專利名稱：選擇蛋白酶抗性多肽的方法
背景技術(shù)：
多肽和肽在許多應(yīng)用中成為越來越重要的試劑,包括工業(yè)應(yīng)用和作為醫(yī)學(xué)、治療 和診斷試劑的用途。然而，在某些生理狀態(tài)例如炎癥性狀態(tài)(例如，C0PD)和癌癥中，組織、 器官或動物(例如，在肺部、腫瘤內(nèi)或鄰近于腫瘤)中存在的蛋白酶的數(shù)量可能增加。這種 蛋白酶的增加會導(dǎo)致內(nèi)源蛋白質(zhì)以及被施用來治療疾病的治療肽、多肽和蛋白質(zhì)加速的降 解和失活。因此,對體內(nèi)使用(例如,用于在哺乳動物例如人類中治療、診斷或預(yù)防疾病) 具有潛力的某些藥劑僅僅具有有限的功效，因為它們被蛋白酶快速降解和滅活。
蛋白酶抗性多肽提供了幾種優(yōu)點。例如，蛋白酶抗性多肽在體內(nèi)能比蛋白酶敏感 性試劑保持更長時間的活性，因此，能將功能保持足以產(chǎn)生生物效應(yīng)的時間段。對于選擇對 蛋白酶降解有抗性并且還具有期望的生物活性的多肽的改進方法存在著需求。它對于提供 對胃腸道(Gr道)和/或肺系統(tǒng)的流體和組織中存在的蛋白酶有抗性的肽和多肽將是特別 有用的,所述系統(tǒng)包括肺。GI道和肺系統(tǒng)是哺乳動物例如人類中疾病和不利狀況的部位； 在這種情境下蛋白酶抗性肽和多肽藥物將是有益的。發(fā)明_既述本發(fā)明涉及選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方法，以及選擇以高親和力結(jié)合目標(biāo)配體 的肽或多肽的方法。本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生蛋白酶抗性肽或多肽的集(repertoire)的方在--個方面,本發(fā)明是選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方法。所述方法包括提供肽或 多肽的集、在適合蛋白酶活性的條件下組合所述集和蛋白酶、以及回收具有期望的生物學(xué) 活性的肽或多肽,從而選擇蛋白酶抗性肽或多肽。在一個實施方式中，所述蛋白酶在溶液中 與所述集組合(即，蛋白酶不固定在支持物上)。在一個實施方式中,所述期望的生物學(xué)活 性是結(jié)合活性,例如，對配體，如目標(biāo)配體或通用配體(generic ligand)的結(jié)合活性。在一個方面，本發(fā)明提供了從肽或多肽的集中選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方法，提供肽或多肽的集；在適合蛋白酶活性的條件下組合所述集和蛋白酶；以及回收具有期望的生物學(xué)活性的肽或多肽，從而選擇蛋白酶抗性肽或多肽，其中所述蛋白酶選自在痰、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液)、支氣管肺 泡灌洗液、肺勻漿、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液或淚液中存在的蛋白酶，以及所述期望的生物學(xué)活性是結(jié)合活性。因而，所述蛋白酶存在于痰、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液)、支氣管肺 泡灌洗液、肺勻漿、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液或淚液的一種或更多種中。在一個實施 方式中,所述蛋白酶是在眼和/或淚液中存在的蛋白酶。如以上討論的，選擇的蛋白酶抗性 肽或多肽在哺乳動物例如人類中疾病或狀況的治療、預(yù)防和診斷中是有用的。特別地,所述 肽和多肽作為在施用給患者例如人類時可能遭遇蛋白酶的藥物的基礎(chǔ)是有用的。例如，當(dāng) 施用給GI道(例如，口服、舌下給藥、直腸施用)時，在這種情況下，肽或多肽可能經(jīng)受上部
7GI道、下部GI道、口腔、胃部、小腸和大腸的一種或更多種中的蛋白酶。因而,一個實施方式 提供了將要口服、舌F或直腸地施用到患者的GI道來治療和/或預(yù)防所述患者中的疾病或 狀況的蛋白酶抗性肽或多肽。例如，通過本發(fā)明的方法選擇或可選擇的TNF a拮抗劑肽或 多肽的口服施用,用于治療和/或預(yù)防TNF a介導(dǎo)的狀況或疾病，例如關(guān)節(jié)炎(例如,類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎)、IBD、銀屑病或Crohn's病。在這個實施方式中，所述拮抗劑可以是抗-TNFR1 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(dAb)。在另一個實例中，當(dāng)施用(例如，通過吸入或鼻內(nèi)地)到 肺部組織(例如，肺或氣道)中時,所述肽或多肽可能遭遇蛋白酶。因而，一個實施方式提 供了將要通過吸入或鼻內(nèi)地施用到患者的肺部組織來治療和/或預(yù)防所述患者中的疾病 或狀況的蛋白酶抗性肽或多肽。這樣的狀況可以是哮喘(例如，過敏性哮喘)、C0PD、流感 或在W02006038027中公幵的任何其他肺部疾病或狀況，通過引用合并在此。根據(jù)本發(fā)明的 肽和多肽可以顯示改善的或相對高的解鏈溫度(Tm)，提供提高的穩(wěn)定性。高親和力目標(biāo)結(jié) 合也可以是所述肽和多肽的特征。這些特征,與蛋白酶抗性組合，使得所述肽和多肽能夠用 作哺乳動物例如人類中的藥物，其中例如對于GI道或肺部組織施用可能遭遇到蛋白酶。在另一個實例中，所述肽或多肽(例如，可變結(jié)構(gòu)域或拮抗劑)當(dāng)施用給患者的眼 睛時(通過眼內(nèi)注射或作為滴眼劑)可能遭遇蛋白酶。因而，一個實施方式提供了蛋白酶 抗性肽、多肽、免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或拮抗劑向患者(例如，向人類)的眼施用,來治療 和/'或預(yù)防所述患者中的疾病或狀況(例如，眼的疾病或狀況)。施用可以是以滴眼劑的形 式，或通過注射到眼中，例如，注射到玻璃體液中向眼的局部施用。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于遞送到肺部的肺部制劑，其中所述制劑包 含本發(fā)明的拮抗劑、肽、多肽或可變結(jié)構(gòu)域,其顆粒大小范圍低于5微米，例如低于4. 5、4、 3. 5或3微米(例如，當(dāng)在Britton-Robinson緩沖液中時，例如在6. 5到8. 0的pH值下,例 如在7到7. 5的pH值F，例如在PH 7下或在pH 7. 5下)。在一個實施方式中，本發(fā)明的制劑和組合物以6. 5到8. 0，例如7到7. 5，例如7，例 如7. 5的pH值來提供。根據(jù)本發(fā)明的任何方面的肽或多肽(例如,可變結(jié)構(gòu)域)可以具有至少50°C、或至 少55°C、或至少60°C、或至少65°C、或至少70°C的Tm。本發(fā)明的拮抗劑、用途、方法、組合 在本發(fā)明的一個方面中,本發(fā)明的肽、多肽、可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑、組合物或制劑在 Britton-Robinson緩沖液中在37至50°C下孵育14天后(在lmg/ml的多肽或可變結(jié)構(gòu)域 濃度下)基本上是穩(wěn)定的。在一個實施方式中，在37tTF這樣的孵育后，至少65、70、75、80、 85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的肽、多肽、拮抗劑或可變結(jié)構(gòu)域保持未 聚集。在一個實施方式中，在37°C下這樣的孵育后，至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99%的肽、多肽或可變結(jié)構(gòu)域保持單體。在一個實施方式中，在 50°C下這樣的孵育后，至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、 87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的肽、多肽、拮抗劑或可變結(jié)構(gòu)域保持未聚集。 在一個實施方式中，在50°C下這樣的孵育后,至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的肽、多肽或可變結(jié)構(gòu) 域保持單體。在一個實施方式中，在任一個這樣的孵育后，未看到肽、多肽、可變結(jié)構(gòu)域、拮 抗劑的聚集。在一個實施方式中，在37°C下在Britton-Robinson緩沖液中以lmg/ml的多肽或可變結(jié)構(gòu)域濃度孵育后，所述肽、多肽或可變結(jié)構(gòu)域的Pi保持不變或基本上不變。在本發(fā)明的一個方面中，本發(fā)明的肽、多肽、可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑、組合物或制劑在 Britton-Robinson緩沖液中在7至7. 5的pH(例如，在pH7或pH7. 5)在4°C下孵育7天 后(在lOOmg/ral的多肽或可變結(jié)構(gòu)域濃度下)基本上是穩(wěn)定的。在一個實施方式中，在這 樣的孵育后，至少95,95. 5,96,96. 5,97,97. 5,98,98. 5、99或99. 5%的肽、多肽、拮抗劑或 可變結(jié)構(gòu)域保持未聚集。在一個實施方式中，在這樣的孵育后，至少95、95. 5,96,96. 5、97、
97.5、98、98. 5,99或99. 5%的肽、多肽或可變結(jié)構(gòu)域保持單體。在一個實施方式中，在任一 個這樣的孵育后,未看到肽、多肽、可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑的聚集。在本發(fā)明的一個方面中,本發(fā)明的肽、多肽、可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑、組合物或制劑在 例如噴射噴霧器，例如在Pari LC+杯中，例如，在室溫、20°C或37°C下噴霧1小時后(在 40mg/ml的多肽或可變結(jié)構(gòu)域濃度下)基本上是穩(wěn)定的。在一個實施方式中，在這樣的噴 霧后，至少 65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95. 5、96、96. 5、97、97. 5、98、
98.5、99或99. 5%的肽、多肽、拮抗劑或可變結(jié)構(gòu)域保持未聚集。在一個實施方式中，在 這樣的噴霧后，至少 65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95. 5,96,96. 5、97、 97. 5,98,98. 5、99或99. 5%的肽、多肽或可變結(jié)構(gòu)域保持單體。在一個實施方式中，在任一 個這樣的噴霧后，未看到肽、多肽、可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑的聚集。所述肽或多肽可以是分離的和/或重組的。在另一個方面，本發(fā)明提供了從肽或多肽的集中選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方 法，包括提供肽或多肽的集；在適合蛋白酶活性的條件下組合所述集和蛋白酶；以及回收具有期望的生物學(xué)活性的肽或多肽，從而選擇蛋白酶抗性肽或多肽。其中所述期望的生物學(xué)活性是結(jié)合活性，例如，對目標(biāo)配體或通用配體的結(jié)合活在--個實施方式中,在本發(fā)明的方法中，所述蛋白酶是非細菌的蛋白酶。在一個實 施方式中，所述蛋白酶是動物，例如，哺乳動物，例如人類的蛋白酶。在一個實施方式中，所 述蛋白酶是GI道蛋白酶，或肺部組織蛋白酶，例如，在人類中存在的GI道蛋白酶或肺部組 織蛋白酶。在一個方面,本發(fā)明提供了從肽或多肽的集中選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方法,提供肽或多肽的集；在適合蛋白酶活性的條件下組合所述集和蛋白酶；以及回收具有期望的生物學(xué)活性的肽或多肽,從而選擇蛋白酶抗性肽或多肽，其中所述條件是⑴約10 11 g/ml到約3mg/ml蛋白酶，(ii)約20°C到約40°C，和 (iii)至少約30分鐘。在一個實施方式中，這些嚴(yán)格的條件允許選擇具有高親和力和/或 改善的Tm的肽或多肽。在這樣的情況下,所述肽和多肽可以以單體形式顯示高親和力。在一個實施方式中,在本發(fā)明的方法中,對于適合于蛋白酶活性的所述條件,使用 約10到約100 u g/ml蛋白酶。對于適合于蛋白酶活性的所述條件，可以使用約30到約37°C 的溫度(例如，在約37°C下，或在約室溫下)。在一個實施方式中，所述集和蛋白酶可以組合至少約一小時(例如，約1小時,約兩小時或過夜)。在本發(fā)明的方法中,在一個實施方式 中，所述集和所述蛋白酶孵育至少約30分鐘的時間。在一個實施方式中，所述蛋白酶在約 100ug/ml下使用，所述組合的集和蛋白酶在約37°C下孵育至少約小時。在一個實施方式中，蛋白酶例如胰蛋白酶與可變結(jié)構(gòu)域的比例(在摩爾/摩爾的 基礎(chǔ)上)是8, 000至80, 000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域,例如當(dāng)C是10微克/ml時,所述比例是 800至80，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域；或當(dāng)C或C'是100微克/ml時，所述比例是8，000至 80，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，蛋白酶(例如，胰蛋白酶)與可變結(jié)構(gòu)域 的比例(在重量/重量，例如,微克/微克的基礎(chǔ)上)是16，000至160，000蛋白酶可變結(jié) 構(gòu)域,例如當(dāng)C是10微克/ml時,所述比例是1, 600至160，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域；或當(dāng) C或C'是100微克/ml時，所述比例是1，6000至160，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域。在一個實 施方式中，所述蛋白酶在至少100或1000微克/ml蛋白酶的濃度下使用。