcct gatcaagtac gccagccagt cgatctcggg gat cccgtcg 180cgcttcagcg gctcgggctc gggcaccgac ttcaccctgt cgatcaacag cgtcgagacg240gaggacttcg gcatgtactt ctgccagcag tcgaacagct ggccgtacac cttcggcggc300ggtaccaagc tgatcatcac ggccggcggg ggcggtagcg gcggtggcgg gtcgggcggt360
ggcggatcgg atatccagct gcaggagtcg ggcccgagcc tcgtcaagcc gtcgcagacc 420ctgtcgctca cctgcagcgt caccggcgac tcgatcacct cggactactg gtcgtggatc 480cgcaagttcc ccggcaaccg cctcgagtac atgggctacg tcagctactc gggcagcacc 540tactacaacc cctcgctgaa gagccgcatc tcgatcaccc gcgacacctc caagaaccag 600tactacctgg acctcaactc ggtcaccacc gaggacaccg ccacctacta ctgcgcgaac 660tgggacggcg actactgggg ccagggcacc ctcgtcaccg tctccgcg 708<210>144<211>236<212>PRT<213>重組蛋白<220>
<223>HEL結(jié)合的單鏈-Fv編碼DNA<400>144Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly1 5 10 15Asn Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser I1e Gly Asn Asn20 25 30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Gln Ser I1e Ser Gly I1e Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr65 70 75 80Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr Ala Gly Gly Gly Gly100 105 110Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Gln115 120 125Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr130 135 140Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Trp Ser Trp Ile145 150 155 160Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Met Gly Tyr Val Ser Tyr165 170 175Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile180 185 190Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Asp Leu Asn Ser Val195 200 205Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Asn Trp Asp Gly Asp210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala225 230 235<210>145<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>scFv-f<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(4)<223>n為a，c，g，或t<400>145nnnnccatgc ccgatatcgt cctgacccag 30<210>146<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>scFv-f<400>146agctaccgcg gagacggtga cgagggt 27<210>147<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>A14P-f<400>147gagcagaggt gaaaaagcca ggggagtctc tgaag35<210>148<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>A14P-r<400>148cttcagagae tcccctggct ttttcacctc tgctc35<210>149<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VHg-f<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>149nnnnngctag cggcgggggc ggtagccagg tgcagttggt ggagtct 47<210>150
<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VHg-r<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>150nnnnnccgcg gatgaggaga cggtgaccag ggtt 34<210>151<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VHg4-f<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>151nnnnngctag cggcagccag gtgcagttgg tggagtct 38<210>152<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VHg4-r<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>n為a，c，g，或t<400>152nnnnnccgcg gatgaggaga cggtgaccag ggtt 3權(quán)利要求
1.一種具有金親和力的蛋白質(zhì)，其包含抗體的至少一部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其包含金結(jié)合位點，該金結(jié)合位點含有抗體的至少一部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其中所述金結(jié)合位點包含選自F(ab’)2、Fab’、Fab和其一部分的至少一個。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其中所述金結(jié)合位點包含選自抗體可變區(qū)(Fv)和其一部分的至少一個。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)，其中所述金結(jié)合位點包含選自下列的至少一個(1)抗體重鏈可變區(qū)(VH)，其變體，和其一部分；和(2)抗體輕鏈可變區(qū)(VL)，其變體，和其一部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，其中所述抗體重鏈可變區(qū)(VH)包含SEQ ID NO.1至48中的至少一個氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，其中所述抗體重鏈可變區(qū)(VH)的變體含有在SEQ ID NO.1至48的氨基酸序列中具有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加的一種或多種氨基酸序列，并且具有金親和力。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)(VL)包含SEQ ID NO.49至57中的至少一個氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)(VL)的變體含有在SEQ ID NO.49至57的氨基酸序列中具有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加的一種或多種氨基酸序列，并且具有金親和力。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中解離常數(shù)為10-6M或更低。