在所述方法中可以使用任何期望的蛋白酶,如以下的一種或更多種,絲氨酸蛋白 酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶(例如,羧肽 酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋 白酶、leucozyme、胰酶、凝血酶、纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶(例如’組織蛋白酶G)、蛋白 水解酶(proteinase)(例如，蛋白水解酶1、蛋白水解酶2、蛋白水解酶3)、嗜熱菌蛋白酶、 凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋 白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶 (ficain)、梭菌蛋白酶、actinidain、菠蘿蛋白酶和separase。在特定的實施方式中，所述 蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻漿或生物制 劑例如體外的完整細胞來提供蛋白酶。如果需要,所述方法進一步包括在完成孵育后將蛋 白酶抑制劑加入所述集和蛋白酶的組合中。在本發(fā)明的方法的一個實施方式中，當(dāng)與所述集組合時，所述蛋白酶處在溶液中。在一些實施方式中，基于結(jié)合活性回收具有期望的生物活性的肽或多肽。例如， 可以基于結(jié)合通用配體(如蛋白A、蛋白G或蛋白L)來回收肽或多肽。結(jié)合活性還可以是 對目標(biāo)配體的特異性結(jié)合。示例性目標(biāo)配體包括ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養(yǎng)蛋白-1、 CEA、CD40、CD40 配體、CD56、CD38、CD 138、EGF、EGF 受體、ENA-78、嗜酸細胞活化趨化因子 (Eotaxin)、嗜酸細胞活化趨化因子-2、Exodus-2、FAP a、FGF-酸性、FGF-堿性、成纖維細 胞生長因子-10、FLT3 配體、CXXXC 趨化因子(Fract.alkine) (CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、 GF-P 1、人血清白蛋白、胰島素、IFN-y、IGF-I、IGF-II、IL-1 a、IL-1 P、IL-1 受體、IL-1I 型受體、IL—2、IL—3、IL—4、IL—5、IL—6、IL—7、IL—8(72a. a.)、IL—8(77a. a.)、IL—9、IL—10、 IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、抑制素 a、抑制素 0、IP-10、角質(zhì) 形成細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦蛋白、LIF、淋巴細胞趨化因子、繆勒管抑制物質(zhì)、單核 細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白、M-CSF、MDC(67a. a.)、MDC(69a. a.)、MCP-1 (MCAF)、 MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a. a. )、MDC(69a. a. )、MIG、MIP-1 a、MIP-1 旦、MIP-’3 a、 MIP-3 ^、MIP-4、骨髓祖代抑制因子-1 (MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神經(jīng)生長因子、P -NGF、 NT-3、NT-4、制瘤素 M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1 a、SDF1 0、SCF、SCGF、 千細胞因子(SCF)、TARC、TGF- a、TGF- P、TGF-13 2、TGF- 3、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF- a、 TNF-卩、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TP0、VEGF、VEGF A、\,EGF B、VEGF C、VEGF D、\,EGF受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、GCP_2、GR0/MGSA、GR0-β、GRO_ γ、HCC1、1-309、HER UHER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、淀粉樣蛋白(例如，淀粉樣蛋白α )、MMP12、PDK1、IgE、 IL-13Rα 1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23IL-23R、 IL-25、CD2、CD4、CD 11 a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CIMO L、CD56、CD 138、ALK5、EGFR、 FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA, CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-I)、糜蛋白酶(chymase)、FGF,弗林 蛋白酶、內(nèi)皮縮血管肽-1、嗜酸細胞活化趨化因子(例如，嗜酸細胞活化趨化因子、嗜酸細 胞活化趨化因子-2、嗜酸細胞活化趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM-U I COS、IgE、IFNa、1-309、 整聯(lián)蛋白、L 選擇蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性白細胞彈性蛋白酶、骨橋蛋白、 0X-40、PARC、PD-U RANTES, SCF、SDF-U siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、 類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α 4 β 7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、alphavbeta6、 alphavbeta8、cMET、CD8、vWF、淀粉樣蛋白(例如，淀粉樣蛋白 α )、ΜΜΡ12、PDKl 和 IgE。
在特定的實施方式中，通過淘選來回收肽或多肽。在本發(fā)明的方法的一個實施方式中，當(dāng)在存在蛋白酶時所述集被暴露于配體(目 標(biāo)配體；通用配體)，并根據(jù)對所述配體的結(jié)合來選擇所述集的一個或更多個成員。在一些實施方式中，所述集包括展示系統(tǒng)。例如，展示系統(tǒng)可以是細菌噬菌體 (bacteriophage)展不、核糖體展不、乳液區(qū)室化(emulsioncorapartmentalization)禾口展 示、酵母展示、嘌呤霉素展示、細菌展示、在質(zhì)粒上展示或共價展示。優(yōu)選的展示系統(tǒng)與核酸 的編碼功能和由核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關(guān)。在特定的實施方式中，展示系統(tǒng) 含有可復(fù)制的遺傳包(genetic package)。在一些實施方式中，展示系統(tǒng)包括細菌噬菌體展示。例如,細菌噬菌體可以是fd、 M13、X、MS2或T7。在特定的實施方式中，細菌噬菌體展示系統(tǒng)是多價的。在一些實施方式 中，作為PlII融合蛋白來展示肽或多肽。在一個實施方式中，當(dāng)與所述蛋白酶孵育時，所述肽或多肽(例如，可變結(jié)構(gòu)域) 的集在細菌噬菌體上展示，例如，以IO6到IO13,例如IO8到IO12復(fù)制單位(感染性病毒顆 粒)的噬菌體(phage)庫大小。在其他實施方式中，所述方法進一步包括擴增編碼具有期望的生物活性的肽或多 肽的核酸。在特定的實施方式中，通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴增核 酸。在一些實施方式中，所述集是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的集。在特定的實施方式 中，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在更特定的實施方式中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域 是人重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在其他實施方式中，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在 特定的實施方式中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域是人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一個方面中，本發(fā)明是從肽或多肽的集中選擇以高親和性結(jié)合目標(biāo)配體的肽 或多肽的方法。該方法包括提供肽或多肽的集，在適于蛋白酶活性的條件F組合所述集和 蛋白酶并回收結(jié)合目標(biāo)配體的肽或多肽。通常將集和蛋白酶孵育至少約30分鐘的時間段。在該方法中可以使用任何期望 的蛋白酶,如以下的-一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基 蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme、胰酶、凝血酶、纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶(例如,組織蛋白酶G)、蛋白水解酶(例如,蛋白水解酶1、蛋白水解酶2、蛋白水解酶3)、嗜 熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶 4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果 蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、actinidain、菠蘿蛋白酶和separase。在特定的實施方式 中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻漿或生物 制劑來提供蛋白酶。如果需要，該方法進一步包括在完成孵育后將蛋白酶抑制劑加入集和 蛋白酶的組合中。
可以基于結(jié)合任何期望的目標(biāo)配體如在此公開的目標(biāo)配體來回收肽或多肽。在特 定的實施方式中,通過淘選來回收肽或多肽。根據(jù)本發(fā)明的....Ll述方法，當(dāng)所述期望的生物學(xué)活性是結(jié)合活性時，所結(jié)合的配體 (目標(biāo)配體；通用配體)與所述蛋白酶不是相同的。在一些實施方式中，所述集包括展示系統(tǒng)。例如,展示系統(tǒng)可以是細菌噬菌體展 示、核糖體展示、乳液區(qū)室化(emulsioncompart.mentalization)和展示、酵母展示、嘌呤霉 素展示、細菌展示、在質(zhì)粒上展示或共價展示。優(yōu)選的展示系統(tǒng)與核酸的編碼功能和由核酸 編碼的肽或多肽的功能性特征相關(guān)。在特定的實施方式中，展示系統(tǒng)含有可復(fù)制的遺傳包。在一些實施方式中，展示系統(tǒng)包括細菌噬菌體展示。例如,細菌噬菌體可以是fd、 M13、X、MS2或T7。在特定的實施方式中，細菌噬菌體展示系統(tǒng)是多價的。在一些實施方式 中，作為PlII融合蛋白來展示肽或多肽。在其他實施方式中，該方法進一步包括擴增編碼具有期望的生物活性的肽或多肽 的核酸。在特定的實施方式中,通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴增核酸。在一些實施方式中，所述集是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的集。在特定的實施方式 中，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在更特定的實施方式中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域 是人重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在其他實施方式中，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在 特定的實施方式中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域是人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一個方面中，本發(fā)明是生產(chǎn)蛋白酶抗性肽或多肽的集的方法。該方法包括提 供肽或多肽的集，在適于蛋白酶活性的條件F組合肽或多肽的集和蛋白酶，并回收復(fù)數(shù)種 具有期望的生物活性的肽或多肽，由此產(chǎn)生蛋白酶抗性肽或多肽的集。在一些實施方式中，將所述集和蛋白酶孵育至少約30分鐘的時間段。例如,在該 方法中所用的蛋白酶可以是以下的一種或更多種,絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨 酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme、胰酶、凝血酶、纖維蛋白溶酶、 組織蛋白酶(例如,組織蛋白酶G)、蛋白水解酶(例如，蛋白水解酶1、蛋白水解酶2、蛋白水 解酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(例如,胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱 天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白 酶、無花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、actinidain、菠蘿蛋白酶和separase。在特定的 實施方式中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻 漿或生物制劑來提供蛋白酶。如果需要,該方法進一步包括在完成孵育后將蛋白酶抑制劑 加入所述集和蛋白酶的組合中。在一些實施方式中，基于結(jié)合活性回收復(fù)數(shù)種具有期望的生物活性的肽或多肽。例如,可以基于結(jié)合通用配體(如蛋白A、蛋白G或蛋白L)來回收復(fù)數(shù)種肽或多肽。結(jié)合活 性還可以是對目標(biāo)配體，如本文所述的目標(biāo)配體的特異性結(jié)合。在特定的實施方式中，通過 淘選回收復(fù)數(shù)種具有期望的生物活性的肽或多肽。在一些實施方式中，集包括展示系統(tǒng)。例如,展示系統(tǒng)可以是細菌噬菌體展示、核糖體展示、乳液區(qū)室化(emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、嘌呤霉素展 示、細菌展示、在質(zhì)?！猼展示或共價展示。在特定的實施方式中，展示系統(tǒng)與核酸的編碼功 能和由核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關(guān)。在特定的實施方式中，展示系統(tǒng)含有可復(fù) 制的遺傳包。在--些實施方式中，展示系統(tǒng)包括細菌噬菌體展示。例如,細菌噬菌體可以是fd、 M13、X、MS2或T7。在特定的實施方式中，細菌噬菌體展示系統(tǒng)是多價的。在一些實施方式 中，作為pill融合蛋白來展示肽或多肽。在其他實施方式中，該方法進一步包括擴增編碼復(fù)數(shù)種具有期望的生物活性的肽 或多肽的核酸。在特定的實施方式中，通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴增 核酸。在一些實施方式中，所述集是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的集。在特定的實施方式 中，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在更特定的實施方式中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域 是人重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在其他實施方式中，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在 特定的實施方式中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域是人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一個方面中，本發(fā)明是從集中選擇蛋白酶抗性多肽的方法，該多肽包括結(jié)合 目標(biāo)配體的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(dAb)。在一個實施方式中，該方法包括提供含有多肽 集的噬菌體展示系統(tǒng),該多肽含有免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域,在適于蛋白酶活性的條件下， 將噬菌體展示系統(tǒng)和選自彈性蛋白酶、leucozyme和胰蛋白酶的蛋白酶組合，并回收展示了 含有結(jié)合目標(biāo)配體的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽的噬菌體。在一些實施方式中，以ΙΟΟμ g/ml來使用蛋白酶，并將組合的噬菌體展示系統(tǒng)和 蛋白酶在約37 °C下孵育過夜。在一些實施方式中，通過結(jié)合所述目標(biāo)來回收展示了含有結(jié)合目標(biāo)配體的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽的噬菌體。在其他實施方式中，通過淘選來回收展示了含有結(jié)合 目標(biāo)配體的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽的噬菌體。本發(fā)明還涉及通過本文所述的方法可選擇的或選擇的分離的蛋白酶抗性肽或多 肽。在特定的實施方式中，本發(fā)明涉及通過本文所述的方法可選擇的或選擇的分離的蛋白 酶(例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme)抗性免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(例如，人抗 體重鏈可變結(jié)構(gòu)域,人抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明還涉及編碼通過本文所述的方法可選擇的或選擇的蛋白酶抗性肽或多肽 (例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶_或leucozyme-抗性免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)的分離的 或重組的核酸，以及含有該核酸的載體(例如,表達載體)和宿主細胞。本發(fā)明還涉及制備通過本文所述的方法可選擇的或選擇的蛋白酶抗性肽或多肽 (例如,胰蛋白酶_、彈性蛋白酶_或leucozyme-抗性免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)的方法， 包括將含有編碼蛋白酶抗性肽或多肽的重組核酸的宿主細胞維持在適于表達的條件下，由 此產(chǎn)生蛋白酶抗性肽或多肽。
本發(fā)明還涉及用于藥物中(例如,用于治療或診斷)的通過本文所述的方法可選 擇的或選擇的蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或leucozyme-抗性 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明還涉及通過本文所述的方法可選擇的或選擇的蛋白酶 抗性肽或多肽(例如,胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或leucozyme 抗性免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域)用于制造治療疾病的藥物的用途。本發(fā)明還涉及治療疾病的方法,包括將有效量的 通過本文所述的方法可選擇的或選擇的蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白 酶-或leucozyme 抗性免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)給藥于需要其的患者。
在本發(fā)明的方法的一個實施方式中,所述方法進一步包括在適合于第二蛋白酶的 活性的條件下組合第二蛋白酶和蛋白酶抗性肽或多肽的集；以及回收具有期望的生物學(xué)活性的至少一種肽或多肽，從而選擇對所述第二蛋白酶有 抗性的至少一種肽或多肽。所述第一和第二蛋白酶是不同的。所述第二蛋白酶可以是如上 文對第一蛋白酶的特定實施方式所定義的。本發(fā)明進--步提供了分離的肺部目標(biāo)拮抗劑,其包含肽或多肽,例如免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域，當(dāng)在適合于本發(fā)明的方法的條件下，例如⑴約10 μ g/ml到約3mg/ml蛋白 酶，(ii)約20°C到約40°C和(iii)至少約30分鐘，(例如，在100 μ g/ml蛋白酶在37°C至 少一小時的條件下)，與蛋白酶孵育時，所述肽或多肽對上文提及的一種或更多種蛋白酶是 有抗性的,所述蛋白酶例如選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶和leucozyme的一種或更多種蛋白 酶，所述分離的肺部目標(biāo)拮抗劑用于向患者施用來治療和/或預(yù)防肺部疾病或狀況。所述 拮抗劑可以用于通過吸入或鼻內(nèi)地向患者施用。本發(fā)明進一步提供了分離的GI道目標(biāo)拮抗劑，其包含肽或多肽,例如免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域，當(dāng)在適合于本發(fā)明的方法的條件下,例如(i)約lOyg/ml到約3mg/ml蛋白 酶，(ii)約20°C到約40°C和(iii)至少30分鐘，(例如，在100 μ g/ml蛋白酶在37°C至少 一小時的條件下)，與蛋白酶孵育時，所述肽或多肽對上文提及的一種或更多種蛋白酶是有 抗性的,所述蛋白酶例如選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶和leucozyme的一種或更多種蛋白酶， 所述分離的GI道目標(biāo)拮抗劑用于向患者施用來治療和/或預(yù)防GI道疾病或狀況。 所述拮抗劑可以用于口服，舌F地或直腸地向患者施用。所述肺部目標(biāo)或GI道目標(biāo)拮抗劑可以拮抗TNF α。在一個實施方式中,所述肽、多 肽或可變結(jié)構(gòu)域包含TNFRl的結(jié)合位點。在一個實施方式中，所述肺部目標(biāo)或GI道目標(biāo)拮抗劑拮抗TNFRl、VEGF或IL-1R1。 所述肽、多肽或可變結(jié)構(gòu)域可以分別包含TNFRl、VEGF或IL-IRl的結(jié)合位點。在本發(fā)明的方法的一個實施方式中，所述選擇的肽或多肽被進一步評估針對第二 蛋白酶的抗性,或針對第一蛋白酶、但處在不同于選擇方法中使用的一組條件下的抗性。所 述第二蛋白酶不同于第一蛋白酶,但可以是如上所述的任何蛋白酶。在一個實施方式中,在 本發(fā)明的方法中選擇超過一種蛋白酶抗性肽或多肽，之后進一步的步驟測定這些肽或多肽 的哪種顯示了針對第二蛋白酶的抗性，或針對第一蛋白酶、但處在不同于選擇方法中使用 的一組條件下的抗性。所述第二蛋白酶不同于第一蛋白酶，但可以是如上所述的任何蛋白 酶。這樣,得到了對超過一種蛋白酶有抗性的一種或更多種肽或多肽。在本發(fā)明的方法的一個實施方式中，選擇蛋白酶抗性單體的肽或多肽(例如，免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域單體)。
本發(fā)明的藥物和拮抗劑可以包含與所述肽或多肽融合的抗體恒定區(qū)(例如，F(xiàn)e)。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了蛋白酶抗性肽或多肽在制造用于向哺乳動物施 用的藥物、以提供具有改善的PK的藥物中的用途。改善的PK可以是改善的AUG(曲線下面 積)和/或改善的半衰期。在一個實施方式中，所述蛋白酶抗性肽或多肽是通過本發(fā)明的方 法選擇的或可選擇的。在一個實施方式中,所述肽或多肽是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。所 述藥物可以包含與所述肽或多肽融合的抗體恒定區(qū)，例如，抗體Fe。本發(fā)明提供了包含蛋白酶抗性肽或多肽的藥物，用于向哺乳動物(例如，人類)施 用,用于提供在所述哺乳動物中具有改善的PK的藥物。在一個實施方式中,所述蛋白酶抗 性肽或多肽是通過本發(fā)明的方法選擇的或可選擇的。在一個實施方式中,所述肽或多肽是 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的藥物可以包含與所述肽或多肽融合的抗體恒定區(qū)(例 如，F(xiàn)e)。附圖的簡要描述

圖1是pDOM 13(aka pD0M33)的多克隆位點的說明，其用來制備噬菌體展示集。圖2顯示了用來自用40ug/ml胰蛋白酶在30tr下孵育不同時間點的dAb的樣品進 行的幾個Novex 10^20% Tricene凝膠電泳。就在加入胰蛋白酶之前，然后在加入胰蛋白酶 之后一小時、三小時和24小時時立即取樣。用IxSureBlue將蛋白質(zhì)染色。凝膠說明DOM 15-10和DOM 15-26-501在用胰蛋白酶孵育的頭三個小時的過程中都得到了明顯消化。DOM 15-26、DOM 4-130-54和DOM lh-131-511的消化只在用胰蛋白酶孵育24小時后才變得明 顯。圖3是DOM lh-131-511和24個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不 同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標(biāo)記)。用框顯示對應(yīng)于CDR1、 CDR2和CDR3的環(huán)。圖4是DOM 4-130-54和27個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同 于親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標(biāo)記)。用框顯示對應(yīng)于⑶R1、CDR2 禾口 CDR3的環(huán)。圖5是DOM 15-26-555和21個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不 同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標(biāo)記)。用框顯示對應(yīng)于CDR1、 CDR2和CDR3的環(huán)。圖6是DOM 15-10和16個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同于 親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標(biāo)記)。用框顯示對應(yīng)于CDRl、CDR2 禾口 CDR3的環(huán)。圖7A-7D是顯示了用不同濃度的胰蛋白酶(從0至100 μ g/ml)在37 V孵育 過夜后親本 dAb, DOM lh-131-511 (圖 7A)和三個變體 dAb, D0Mlh-131-203 (圖 7B)、DOM lh-131-204(圖 7C)和 DOM lh-131_206(圖 7D)與固定的 TNFRl 結(jié)合的 BIAcore 痕跡。結(jié) 果表明所有三個變體對高濃度胰蛋白酶aOOug/ml)的蛋白水解的抗性比親本高。圖8A-8C是顯示了用彈性蛋白酶和Ieucozyme孵育過夜后dAb DOMlh-131-511 (圖 8A)、DOM lh-131-202(圖 8B)和 DOM lh_131_206(圖 8C)與固定的 TNFRl 結(jié)合的 BIAcore 痕跡。