11.一種金結(jié)合復(fù)合蛋白，包含(1)第一結(jié)構(gòu)域，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的具有金親和力的蛋白質(zhì)；和(2)第二結(jié)構(gòu)域，其含有具有對某些物質(zhì)的結(jié)合位點的蛋白質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的金結(jié)合復(fù)合蛋白，進一步包含與第一結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物的第三結(jié)構(gòu)域和與第二結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物的第四結(jié)構(gòu)域中的至少一個。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的金結(jié)合復(fù)合蛋白，其中所述第三結(jié)構(gòu)域具有金親和力。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的金結(jié)合復(fù)合蛋白，包含下列結(jié)構(gòu)(1)至(7)中的任一個(1)第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域形成一條多肽鏈；(2)第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域通過一個或多個氨基酸結(jié)合；(3)第三結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域形成一條多肽鏈；(4)第三結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域通過一個或多個氨基酸結(jié)合；(5)至少第一結(jié)構(gòu)域、第二結(jié)構(gòu)域和第三結(jié)構(gòu)域形成一條多肽鏈；(6)至少第一結(jié)構(gòu)域、第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域形成一條多肽鏈；和(7)第一結(jié)構(gòu)域至第四結(jié)構(gòu)域的全部形成一條多肽鏈。
15.一種包含基板和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其中該基板在其表面的至少一部分中含有金，該蛋白質(zhì)包括根據(jù)權(quán)利要求11的金結(jié)合復(fù)合蛋白。
16.一種包含基板和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其中該基板在其表面的至少一部分中含有金，該蛋白質(zhì)包括根據(jù)權(quán)利要求12的金結(jié)合復(fù)合蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的結(jié)構(gòu)，其中所述第二結(jié)構(gòu)域具有對靶物質(zhì)的親和力。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的結(jié)構(gòu)，其中第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域中的至少一個具有對靶物質(zhì)的親和力。
19.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求11的金結(jié)合復(fù)合蛋白的核酸。
20.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求12的金結(jié)合復(fù)合蛋白的核酸。
21.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求13的金結(jié)合復(fù)合蛋白的核酸。
22.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求14的金結(jié)合復(fù)合蛋白的核酸。
23.一種含有根據(jù)權(quán)利要求19的核酸的載體。
24.一種含有根據(jù)權(quán)利要求20的核酸的載體。
25.一種含有根據(jù)權(quán)利要求21的核酸的載體。
26.一種含有根據(jù)權(quán)利要求22的核酸的載體。
27.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求15的結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟(1)制備所述基板；(2)生產(chǎn)所述金結(jié)合復(fù)合蛋白；和(3)將該金結(jié)合復(fù)合蛋白排列在該基板上。
28.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求16的結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟(1)制備所述基板；(2)生產(chǎn)所述金結(jié)合復(fù)合蛋白；和(3)將該金結(jié)合復(fù)合蛋白排列在該基板上。
29.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求27的結(jié)構(gòu)的方法，其中通過將含有編碼所述金結(jié)合復(fù)合蛋白的核酸的載體導(dǎo)入宿主細胞中，從而表達含有該金結(jié)合復(fù)合蛋白的多肽鏈，進行金結(jié)合復(fù)合蛋白的生產(chǎn)。
30.一種檢測靶物質(zhì)的試劑盒，包括用于形成根據(jù)權(quán)利要求15的結(jié)構(gòu)的基板和金結(jié)合復(fù)合蛋白，以及用于檢測靶物質(zhì)與該結(jié)構(gòu)的結(jié)合的檢測工具。
31.一種檢測靶物質(zhì)的試劑盒，包括用于形成根據(jù)權(quán)利要求16的結(jié)構(gòu)的基板和金結(jié)合復(fù)合蛋白，以及用于檢測靶物質(zhì)與該結(jié)構(gòu)的結(jié)合的檢測工具。
32.一種用于以標記劑標記靶物質(zhì)的連接體，包含一個或多個與靶物質(zhì)結(jié)合的位點，和一個或多個與標記劑結(jié)合的位點，其中與靶物質(zhì)結(jié)合的位點和與標記劑結(jié)合的位點各自獨立地與將要結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合；且與標記劑結(jié)合的位點和與靶物質(zhì)結(jié)合的位點中的至少一個含有根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的蛋白質(zhì)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的連接體，其中所述標記劑或所述靶物質(zhì)含有至少一種或多種含有金的金屬、金屬氧化物和半導(dǎo)體化合物。
34.一種檢測靶物質(zhì)的方法，其中該靶物質(zhì)與標記劑結(jié)合并且被其標記，以檢測與該標記劑結(jié)合的靶物質(zhì)，包括以下步驟將該標記劑通過根據(jù)權(quán)利要求32的連接體與該靶物質(zhì)結(jié)合。
35.一種用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒，包括含有金的標記劑；根據(jù)權(quán)利要求31的連接體；和用于檢測該標記劑與靶物質(zhì)通過該連接體結(jié)合的狀態(tài)的檢測工具。
全文摘要
構(gòu)建了一種利用抗金抗體和作為抗金抗體一部分的金結(jié)合側(cè)面的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)能夠與金特異性結(jié)合。該蛋白質(zhì)或含有該蛋白質(zhì)的復(fù)合蛋白能夠用于檢測靶物質(zhì)。
文檔編號G01N33/53GK1946741SQ200580010519
公開日2007年4月11日 申請日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月31日
發(fā)明者鹽塚秀則, 今村剛士, 熊谷泉 申請人:佳能株式會社