與親本相比，dAb顯示出對抗彈性蛋白酶和Ieucozyme的蛋白水解提高的抗性。圖 9 顯示 了用胰蛋白酶孵育前 dAb DOM lh-131-511、DOMlh-131-203、DOMlh-131-204、D0M lh-131-206、DOM lh-131-54、D0Mlh-131-201 和 DOM lh_131_202 的樣品和用100 μ g/ml胰蛋白酶孵育1小時、3小時和24小時后的樣品進行的兩個4-12% Novex Bis-Tris凝膠電泳。圖1.0A-IOC是顯示了用不同濃度的胰蛋白酶(從O至100 μ g/ral)在37°C孵育過 夜后 DOM 4-130-54 (圖 10A)、DOM 4-130-201 (圖 10B)和 DOM 4-130-202 (圖 10C)與固定 的IL-IRl融合蛋白結(jié)合的BIAcore痕跡。結(jié)果顯示兩種變體對高濃度胰蛋白酶(100 μ g/ ml)的蛋白水解的抗性都比它們的親本高。圖11A-1IC是顯示了用彈性蛋白酶和Ieucozyrae孵育過夜后D0M4-130-54 (圖 11A)、D0M 4-130-201 (圖 11B)和 DOM 4-130-202 (圖 11 C)與固定的 IL-IRl 融合蛋白結(jié)合 的BIAcore痕跡。與親本相比，dAb顯示出對抗所測試的兩種蛋白酶的蛋白水解提高的抗 性。圖1.2是DOM 15-26-555和6個變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同于親 本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標(biāo)記)。圖13A和13B是顯示了親本dAb，DOM 15-26-555 (圖13A)和蛋白酶抗性最大的變 體，DOM 15-26-593 (圖13B)與固定的VEGF結(jié)合的BIAcore痕跡。在用濃度為200 μ g/ml 的胰蛋白酶孵育后，在IOOnM的dAb濃度下，比較BIAcore上親本和變體的hVEGF結(jié)合。將 反應(yīng)在37°C下進行三小時或24小時。結(jié)果表明在胰蛋白酶處理24小時后,變體對蛋白水 解的抗性比親本高。圖14是顯示了胰蛋白酶處理對DOM 15-26-555變體的hVEGF結(jié)合的影響的圖。 結(jié)果清楚地顯示出在胰蛋白酶處理24小時后，所有變體對蛋白水解的抗性比親本(D0M 15-26-555)高。圖15顯示了裝載了 15 μ g處理過的和未處理過的DOM 15-26-555或DOM 15-26-593樣品的兩個Novex 10-20% Tricine凝膠。就在加入胰蛋白酶之前，然后在加入 胰蛋白酶之后一小時、三小時和24小時時立即取樣。用lxSureBlue將蛋白質(zhì)染色。凝膠 說明DOM 15-26-593的胰蛋白酶抗性特征不同于BIAcore實驗顯示的特征。圖16是DOM 15-10和變體，DOM 15-10-11的氨基酸序列的說明。變體中不同于 親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標(biāo)記)。圖 17A 和 17B 是顯示了親本,DOM 15-10(圖 17A)和變體，D0M15-10-11 (圖 17B) 與固定的VEGF結(jié)合的BIAcore痕跡。在用濃度為200 μ g/ml的胰蛋白酶孵育后,在IOOnM 的dAb濃度下，比較BIAcore上親本和變體的hVEGF結(jié)合。將反應(yīng)在37tTF進行一小時、三 小時和24小時。結(jié)果表明在胰蛋白酶處理24小時后，變體對蛋白水解的抗性比親本高。圖 18 顯示了 裝載了 15 μ g DOM 15-10 和 DOM 15-10-11 樣品的兩個 Novex 10-20% Tricine凝膠。在即將加入胰蛋白酶之前,然后在加入胰蛋白酶之后一小時、三小 時和24小時時取樣。用SureBlue(Ix)將蛋白質(zhì)染色。結(jié)果表明BIAcore研究中看到的結(jié) 合活性直接反映出蛋白質(zhì)的完整性。圖19A-19L說明了編碼是DOM lh-131-51.1或DOM 4-130-54變體的dAb的幾個核 酸的核苷酸序列。核苷酸序列各自編碼圖3和圖4中所示的氨基酸序列。圖20A-20E說明了編碼是DOM 15-26-555或DOM 15-10變體的dAb的幾個核酸的 核苷酸序列。核苷酸序列各自編碼圖5和圖6中所示的氨基酸序列。
圖21顯示了 pDOM 38的載體圖譜。圖22 顯示了 Labchip上在30°CTF在25 1 dAb 胰蛋白酶比例F用胰蛋白酶 處理DOM 10-53-474和DOM 15-26-593蛋白質(zhì)不同時間點的凝膠電泳。箭頭顯示全長蛋白。圖23 顯示了通過刪C色譜接著陰離子交換的純化后從每個樣品獲得的高水平純 度的大小排阻色譜痕跡。在225nm下監(jiān)控UV,并將柱子在含有10%乙醇(ν/ν)的IxPBS中 運行。通過整合使用基線校準(zhǔn)的峰面積來計算單體百分比。圖 24 顯示了 DOM lh-131-511、DOM lh-131-202 和 DOM lh-131-206 的蛋白酶穩(wěn)
定性數(shù)據(jù)。圖 25 是 SEC,其說明了 DOM lh-131_202、D0M lh-131-206 和 DOMlh-131-511 在 37 和50°CTF在Britton-Robinson中的14天穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。對于所有dAb，蛋白質(zhì)濃度為Img/ ml。SEC用來測定蛋白質(zhì)在熱應(yīng)力過程中是否發(fā)生了任何變化和相對于時間=O(TO)樣品 溶液中殘余的單體含量。圖26A至I 顯示了 SEC痕跡，其顯示了熱應(yīng)力(37和50°C )對DOMlh-131-511 (A 至C)，-202 (D至F)和-206 (G至I)的影響。還顯示了在給定時間點時相對于T = 0溶液 中殘余的單體含量。圖 27 :顯示了 DOM lh-131-202、D0M lh-131-206 和 DOM lh-131-511 在 24hr、48hr 以及7和14天熱應(yīng)力的IEF分析。樣品已經(jīng)在Britton-Robinson緩沖液中在37或50°C 下進行了孵育。圖 28 :TNFR-1RBA，顯示了 DOM lh-131-202、DOM lh-131-206 和 DOM lh-131-511 在50°C下孵育14天的影響。假定蛋白質(zhì)濃度為Img/ral。還顯示了沒有結(jié)合抗原的陰性對 照 dAb (VH 模型(dummy))。圖 29 說明 了將 100mg/ml 的 A :D0M lh-131-202、B :D0Mlh-131_206 和 C :D0M lh-131-511在Britton-Robinson緩沖液中在+4°C下存儲7天的影響。在280nm下監(jiān)控 UV0圖 30 顯示了來自 DOM lh-131-202、DOM lh-131-206 和 DOMlh-131-511 在 Pari E-flow和LC+中的噴霧器測試的數(shù)據(jù)。在任一 Britton-Robinson緩沖液中，蛋白質(zhì)濃度為 5mg/mlο圖 31 說明了 Britton-Robinson 緩沖液中 5mg/ml 的 DOM lh-131-202、DOM lh-131-206和DOM lh-131-511在噴霧過程中單體濃度的相對百分比變化。圖32 :顯示了 Britton-Robinson 緩沖液中 DOM lh-131-206 和 DOMlh-131-511 從 Pari LC+噴霧后的SEC痕跡。圖33 :顯示了 PBS中40rag/ml的1)(邏lh-1.31-206在1小時的噴霧過程中的SEC痕 跡。噴霧器杯和氣霧劑中的蛋白質(zhì)對于噴霧過程中dAb經(jīng)受到的剪切力和熱應(yīng)力的影響都 是高度抗性的。圖 34 顯示 了三種前導(dǎo)蛋白質(zhì)(DOM lh-131-206 和 DOM lh-131-511 和 DOM lh-131-202)中每一種的沉淀速度曲線。對于DOM lh-131-206較低濃度的樣品觀察到的雙
峰是由于該情況中樣品從室中泄漏出來造成的假象。圖35 顯示了緩沖液和裝置對GSK 1995056A(D0M lh-131-511)噴霧液滴大小的影響。
圖36 顯示了 GSK 1995056A(D0M lh-131-511)在各種裝置中噴霧后的穩(wěn)定性,通 過二聚體形成來測定，如通過SEC來測量的。圖 37 顯示 T GSK 1922567A(202)、GSK 1995057A (206)和 GSK1995056A(511) 在Pari Ε-flow和LC+中的噴霧器測試。A)在Britton-Robinson緩沖液中測試，B)在 PEG1000/蔗糖緩沖液中測試。 圖38 描繪了人TNFRl受體結(jié)合測試中的TNF-α劑量曲線。每個樣品重復(fù)四次 進行測試。圖 39:顯示了 GSK 1922567Α (DOM lh-131-202)、GSK 1995057A (DOM lh-131-206) 和GSK 1995056A(D0M lh-131-511)在人TNFRl受體結(jié)合測試中的抑制作用。每個樣品重 復(fù)四次進行測試。圖 40 說明了 DOM 15-26 和 DOM 15-26-593dAb 在 VEGF RBA 中的功效。圖 41 顯示了 將 5rag/mg DMS1529 (I)OM 15-26-593)和 DMS1545 (I)OM 15-26-501)以 單次快速濃注(bolus)劑量i.v.給藥于大鼠后的藥物動力學(xué)。圖 :顯示了 DMS 1529Fc 融合體(DOM 15-26-593Fc 融合體)的 SEC-MALL (大
小排阻色譜-多角度激光散射)分析，證實了單體的特征。顯示了兩個不同的批次，其對于 折射率(即，濃度；虛線)和光散射(實線)，顯示了相似的特征。用箭頭標(biāo)記的線條表示 分子量計算。圖42b 顯示了 DMS 1529Fc融合體(DOM 15_26_593Fc融合體)的AUC (分析超速 離心)分析，證實了單體的特征。在三個不同的濃度下(PBS緩沖液中接近0. 2,0. 5&1. Omg/ ml)測試一批材料。沉淀速率的分析證實了大約SOkDa的分子量。圖 43 顯示了 DMS 1529 (D0M 15-26-593)和 DOM 15-26-501 的 DSC 痕跡。圖44 是對兩個不同批次的材料進行10次凍-融循環(huán)之前和之后，DMS 1529 (D0M 15-26-593)的 VEGF 結(jié)合 ELISA。圖45 顯示了 10次凍-融循環(huán)之前和之后，DOM 15-26-593SEC特征的一致性。圖46 說明了 DMS 1529融合體(DOM 15_26_593Fc融合體)的加速穩(wěn)定性研究的 結(jié)果；結(jié)合ELISA證明了在所示溫度—F孵育7天后的活性。圖47A 顯示了在37 °C孵育14&15天后，人短尾猴(cynomolgus)中的DMS 1529 (D0M 15-26-593)的穩(wěn)定性。圖47B 顯示了在37°C孵育14&15天后，人血清中的DMS 1529 (D0M15-26-593)的 穩(wěn)定性。圖 48 顯示 了 DOM 15-26&D0M 15-26-593dAb 作為 Fc 融合體(各自為 DOM 1564&D0M 1529)在 VEGF RBA 中的功效。圖49 說明了 DMS 1529融合體(DOM 15-26-593FC融合體)對HUVEC細胞增殖的
抑制作用。圖 50 :pDom33 載體圖譜。圖51 描繪了結(jié)合血清白蛋白的dAbs的序列(氨基酸和核苷酸)。發(fā)明的詳細說明在本說明書中，已經(jīng)參照實施方式，以使得說明書既清楚又簡明的撰寫方式來描 述了本發(fā)明。但是打算并且應(yīng)當(dāng)理解,可以在不脫離本發(fā)明的條件下對這些實施方式進行各種組合和分開。如在此使用的，“肽”指的是經(jīng)由肽鍵連接在一起的約兩個到約50個氨基酸。如在此所用的，“多肽”指的是通過肽鍵連接在一起的至少約50個氨基酸。多肽通常包括三級結(jié)構(gòu)并折疊成功能結(jié)構(gòu)域。如在此所用的,“對蛋白酶降解抗性的”肽或多肽(例如,結(jié)構(gòu)域抗體(dAb))是在 適于蛋白酶活性的條件F用蛋白酶孵育時，基本上不受蛋白酶的降解。在適于蛋白酶活性 的溫度下，例如37或50°C，用蛋白酶孵育約一小時，不超過約25%、不超過約20%、不超過 約15%、不超過約14%、不超過約13%、不超過約12%、不超過約11°%、不超過約10%、不 超過約9 %、不超過約8 %、不超過約7 %、不超過約6 %、不超過約5 %、不超過約4 %、不超 過約3%、不超過約2%、不超過約或基本上沒有蛋白質(zhì)受蛋白酶降解時，多肽(例如， dAb)基本上是沒有降解的。可以使用任何合適的方法來測定蛋白質(zhì)降解，例如，如本文所述 的。通過SDS-PAGE或通過功能測試(例如，配體結(jié)合)。如在此所用的，“展示系統(tǒng)”指的是其中基于期望的特征(如,物理、化學(xué)或功能 特征)易于選擇的多肽或肽的集合的系統(tǒng)。展示系統(tǒng)可以是合適的多肽或肽的集(例如， 在溶液中，固定在合適的支持物上)。展示系統(tǒng)還可以是使用細胞表達系統(tǒng)(例如，在例 如轉(zhuǎn)化的、感染的、轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中核酸文庫的表達和細胞表面上所編碼多肽的展 示)或非細胞表達系統(tǒng)(例如,乳液區(qū)室化和展示)的生物化學(xué)系統(tǒng)。優(yōu)選的展示系統(tǒng)與 核酸的編碼功能以及由核酸編碼的多肽或肽的物理、化學(xué)和/或功能特征相關(guān)。使用這樣 的展示系統(tǒng)時，可以選擇具有期望的物理、化學(xué)和/或功能特征的多肽或肽，并可以容易 地分離或回收編碼選定多肽或肽的核酸。與核酸的編碼功能以及多肽或肽的物理、化學(xué) 和/'或功能特征相關(guān)的各種展示系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的,例如,細菌噬菌體(bacteriophage) 展示(噬菌體(phage)展示)、核糖體展示、乳液區(qū)室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展 示、細菌展示、在質(zhì)粒上展示、共價展示等。(參見，例如，EP 0436597 (Dyax)、U. S.專利 No. 6，172，197 (McCafferty 等)、U. S.專利 No. 6，489，103 (Griffiths 等))。如在此所用的,“集(repertoire) ”指的是特征在于氨基酸序列多樣性的多肽或肽 的集合。集的各個成員可以具有共同的特征，如共同的結(jié)構(gòu)特征(例如，共同的核心結(jié)構(gòu)) 和/或共同的功能特征(例如，結(jié)合共同配體(例如，通用配體或目標(biāo)配體)的能力)。如在此所用的,“功能性”描述了具有生物活性的多肽或肽,如特定的結(jié)合活性。例 如，術(shù)語“功能性多肽”包括通過其抗原_結(jié)合位點結(jié)合目標(biāo)抗原的抗體或其抗原_結(jié)合片 段，以及結(jié)合底物的酶。如在此所用的，“通用配體”指的是結(jié)合給定集的相當(dāng)大部分(例如,基本上全部) 功能性成員的配體。通用配體(例如,共同的通用配體)可以結(jié)合給定集的許多成員，即使 成員對于共同的目標(biāo)配體不具有結(jié)合特異性。通常,多肽上功能性通用配體結(jié)合位點的存 在(如通過結(jié)合通用配體的能力來表明)表明多肽是正確折疊的和功能性的。通用配體的 合適實例包括超抗原、結(jié)合在集的相當(dāng)大部分功能性成員上表達的表位的抗體等?！俺乖笔侵冈谂c這些蛋白的目標(biāo)配體結(jié)合位點不同的位點與免疫球蛋白超 家族的成員相互作用的通用配體的術(shù)語。葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素是與T-細 胞受體相互作用的超抗原的實例。結(jié)合抗體的超抗原包括蛋白G，其結(jié)合IgG恒定區(qū) (Bjorck和 Kronval 1，J. Immunol. ’ 133 969(1984))；蛋白 A，其結(jié)合 IgG恒定區(qū)和 Vh 結(jié)構(gòu)域(Forsgren 和 Sjoquist，J. Immunol. ,97 =822(1966))；和蛋白 L,其結(jié)合 Vl 結(jié)構(gòu)域(Bjorck, J. Immunol.，140 :1194 (1988))。如在此所用的，“目標(biāo)配體”指的是由多肽或肽特異性或選擇性結(jié)合的配體。例如， 當(dāng)多肽是抗體或其抗原-結(jié)合片段時，目標(biāo)配體可以是任何期望的抗原或表位，以及當(dāng)多 肽是酶時，目標(biāo)配體可以是任何期望的底物。與目標(biāo)抗原的結(jié)合取決于功能性的多肽或肽。
如在此所用的，“抗體形式”指的是其中可以引入抗體可變結(jié)構(gòu)域使得給予結(jié)構(gòu)上 抗原結(jié)合特異性的任何合適的多肽結(jié)構(gòu)。各種合適的抗體形式是本領(lǐng)域已知的，如，嵌合 抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或 輕鏈的同型二聚體和雜二聚體、之前任一項的抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)v片段(例如,單鏈 Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段)、單抗體可變結(jié)構(gòu)域 (例如，dAb、VH、VHH、VJ和之前任一項的修飾形式(例如，通過聚乙二醇或其他合適聚合物 的共價連接修飾的)。短語“免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域”指的是與其他V區(qū)或結(jié)構(gòu)域無關(guān)地特異性結(jié)合 抗原或表位的抗體可變結(jié)構(gòu)域(νΗ、ν冊、Vl)。免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以以帶有其他可變 區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域的形式(例如，同型-或雜-多聚體)存在，其中其他區(qū)或結(jié)構(gòu)域?qū)τ趩蚊?疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合不是期望的(即,其中免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合抗原 與其他可變結(jié)構(gòu)域無關(guān))。“結(jié)構(gòu)域抗體”或“ dAb ”與在此所用的術(shù)語“免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域”相同。免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選的是人抗體可變結(jié)構(gòu)域，但還包括來自其他 物種的單抗體可變結(jié)構(gòu)域,如嚙齒動物(例如,W000/29004中公開的,在此將其內(nèi)容作為整 體通過援引并入)、鉸口鯊(nurse shark)和Caraelid Vhh dAb。Caraelid Vhh是源自包括駱 駝、美洲駝(llama)、羊駝(alpaca)、單峰駱駝(dromedary)和原駝(guanaco)的物種的免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域多肽，其產(chǎn)生天然缺少輕鏈的重鏈抗體。“結(jié)構(gòu)域”是經(jīng)過折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其具有與蛋白質(zhì)其余部分無關(guān)的蛋白質(zhì)三級 結(jié)構(gòu)。通常,結(jié)構(gòu)域負責(zé)蛋白質(zhì)的分離的功能特征,并且在許多情況下可以添加、去除或轉(zhuǎn) 移給其他蛋白質(zhì)，而不喪失該蛋白質(zhì)和/或該結(jié)構(gòu)域的其余部分的功能?！皢慰贵w可變結(jié)構(gòu) 域，，是指經(jīng)過折疊的多肽結(jié)構(gòu)域，包含抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列特征。因此，其包括完整的抗 體可變結(jié)構(gòu)域和修飾的可變結(jié)構(gòu)域，例如，其中一個或更多個環(huán)已經(jīng)由不是抗體可變結(jié)構(gòu) 域特征性的序列替代,或已被截短或包含N 端或O端延伸的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及保留全 長結(jié)構(gòu)域的至少結(jié)合活性和特異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段。術(shù)語“文庫”指的是異源多肽或核酸的混合物。文庫由成員組成，每個成員具有單 個多肽或核酸序列。就這點而言，“文庫”和“集”同義。文庫成員之間的序列差異造成文庫 中存在的多樣性。文庫可以采用多肽或核酸的簡單混合物的形式,或者為核酸文庫轉(zhuǎn)化的 生物體或細胞的形式，例如細菌、病毒、動物或植物細胞等。優(yōu)選地,各個生物體或細胞僅含 有一個或數(shù)目有限的文庫成員。有益地，將核酸摻入到表達載體中，以表達該核酸所編碼的 多肽。因此,在優(yōu)選的方面中，文庫可以采用宿主生物體群的形式，每個生物體含有一個或 更多個拷貝的表達載體，所述表達載體含有核酸形式的文庫的單個成員，所述核酸可以表 達而產(chǎn)生其相應(yīng)的多肽成員。因此,宿主生物體群具有編碼一大組不同多肽的潛力?！巴ㄓ每蚣堋笔菃慰贵w框架序列，對應(yīng)于序列保守的抗體區(qū)，如Kabat定義的 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest，，，US Departmentof Health andHuman Servicesl991),或?qū)?yīng)于人種系免疫球蛋白集或結(jié)構(gòu),如Chothia和Lesk, (1987) .J. Mol. BioL 196 =910-917定義的。本發(fā)明提供了單個框架，或一組這樣的框架的用途，已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)其允許實質(zhì)上任何結(jié)合特異性的產(chǎn)生，盡管變化僅在超變區(qū)內(nèi)。優(yōu)選使用BLAST2 Sequences算法,使用缺省參數(shù),來制備和測定如在此所限定 的氨基酸和核苷酸序列比對和同源性、相似性或同一性(Tatusova, Τ. A. et al. , FEMS Microbiol Lett, 174 187-188(1999))。
本發(fā)明涉及選擇具有期望的生物學(xué)活性的蛋白酶抗性肽和多肽的方法。在所述方 法中使用兩種選擇壓力來產(chǎn)生用于選擇多肽的有效的過程,所述多肽是高度穩(wěn)定的并對蛋 白酶降解有抗性,并且具有期望的生物學(xué)活性。如在此描述的,蛋白酶抗性肽和多肽通常保 持生物學(xué)活性。相比之下，蛋白酶敏感的肽和多肽在此處描述的方法中被蛋白酶裂解或消 化，因而失去它們的生物學(xué)活性。因此，蛋白酶抗性肽或多肽一般根據(jù)它們的生物學(xué)活性來 選擇,例如，結(jié)合活性。在此描述的方法提供了幾個優(yōu)點。例如，如在此公開和例示的,選擇了針對--種 蛋白酶(例如，胰蛋白酶)的蛋白水解降解有抗性，對其他蛋白酶(例如，彈性蛋白酶、 leucozyme)的降解也有抗性的肽或多肽。此外，蛋白酶抗性與肽或多肽的更高的解鏈溫度 (Tm)相關(guān)。更高的解鏈溫度是更穩(wěn)定的肽和多肽的表現(xiàn)。對蛋白酶降解的抗性還與對目標(biāo) 配體的高親和力結(jié)合相關(guān)。因而,在此描述的方法提供了有效的途徑來選擇、分離和/或回 收多肽，所述多肽具有期望的生物學(xué)活性，并且非常適合于體內(nèi)治療和/或診斷用途，因為 它們是蛋白酶抗性的和穩(wěn)定的。選擇方法在一個方面中,提供了從肽和多肽的文庫或集(例如,展示系統(tǒng))中選擇、分離和 /或回收對蛋白酶(例如，一種或更多種蛋白酶)降解有抗性的肽或多肽的方法。優(yōu)選的， 該方法是從肽和多肽的文庫或集(例如，展示系統(tǒng))中選擇、分離和/或回收對蛋白酶(例 如,一種或更多種蛋白酶)降解有抗性的多肽的方法。通常,該方法包括提供肽或多肽的文 庫或集,在適于蛋白酶活性的條件下將文庫或集與蛋白酶(例如,胰蛋白酶、彈性蛋白酶、 leucozyme、胰酶、痰液)組合，并選擇、分離和/或回收對蛋白酶降解有抗性的并具有期望 的生物活性的肽或多肽。由于蛋白酶的活性，蛋白酶降解的肽或多肽通常具有降低的生物 活性或失去其生物活性。因此,可以使用基于它們的生物活性的方法來選擇、分離和/或回 收對蛋白酶降解抗性的肽或多肽,生物活性如結(jié)合活性(例如,結(jié)合通用配體,結(jié)合特異性 配體，結(jié)合底物)、催化活性或其他生物活性。如在此描述和例示的，蛋白酶抗性dAbs —般地以高親和力結(jié)合它們的目標(biāo)配體。 因而,在另一個方面,本發(fā)明是選擇、分離和/或回收以高親和力結(jié)合配體,優(yōu)選的目標(biāo)配 體的肽或多肽的方法。優(yōu)選的，所述方法是選擇、分離和/或回收以高親和力結(jié)合配體，優(yōu) 選的目標(biāo)配體的多肽的方法。通常，該方法包括提供肽或多肽的文庫或集，在適于蛋白酶活 性的條件下將文庫或集與蛋白酶(例如,胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme、胰酶、痰液)組 合,并選擇、分離和/或回收結(jié)合配體(例如，目標(biāo)配體)的肽或多肽。由于所述文庫或集已 經(jīng)在蛋白酶敏感性肽或多肽將被消化的條件下暴露于蛋白酶,蛋白酶的活性可以消除具有 低結(jié)合親和力的較不穩(wěn)定的多肽，從而產(chǎn)生高親和力結(jié)合肽或多肽的集合。例如，選擇的肽 或多肽可以以1 μ M或更強的親和力(KD ；如通過表面等離子體共振測定的，KD = Koff(kd)/Kon(ka)),優(yōu)選約500ηΜ到約0. 5ρΜ,結(jié)合它的目標(biāo)配體。例如，高親和力肽或多肽可以以約500ηΜ、約 ΙΟΟηΜ、約 ΙΟηΜ、約 InM、約 500pM、約 ΙΟΟρΜ、約 ΙΟρΜ、約 IpM 或約 0. 5pM 的親和力 結(jié)合目標(biāo)配體。對蛋白酶有抗性的肽和多肽被認(rèn)為具有更低的熵和/或更高的穩(wěn)定能。因 而，蛋白酶抗性與高親和力結(jié)合之間的相關(guān)性可以與通過本發(fā)明的方法選擇的肽和多肽的 表面的致密性和穩(wěn)定性相關(guān)。 在適于蛋白酶的蛋白水解活性的條件下，將肽或多肽的文庫或集與蛋白酶(例 如，一種或更多種蛋白酶)組合。適于蛋白酶的蛋白水解活性的條件以及含有蛋白水解活 性的生物制劑或混合物是本領(lǐng)域公知的，并可以被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地測定。如果 需要,例如,可以通過測定一定范圍的PH條件、蛋白酶濃度、溫度下的蛋白酶活性和/或通 過改變文庫或集與蛋白酶反應(yīng)的時間量來鑒定或優(yōu)化合適的條件。例如，在一些實施方 式中，蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽(例如,可變結(jié)構(gòu)域)的比例(以摩爾/摩爾為基 礎(chǔ))為800至80，00 (例如,8，000至80，000)蛋白酶肽或多肽，例如，使用10微克/m!蛋 白酶時，比例為800至80, 000蛋白酶肽或多肽；或使用100微克/ml蛋白酶時，比例為 8，000至80，000蛋白酶肽或多肽。在一個實施方式中，蛋白酶(例如，胰蛋白酶)與肽 或多肽(例如，可變結(jié)構(gòu)域)的比例(以重量/重量為基礎(chǔ)，例如微克/微克)為1，600至 1.60，000 (例如，16，000至1.60，000)蛋白酶肽或多肽,例如，使用10微克/ral蛋白酶時， 比例為1，600至160, 000蛋白酶肽或多肽；或使用100微克/ml蛋白酶時，比例為16，000 至160，000蛋白酶肽或多肽。在一個實施方式中，使用至少100或1000微克/ml濃度的 蛋白酶，并且蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽(例如，可變結(jié)構(gòu)域)的蛋白酶肽比例(以 摩爾/摩爾為基礎(chǔ))為8，000至80，000蛋白酶肽或多肽。在一個實施方式中，使用至少 10微克/ml濃度的蛋白酶,并且蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽(例如,可變結(jié)構(gòu)域)的 蛋白酶肽比例(以摩爾/摩爾為基礎(chǔ))為800至80，000蛋白酶肽或多肽。在一個實 施方式中，例如，C為10微克/ml時,蛋白酶(例如，胰蛋白酶)與肽或多肽(例如,可變結(jié) 構(gòu)域)的比例(以重量/重量為基礎(chǔ),例如微克/微克)為1600至160，000蛋白酶肽或 多肽；或C或C’為100微克/ml時，比例為16，000至160，000蛋白酶肽或多肽。在一個 實施方式中，濃度(c或C，)為至少100或1000微克/ml蛋白酶。對于測試單個或分離的 肽或多肽(例如，免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域)，例如，已經(jīng)從集或文庫中分離出來的，可以將蛋 白酶加入合適緩沖液(例如，PBS)中的肽或多肽溶液中，以產(chǎn)生肽或多肽/蛋白酶溶液，如 至少約0.01% (w/w)蛋白酶/肽或多肽的溶液,約0.01%至約5% (w/w)蛋白酶/肽或多 肽，約0.05%至約5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，約0. 至約5% (w/w)蛋白酶/肽或多 肽，約0. 5 %至約5 % (w/w)蛋白酶/肽或多肽，約1 %至約5 % (w/w)蛋白酶/肽或多肽， 至少約0.01% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.02% (w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少約 0. 03% (w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少約0.04% (w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少約0.05% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 06 % (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 07 % (w/w) 蛋白酶/'肽或多肽,至少約0.08% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.09% (w/w)蛋白酶 /肽或多肽，至少約().1 % (w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少約0. 2 % (w/w)蛋白酶/肽或多 肽,至少約0.3% (w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少約0.4% (w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少約 0.5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.6% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.7% (w/ w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.8% (w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少約0.9% (w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少約(w/w)蛋白酶/肽或多肽,至少約2% (w/w)蛋白酶/肽或多肽,至 少約3% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約4% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，或約5% (w/w)蛋 白酶/肽或多肽。可以在蛋白酶活性合適的溫度下(例如，室溫,約37°C )孵育混合物，并 以(例如，1小時，2小時’ 3小時等)時間間隔取樣。使用任何合適的方法,如SDS-PAGE分 析或配體結(jié)合,分析樣品的蛋白質(zhì)降解,并且結(jié)果可以用來建立降解的時間過程。
在本文所述的方法中，可以使用任何期望的一種或復(fù)數(shù)種蛋白酶。例如，可以使用 單種蛋白酶，不同蛋白酶的任何期望的組合或含有蛋白水解活性的任何生物制劑、生物提 取物或生物勻漿。所用一種或復(fù)數(shù)種蛋白酶的身份不必要是已知的?？梢詥为毣蛞匀魏纹?望的組合來使用的蛋白酶的合適實例包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白 酶、巰基蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋 白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme、胰酶、凝血酶、纖維蛋白溶酶、組織蛋 白酶(例如,組織蛋白酶G)、蛋白水解酶(例如，蛋白水解酶1、蛋白水解酶2、蛋白水解酶 3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(例如,胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋 白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無 花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、actinidain、菠蘿蛋白酶和separase等。合適的含有 蛋白水解活性的生物提取物、勻漿和制劑包括痰液、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘 液)、支氣管肺泡灌洗液、肺勻漿、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液、淚液等。在一個實施方式 中，所述蛋白酶是在眼和/或淚液中存在的蛋白酶。以適于發(fā)生蛋白水解降解的含量使用 蛋白酶。例如，如本文所述的，可以使用約0.01%至約5% (w/w，蛋白酶/肽或多肽)的蛋 白酶。將蛋白酶與包括肽或多肽集的展示系統(tǒng)(例如，噬菌體展示系統(tǒng))組合時,例如,可 以使用的蛋白酶濃度為約10 μ g/ml至約3mg/ml,約10 μ g/ml,約20 μ g/ml,約30 μ g/ml, 約 40 μ g/ml，約 50 μ g/ml，約 60 μ g/ml，約 70 μ g/ml，約 80 μ g/ml，約 90 μ g/ml，約 100 μ g/ ml,約 200 μ g/ml，^J 300 μ g/ml,約 400 μ g/ml，約 500 μ g/ml，約 600 μ g/ml,約 700 μ g/ml， 約 800 μ g/m!,約 900 μ g/m!,約 1000 μ g/ml，約 1. 5mg/m!,約 2rag/ml，約 2. 5mg/m!或約 3rag/ ml ο 適合的濃度是約 10 μ g/ml 到 lmg/ml, 10 μ g/ml 到 100、90、80、70、60、50 或 40 μ g/ml, 或 10、20、30、40 或 50 μ g/ml 到 100、90、80、70、60μ g/ml。在適于蛋白酶活性的溫度下將蛋白酶與肽或多肽的集合(文庫或集)一起孵 育。例如,可以在約200C至約40 V的溫度下孵育蛋白酶和肽或多肽的集合(例如,在室溫， 約 20 "C ,約 21 °C,約 22 "C,約 23 °C,約 24 V,約 25 °C,約 26 V,約 27 °C,約 28 V,約 29 °C, 約 30°C，約 31°C，約 32°C，約 33。C，約 34°C，約 35°C，約 36。C，約 37°C，約 38。C，約 39°C，約 40。O)。將蛋白酶和肽或多肽的集合一起孵育一段足以發(fā)生蛋白水解降解的時間。例如， 可以將肽或多肽的集合與蛋白酶孵育約30分鐘至約24或約48小時。在一些實施例中，將 肽或多肽的集合與蛋白酶一起孵育過夜，或至少約30分鐘,約1小時,約1. 5小時,約2小 時，約3小時，約4小時，約5小時，約6小時，約7小時，約8小時，約9小時，約10小時，約 11小時，約12小時，約13小時，約14小時，約15小時,約16小時，約17小時，約18小時， 約19小時,約20小時,約21小時,約22小時,約23小時,約24小時,約48小時,或更長時 間。通常理想的是，至少在較早的選擇輪次中(例如，使用展示系統(tǒng)時)，與沒有包括 蛋白酶孵育的選擇相比，蛋白酶導(dǎo)致選擇的具有期望的生物活性的克隆數(shù)量減少至少一個數(shù)量級。在特定的實施例中，方法中所用的蛋白酶含量和條件足以將回收的克隆數(shù)量減少 至少一個對數(shù)(10倍)，至少約2個對數(shù)(100倍)，至少約3個對數(shù)(1000倍)或至少約4 個對數(shù)(10，000倍)。使用常規(guī)方法和/或在此提供的指導(dǎo)，可以容易地測定導(dǎo)致期望的回 收克隆減少的合適的蛋白酶含量和孵育條件?？梢允褂萌魏魏线m的方法(例如,體外、體內(nèi)或先體外后體內(nèi)(exvivo))來組合并 孵育蛋白酶和肽或多肽的集合。例如，可以在合適的容器中將蛋白酶和肽或多肽的集合組 合并在適于蛋白酶活性的溫度下保持靜止、搖晃、振蕩、渦旋(swirled)等。 如果需要,可以 在體內(nèi)或先體外后體內(nèi)(ex vivo)系統(tǒng)中組合蛋白酶和肽或多肽的集合,如通過將多肽的 集合(例如,噬菌體展示文庫或集)引入合適的動物中(例如,小鼠)，經(jīng)過對于蛋白酶活性 而言足夠的時間后，回收肽或多肽的集合。在另一個實施例中，用多肽的集合(例如，噬菌 體展示文庫或集)灌注器官或組織,經(jīng)過對于蛋白酶活性而言足夠的時間后，回收多肽的
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朱口 °孵育后，可以基于期望的生物活性如結(jié)合活性來選擇蛋白酶抗性肽或多肽。如 果需要，可以在選擇前加入蛋白酶抑制劑。可以使用基本—丨二不千擾選擇方法的任何合適 的蛋白酶抑制劑(或兩種或更多種蛋白酶抑制劑的組合)。合適的蛋白酶抑制劑的實 例包括，α 1-抗-胰蛋白酶、α 2-巨球蛋白、氨肽酶抑制劑、抗蛋白酶、抗凝血酶111、抑 酶肽、4-(2_氨乙基)苯磺?；稃}酸鹽(AEBSF)、(4-脒基-苯基)-甲烷-磺酰 氟化物(APMSF)、苯丁抑制素、芐脒、凝乳蛋白酶抑制劑、3，4- 二氯異香豆素、二異丙基 氟磷酸酯(DIFP)、Ε-64、乙二胺四乙酸(EDTA)、彈性蛋白酶抑制劑(elastatinal)、亮肽 素、N 乙基馬來酰亞胺、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、抑胃酶肽、1,1.0 二氮雜菲、膦酰二肽 (phosphoramidon)、絲氨酸蛋白酶抑制劑、N-甲苯磺?；?L-賴氨酸-氯甲基酮(TLCK)、 Na-甲苯磺?；?Phe-氯甲基酮(TPCK)等。此外，許多含有幾類蛋白酶抑制劑的制劑是可購 得的(例如，Roche CompleteProtease Inhibitor Cocktail Tablets"(Roche Diagnostics Corporation ； Indianapol is, IN, USA),其抑制胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、 鏈霉蛋白酶、胰提取物和胰蛋白酶)。可以使用期望的生物活性選擇方法來選擇蛋白酶抗性肽或多肽，這種選擇方法可 以使具有期望的生物活性的肽和多肽與不具有期望的生物活性的肽和多肽區(qū)分開來并進 行選擇。通常，已經(jīng)受到蛋白酶消化或裂解的肽或多肽失去了它們的生物活性，而蛋白酶抗 性肽或多肽仍然保留功能。因此,對于生物活性合適的測試可以用來選擇蛋白酶抗性肽或 多肽。例如，可以使用合適的結(jié)合測試(例如，ELISA、淘選)來測定共同的結(jié)合功能(例 如，結(jié)合通用配體，結(jié)合特異性配體或結(jié)合底物)。例如，可以通過淘選或使用合適的親和性 基質(zhì)來選擇、分離和/或回收結(jié)合目標(biāo)配體或通用配體(如蛋白A、蛋白L或抗體)的多肽。 可以通過將配體(例如,通用配體、目標(biāo)配體)溶液加入合適的容器(例如，試管、培養(yǎng)皿) 中并使配體沉積或覆蓋在容器壁上來完成淘選。將過量的配體洗掉并將多肽(例如，噬菌 體展示文庫)加入容器中，并將容器維持在適于多肽結(jié)合固定化配體的條件下?？蓪⑽唇Y(jié) 合的多肽洗掉,使用任何合適的方法(如刮下(scraping)或降低pH)來回收結(jié)合的多肽。使用噬菌體展示系統(tǒng)時,可以在噬菌體ELISA中測試結(jié)合?？梢愿鶕?jù)任何合適的 程序來進行噬菌體ELISA。在一個實施例中，通過ELISA篩選每一輪選擇產(chǎn)生的噬菌體群與 選定的目標(biāo)配體或通用配體的結(jié)合，以鑒定呈現(xiàn)出蛋白酶抗性肽或多肽的噬菌體。如果需要,可以測試可溶性肽和多肽與目標(biāo)配體或通用配體的結(jié)合,例如,通過ELISA,使用例如，對抗C-或N-端標(biāo)記物的試劑(參見，例如Winter等(1994)，Ann. Rev. Immunology 12， 433-55以及其中引用的參考文獻)。還可以通過PCR產(chǎn)物的凝膠電泳(Marks等，1991，上 文；Nissim 等，1994，上文)、探針檢測(Tomlinson 等，1992，J. Mol. Biol. 227, 776)或通過 載體DNA的測序來測定選定噬菌體的多樣性。蛋白酶抗性肽和多肽也可以，例如，根據(jù)催化活性來選擇，其可以使用催化活性分 析來測量(例如，蛋白質(zhì)水解活性分析、磷酸轉(zhuǎn)移酶分析、磷酸水解酶分析、聚合酶活性分 析)。蛋白酶抗性肽或多肽(例如，單抗體可變結(jié)構(gòu)域)可以具有對通用配體或任何 期望的目標(biāo)配體的結(jié)合特異性，例如，人類或動物蛋白，包括細胞因子、生長因子、細胞因 子受體、生長因子受體、酶(例如，蛋白酶)、酶的輔助因子、DNA結(jié)合蛋白、脂質(zhì)和碳水化 物。包括細胞因子、生長因子、細胞因子受體、生長因子受體和其他蛋白質(zhì)的適合的目標(biāo) 抗原，包括但不限于ApoE、Apo-SAA, BDNF、心肌營養(yǎng)蛋白-1、CEA、CD40、CD40配體、CD56、 CD38、CD138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸細胞活化趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子-2、 Exodus-2、FAPa、FGF、-酸性、FGF-堿性、成纖維細胞生長因子-10、FLT3配體、CXXXC 趨化因子(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β 1、人血清白蛋白、胰島素、IFN-γ、IGF-1、 IGF-II、IL-I a、IL-I β、IL-I 受體、IL-Il 型受體、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8(72a. a.)、IL_8(77a. a.)、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、 IL-18 (IGIF)、抑制素α、抑制素β、ΙΡ-10、角質(zhì)形成細胞生長因子-2 (KGF-2)、KGF、瘦蛋 白、LIF、淋巴細胞趨化因子、繆勒管抑制物質(zhì)、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白 質(zhì)、M-CSF、c-fms、v-fmsMDC(67a. a.)、MDC(69a. a.)、MCP-I (MCAF)、MCP—2、MCP—3、MCP—4、 MDC (67a. a.)、MDC (69a. a.)、MIG、MIP-I α、MIP-I β、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-4、骨髓祖代 抑制因子-1 (MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神經(jīng)生長因子、β -NGF、NT-3、NT-4、制瘤素 Μ、 PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES, SDFl α、SDFl β、SCF、SCGF，干細胞因子(SCF)、 TARC、TGF- α、TGF- β、TGF- β 2、TGF- β 3、月中瘤壞死因子(TNF)、TNF- α、TNF- β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-U TPO, VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受 體 2、VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、GR0- β、GRO- y、HCCl、1-309、HERl、IIER2、HER3、IIER4、 血清白蛋白、vWF,淀粉樣蛋白(例如，淀粉樣蛋白a)、MMP12、PDKl、IgE以及在此公開的其 他目標(biāo)。要理解的是,這個列表不是窮舉的。在某些實施方式中，所述蛋白酶抗性肽或多肽結(jié)合肺部組織中的目標(biāo)，例如，選自 以下構(gòu)成的組的目標(biāo) TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、 1[廠9、丨丄-9R、IL-IO, IL-12IL-12R、IL-13、IL-13Ra 1、IL 13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、 IL-17R、IL-17、IL-18, IL-18R、IL-23IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、 CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、 CXCL12 (SDF-I)、糜蛋白酶、FGF、弗林蛋白酶、內(nèi)皮素-1、嗜酸細胞活化趨化因子(例如、 嗜酸細胞活化趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子-2、嗜酸細胞活化趨化因子、GM^CSF, ICAM-U I COS、IgE、IFNa、1-309、整聯(lián)蛋白、L-選擇素、MIF、MIP4、MDC、MCP_l、MMPs、嗜中性 白細胞彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、s i g 1 e c8、TARC、TGFb、 凝血醇、Tim-1、TNF、TRANCE、類姨蛋白醇、VEGF, VLA-4、VCAM、α 4β 7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、alphavbeta6、alphavbeta8、cMET、CD8、vWF、淀粉樣蛋白(例如，淀粉樣 蛋白 α )、MMP12、PDK1 和 IgE。在本文所述的方法中使用展示系統(tǒng)時(例如，與核酸的編碼功能和該核酸編碼的 肽或多肽的功能性特征相關(guān)的展示系統(tǒng))，常常能有利地擴增或提高編碼選定肽或多肽的 核酸的拷貝數(shù)。這提供了一條使用本文所述的方法或其他合適的方法獲得足量核酸和/或 肽或多肽的有效途徑，以用于更多輪次的選擇，或用于制備其他的集(例如，親和成熟集)。 因此，在一些實施方式中，本發(fā)明的方法包括使用展示系統(tǒng)(例如，與核酸的編碼功能和該 核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關(guān)的展示系統(tǒng),如噬菌體展示)并進一步包括擴增或 提高編碼選定肽或多肽的核酸的拷貝數(shù)。可以使用任何合適的方法來擴增核酸,如通過噬 菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。本文所述的方法可以用作程序的一部分來分離蛋白酶抗性肽或多肽，如果需要， 其可以包括其他合適的選擇方法。在這些情況中，可以在計劃的任何期望的點使用本文所 述的方法,如在使用其他選擇方法之前或之后。本文所述的方法還可以用來提供兩輪或更 多輪的選擇，如本文所述和舉例說明的。在一個實例中，本發(fā)明是選擇對彈性蛋白酶的降解有抗性的肽或多肽的方法,包 括提供肽或多肽的文庫或集,在適合于彈性蛋白酶的蛋白水解消化的條件下組合所述文庫 或集與彈性蛋白酶(或包含彈性蛋白酶的生物制品、提取物或勻漿)，并選擇、分離和/或回 收對彈性蛋白酶的降解有抗性、并具有期望的生物學(xué)活性(例如，結(jié)合活性)的肽或多肽。在特定的實施方式中，本發(fā)明是選擇對彈性蛋白酶的降解有抗性、并結(jié)合目標(biāo)配 體，例如肺部組織中的目標(biāo)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(dAb)的方法。在這些實施方式中， 提供包含dAbs的文庫或集,在適用于彈性蛋白酶的蛋白水解消化的條件下與彈性蛋白酶 (或包含彈性蛋白酶的生物制品、提取物或勻漿)組合。選擇結(jié)合目標(biāo)配體的彈性蛋白酶抗 性dAbs。例如,所述彈性蛋白酶抗性dAb當(dāng)在彈性蛋白酶的0.04% (w/w)溶液中在37°C孵 育至少約2小時的時間時基本上不降解。優(yōu)選的,所述彈性蛋白酶抗性dAb當(dāng)在彈性蛋白 酶的0.04% (w/w)溶液中在37°C孵育至少約12小時的時間時基本上不降解。更優(yōu)選的， 所述彈性蛋白酶抗性dAb當(dāng)在彈性蛋白酶的0. 04% (w/w)溶液中在37°C孵育至少約24小 時、至少約36小時或至少約48小時的時間時基本上不降解。在示范性的實施方式中，本發(fā)明是選擇對彈性蛋白酶的降解有抗性并結(jié)合目標(biāo)配 體如肺部組織中的目標(biāo)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(dAb)的方法。所述方法包括提供包含 多肽的集的噬菌體展示系統(tǒng)，所述多肽的集包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，組合所述噬菌 體展示系統(tǒng)與彈性蛋白酶(約lOOyg/ml)并在約37°C孵育所述混合物例如過夜(例如，約 12-16小時)，然后根據(jù)與目標(biāo)抗原的結(jié)合來選擇展示了結(jié)合期望的目標(biāo)抗原的dAb的噬菌 體。在一個實例中，本發(fā)明是選擇對leucozyme的降解有抗性的肽或多肽的方法，包 括提供肽或多肽的文庫或集，在適合于leucozyme的蛋白水解消化的條件下組合所述文庫 或集與leucozyme (或包含leucozyme的生物制品、提取物或勻漿)，并選擇、分離和/或回 收對leucozyme的降解有抗性、并具有期望的生物學(xué)活性(例如，結(jié)合活性)的肽或多肽。在特定的實施方式中，本發(fā) 明是選擇對leucozyme的降解有抗性、并結(jié)合目標(biāo) 配體，例如肺部組織中的目標(biāo)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(dAb)的方法。在這些實施方式中，提供包含dAbs的文庫或集，在適用于leucozyme的蛋白水解消化的條件下與 leuC0Zyme(或包含leucozyme的生物制品、提取物或勻漿)組合。選擇結(jié)合目標(biāo)配體的 leucozyme 抗性 dAbs。例如，所述 leucozyme 抗性 dAb 當(dāng)在 leucozyme 的 0. 04% (w/'w)溶 液中在37°C孵育至少約2小時的時間時基本上不降解。優(yōu)選的，所述leucozyme抗性dAb 當(dāng)在leucozyme的0. 04% (w/w)溶液中在37°C孵育至少約12小時的時間時基本上不降解。 更優(yōu)選的，所述leucozyme抗性dAb當(dāng)在leucozyme的0. 04% (w/w)溶液中在37°C孵育至 少約24小時、至少約36小時或至少約48小時的時間時基本上不降解。
在示范性的實施方式中，本發(fā)明是選擇對leucozyme的降解有抗性并結(jié)合目標(biāo)配 體如肺部組織中的目標(biāo)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(dAb)的方法。所述方法包括提供包含 多肽的集的噬菌體展示系統(tǒng)，所述多肽的集包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，組合所述噬菌 體展示系統(tǒng)與leucozyme (約100 μ g/ml)，并在約37°C孵育所述混合物例如過夜(例如’約 12-16小時)，然后根據(jù)與所述目標(biāo)抗原的結(jié)合來選擇展示了結(jié)合期望的目標(biāo)抗原的dAb的 噬菌體。在另一個實例中，本發(fā)明是選擇對胰蛋白酶的降解有抗性的肽或多肽的方法，包 括提供肽或多肽的文庫或集，在適合于胰蛋白酶的蛋白水解消化的條件下組合所述文庫或 集與胰蛋白酶，并選擇、分離和/或回收對胰蛋白酶的降解有抗性、并具有期望的生物學(xué)活 性的肽或多肽。在特定的實施方式中，本發(fā)明是選擇對胰蛋白酶的降解有抗性、并結(jié)合目標(biāo)配體， 例如肺部組織中的目標(biāo)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(dAb)的方法。在這些實施方式中，提 供包含dAbs的文庫或集,在適用于胰蛋白酶的蛋白水解消化的條件下與胰蛋白酶(或包含 胰蛋白酶的生物制品、提取物或勻漿)組合。選擇結(jié)合目標(biāo)配體的胰蛋白酶抗性dAbs。例 如，所述胰蛋白酶抗性dAb當(dāng)在胰蛋白酶的0. 04% (w/w)溶液中在37°C孵育至少約2小時 的時間時基本上不降解。優(yōu)選的，所述胰蛋白酶抗性dAb當(dāng)在胰蛋白酶的0.04% (w/w)溶 液中在37°C孵育至少約3小時的時間時基本上不降解。更優(yōu)選的,所述胰蛋白酶抗性dAb 當(dāng)在胰蛋白酶的0. 04% (w/w)溶液中孵育至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時、至 少約7小時、至少約8小時、至少約9小時、至少約10小時、至少約11小時或至少約12小 時的時間時基本上不降解。在示范性的實施方式中，本發(fā)明是選擇對胰蛋白酶的降解有抗性并結(jié)合目標(biāo)配體 如肺部組織中的目標(biāo)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(dAb)的方法。所述方法包括提供包含 多肽的集的噬菌體展示系統(tǒng)，所述多肽的集包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，組合所述噬菌 體展示系統(tǒng)與胰蛋白酶(約100 μ g/ml)，并在約37°c孵育所述混合物例如過夜(例如，約 12-16小時)，然后根據(jù)與所述目標(biāo)抗原的結(jié)合來選擇展示了結(jié)合期望的目標(biāo)抗原的dAb的 噬菌體。在另一個方面，本發(fā)明是生產(chǎn)蛋白酶抗性肽或多肽的集的方法。所述方法包括提 供肽或多肽的集；在適合蛋白酶活性的條件下組合所述肽或多肽的集與蛋白酶；以及回收 具有期望的生物學(xué)活性的復(fù)數(shù)種肽或多肽；從而生產(chǎn)蛋白酶抗性肽或多肽的集。優(yōu)選的,具 有期望的生物學(xué)活性的復(fù)數(shù)種肽或多肽根據(jù)結(jié)合活性，例如對通用配體或目標(biāo)配體的結(jié)合 來回收。在此，對于本發(fā)明的其他方法，描述了在方法中適用的蛋白酶、展示系統(tǒng)、蛋白酶活 性的條件以及選擇肽或多肽的方法。
在某些實施方式中，使用包含肽或多肽的集的展示系統(tǒng)(例如，與核酸的編碼功 能和該核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關(guān)的展示系統(tǒng))，以及所述方法進一步包括擴 增編碼所述復(fù)數(shù)種選定肽或多肽的核酸或提高所述核酸的拷貝數(shù)?？梢允褂萌魏魏线m的方 法來擴增核酸,如通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在特定的實施方式中,本發(fā)明是生產(chǎn)包含dAbs的蛋白酶抗性多肽的集的方法。所 述方法包括提供包含dAbs的多肽的集；在適合于蛋白酶活性的條件F組合所述肽或多肽 的集與蛋白酶(例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme)；以及回收包含具有對通用配體 (例如,蛋白A、蛋白G、蛋白L)或目標(biāo)配體的結(jié)合特異性的dAbs的復(fù)數(shù)種多肽。所述方法可以用于生產(chǎn)首次用于試驗的(naifve)集,或偏向期望的結(jié)合特異性的集,例如基于具有 對期望的目標(biāo)配體的結(jié)合特異性的親本dAb的親和成熟集。多肽展示系統(tǒng)優(yōu)選的,被提供用于本發(fā)明方法中的肽或多肽的集或文庫包含合適的展示系統(tǒng)。 所述展示系統(tǒng)優(yōu)選可以抵抗蛋白酶的降解(例如,單種蛋白酶或蛋白酶的組合，以及含有 蛋白水解活性的任何生物提取物、勻漿或制劑(例如，痰液、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支 氣管粘液)、支氣管灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液、淚液等))。展示系統(tǒng)以 及展示系統(tǒng)與所展示多肽之間的聯(lián)系優(yōu)選地至少與集中最穩(wěn)定的肽或多肽那樣抵抗蛋白 酶。這容許容易地分離和/或擴增編碼選定的展示多肽的核酸。在一個實施例中，可以從溶液中或共價或非共價連接合適表面(如塑料或玻璃 (例如，微滴定平板、多肽陣列，如微陣列))的肽或多肽的集中選擇、分離和/或回收蛋白酶 抗性肽或多肽。例如，可以使用在表面上的肽陣列，其排列方式使每個不同的文庫成員(例 如,獨特的肽序列)處于陣列中分開的、預(yù)定的位置。可以通過陣列中的空間位置來測定該 陣列中每個文庫成員的身份?？梢詼y定在目標(biāo)配體例如與反應(yīng)性文庫成員之間發(fā)生結(jié)合作 用的陣列中的位置，因此基于空間位置來鑒定反應(yīng)性成員的序列。(參見，例如，U.S.專利 No. 5，143，854，ff()90/15070 和 W092/10092)。優(yōu)選,該方法使用與核酸的編碼功能和該核酸編碼的多肽的物理、化學(xué)和/或功 能性特征相關(guān)的展示系統(tǒng)。這樣的展示系統(tǒng)可以包括復(fù)數(shù)個可復(fù)制的遺傳包，如細菌噬菌 體或細胞(細菌)。優(yōu)選，展示系統(tǒng)包括文庫，如細菌噬菌體展示文庫。細菌噬菌體展示是 特別優(yōu)選的展示系統(tǒng)。已經(jīng)描述了各種合適的細菌噬菌體展示系統(tǒng)(例如,單價展示和多價展示系統(tǒng))。 (參見，例如，(Griffiths等，U. S.專利No. 6，555，313B1 (在此通過援引并入)；Johnson等， U. S.專利 No. 5，733，743 (在此通過援引并入)；McCafferty 等，U. S.專利 No. 5，969，108 (在 此通過援引并入)；Mul 1 i gan-Kehoe，U. S.專利No. 5，702，892 (在此通過援引并入)； Winter, G. Annu. Rev. Immunol. 12 433-455 (1994) ；Soumi 11 ion P. Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3) 175-189 (1994) ；Castagonoli, L.等，Comb. Chem. High Throughput Screen, 4 (2) 121-133 (2001))。細菌噬菌體展示系統(tǒng)中展示的肽或多肽可以在任何合適的 細菌噬菌體上展示,如絲狀噬菌體(例如，fd, Ml 3, Fl)、裂解性噬菌體(例如，Τ4、Τ7、λ) 或RNA噬菌體(例如，MS2)。通常，產(chǎn)生或提供展示肽或噬菌體多肽的集的噬菌體文庫，作為與合適的噬菌體 外殼蛋白(例如，fd pill蛋白)的融合蛋白。融合蛋白可以展示在噬菌體外殼蛋白尖端的肽或多肽，或如果需要,在內(nèi)部位置。例如,展示的肽或多肽可以存在于PlII結(jié)構(gòu)域1的 氨基-末端的位置。(pill的結(jié)構(gòu)域1也稱為Ni)。展示的多肽可以直接與pill融合(例 如，pill結(jié)構(gòu)域1的N 末端)或使用連接物與pill融合。如果需要，融合體可以進一步 包括標(biāo)記物(例如，myc表位、His標(biāo)記物)?？梢允褂萌魏魏线m的方法來產(chǎn)生包括作為與 噬菌體外殼蛋白的融合蛋白展示的肽或多肽的集的文庫,如通過將編碼展示的肽或多肽的 噬菌體載體或噬粒載體的文庫引入合適的宿主細菌中，并培養(yǎng)所得到的細菌來產(chǎn)生噬菌體 (例如，如果需要，使用合適的輔助噬菌體或互補質(zhì)粒(complementary plasmid))?？梢允?用任何合適的方法從培養(yǎng)物中回收噬菌體文庫,如沉淀和離心。展示系統(tǒng)可以包含含有任何期望的量的多樣性的肽或多肽的集。例如,集可以含有具有對應(yīng)于由生物體、生物體組、期望的組織或期望的細胞類型表達的天然存在多肽的 氨基酸序列的肽或多肽，或可以含有具有隨機或隨機化氨基酸序列的肽或多肽。如果需要， 多肽可以共有共同的核心或支架。舉例來說,所述集或文庫中的所有多肽可以基于選自蛋 白A、蛋白L、蛋白G、纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、anticalin, CTLA4、期望的酶(例如,聚合酶、纖維素 酶)或來自免疫球蛋白超家族的多肽，如抗體或抗體片段(例如，抗體可變結(jié)構(gòu)域)的支 架。所述集或文庫中的多肽可以包含隨機或隨機化氨基酸序列的限定區(qū)域和共同的氨基酸 序列的區(qū)域。在某些實施方式中，集中所有或基本上所有的多肽是期望的類型，如期望的酶 (例如,聚合酶)或期望的抗體的抗原結(jié)合片段(例如,人Vh或人VJ。在優(yōu)選的實施方式 中，所述多肽展示系統(tǒng)包含多肽的集，其中每種多肽包含抗體可變結(jié)構(gòu)域。舉例來說，所述 集中的每種多肽可以含有VH、Vl或Fv (例如,單鏈Fv)?？梢允褂萌魏魏线m的方法將氨基酸序列多樣性引入任何期望的肽或多肽或支架 的區(qū)域中。例如,可以通過使用任何合適的誘變方法(例如,低保真度PCR、寡核苷酸-介導(dǎo) 的或定點突變、使用NNK密碼子的多樣化)或任何其他合適的方法制備編碼多樣化多肽的 核酸的文庫,將氨基酸序列多樣性引入目標(biāo)區(qū)域中，如抗體可變結(jié)構(gòu)域的互補性決定區(qū)或 疏水性結(jié)構(gòu)域。如果需要,可以將待多樣化的多肽區(qū)域隨機化。構(gòu)成集的多肽的大小很大程度上是選擇的問題,并且不需要統(tǒng)一的多肽大小。優(yōu) 選，集中的多肽至少具有三級結(jié)構(gòu)(形成至少一個結(jié)構(gòu)域)。選擇/分離/回收可以使用任何合適的方法從集或文庫(例如,在展示系統(tǒng)中)中選擇、分離和/ 或回收蛋白酶抗性肽或多肽(例如，一群蛋白酶抗性多肽)。優(yōu)選，基于可選擇的特征(例 如，物理特征、化學(xué)特征、功能性特征)來選擇或分離蛋白酶抗性多肽。合適的可選擇的功 能性特征包括集中肽或多肽的生物活性，例如，結(jié)合通用配體(例如，超抗原)、結(jié)合目標(biāo)配 體(例如，抗原、表位、底物)、結(jié)合抗體(例如,通過肽或多肽上表達的表位)和催化活性。 (參見，例如，Tomlinson 等，W099/20749 ；WOO1/57065 ；W099/58655)。在一些實施方式中，從其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽共有共同的可選擇特 征的肽或多肽的文庫或集中選擇和/或分離蛋白酶抗性肽或多肽。例如,可以從其中基本 上所有蛋白酶抗性肽或多肽結(jié)合共同的通用配體、結(jié)合共同的目標(biāo)配體、結(jié)合共同的抗體 (或由其結(jié)合)或具有共同的催化活性的文庫或集中選擇蛋白酶抗性肽或多肽。這種類型 的選擇對于制備基于具有期望的生物活性的親本肽或多肽的蛋白酶抗性肽或多肽的集特 別有用，例如，進行免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的親和性成熟時。
基于結(jié)合共同的通用配體的選擇可以產(chǎn)生含有為原始庫或集成分的全部或基本上全部蛋白酶抗性肽或多肽的肽或多肽的集合或群體。例如，可以通過淘選或使用合適的 親和性基質(zhì)來選擇、分離和/或回收結(jié)合目標(biāo)配體或通用配體(如,蛋白A、蛋白L或抗體) 的肽或多肽?？梢酝ㄟ^將配體(例如,通用配體、目標(biāo)配體)溶液加入合適的容器中(例如， 試管、培養(yǎng)皿)并使配體沉積或覆蓋在容器壁上來完成淘選。將過量的配體洗掉并將肽或 多肽(例如，已經(jīng)用蛋白酶孵育過的集)加入容器中，并將容器維持在適于肽或多肽結(jié)合固 定化配體的條件下。將未結(jié)合的肽或多肽洗掉，使用任何合適的方法(如刮下(scraping) 或降低PH)來回收結(jié)合的肽或多肽。合適的配體親和性基質(zhì)通常含有固體支持物或珠子(例如,瓊脂糖)，配體與其共 價或非共價連接。可以使用分批方法、柱方法或任何其他合適的方法，在適于肽或多肽與基 質(zhì)上的配體結(jié)合的條件下，將親和性基質(zhì)與肽或多肽(例如，已經(jīng)用蛋白酶孵育過的集)組 合。可以將沒有結(jié)合親和性基質(zhì)的肽或多肽洗掉,并使用任何合適的方法將結(jié)合的肽或多 肽洗脫并回收，例如用較低PH的緩沖液、用溫和的變性劑(例如J尿)或競爭與配體結(jié)合的 肽來洗脫。在一個實施例中，在適于集中的肽或多肽結(jié)合目標(biāo)配體的條件F，將生物素化的 目標(biāo)配體與集組合。使用固定化的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素(例如,在珠子上)來回 收結(jié)合的肽或多肽，在--些實施方式中,通用或目標(biāo)配體是抗體或其抗原結(jié)合片段。結(jié)合文庫或集的 肽或多肽中基本上保守的肽或多肽的結(jié)構(gòu)特征的抗體或抗原結(jié)合片段作為通用配體是特 別有用的。對于分離、選擇和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽而適宜用作配體的抗體和抗原 結(jié)合片段可以是單克隆或多克隆的,并可以使用任何合適的方法來制備。文庫/集在其他方面中，本發(fā)明涉及蛋白酶抗性肽和多肽的集、編碼蛋白酶抗性肽和多肽 的文庫以及產(chǎn)生該文庫和集的方法?？梢允褂萌魏魏线m的方法制備或獲得編碼和/或含有蛋白酶抗性肽和多肽的文 庫。本發(fā)明的文庫可被設(shè)計來編碼基于感興趣的肽或多肽(例如,選自文庫的肽或多肽) 的蛋白酶抗性肽或多肽，或可以使用本文所述的方法從另一個文庫選擇本發(fā)明的文庫。例 如，可以使用合適的多肽展示系統(tǒng)來制備富含蛋白酶抗性多肽的文庫。在一個實施例中，如本文所述的,在適于蛋白酶活性的條件下，將含有展示多肽的 集的噬菌體展示文庫與蛋白酶組合,該展示多肽含有免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(例如，VH、 Vk、V λ)。基于期望的生物活性，如結(jié)合活性(例如，結(jié)合通用配體，結(jié)合目標(biāo)配體)，來回 收蛋白酶抗性多肽，由此產(chǎn)生富含蛋白酶抗性多肽的噬菌體展示文庫。在另一個實施例中，首先篩選包含展示的多肽的集的噬菌體文庫來鑒定對期望的 目標(biāo)抗原具有結(jié)合特異性的集成員，該展示多肽含有免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(例如，VH、 Vk、νλ)。并如本文所述的，回收具有期望的結(jié)合特異性的多肽集合，在適于蛋白水解活性 的條件下，將集合與蛋白酶組合。回收具有期望的目標(biāo)結(jié)合特異性的蛋白酶抗性多肽的集 合，產(chǎn)生富含蛋白酶抗性和高親和性多肽的文庫。如本文所述的,該選擇方法中的蛋白酶抗 性與高親和性結(jié)合相關(guān)。可以使用任何合適的方法容易地產(chǎn)生編碼期望的類型多肽集的文庫。例如，可以 獲得編碼期望的類型多肽(例如,聚合酶、免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域)的核酸序列，并可以制備每個含有一個或更多個突變的核酸的集合，例如通過使用易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系 統(tǒng)來擴增核酸，通過化學(xué)誘變(Deng等，J. Biol. Chem. 269 =9533(1994))或使用細菌突變體 菌株(Low 等，J. Mol. Biol.，260 :359(1996))。 在其他實施方式中，為了多樣化,可以靶向核酸的特定區(qū)域。突變選定位置的方法 也是本領(lǐng)域公知的，并包括,例如,使用錯配的寡核苷酸或簡并的寡核苷酸，使用或不使用 PCR0例如，已經(jīng)通過將突變靶向抗原結(jié)合環(huán)形成了合成的抗體文庫。已經(jīng)將隨機或半隨機 抗體113和L3區(qū)域添加至種系免疫球蛋白V基因片段，以產(chǎn)生具有未突變框架區(qū)域的大文 庫(Hoogenboom 和 Winter (1.992)上文；Nissira 等(1994)上文；Griffiths 等(1994)上文； DeKrui降(1995)上文)。將這樣的多樣化延伸來包括--些或全部其他抗原結(jié)合環(huán)(Crameri 等(1996)Nature Med. 2 100 ；Riechmann 等(1995)Bio/Technology, 13 475 ；Morphosys, W097/08320,上文)。在其他實施方式中，對于多樣化，可以靶向核酸的特定區(qū)域,例如，通過 兩步PCR策略,使用第一 PCR的產(chǎn)物作為“mega-引物”。(參見，例如，Landt, 0.等，Gene 96 125-128 (1990) ) 0例如,還可以通過SOE PCR來完成靶向多樣化。(參見,例如,Horton, R. Μ.等，Gene 77:61-68(1989))?？梢酝ㄟ^改變編碼序列來獲得選定位置的序列多樣性，編碼序列限定了多肽的序 列，使得可以在該位置引入各種可能的氨基酸(例如,全部的20個或其子集)。使用IUPAC 命名，最通用的密碼子是NNK,其編碼所有氨基酸以及TAG終止密碼子。優(yōu)選使用NNK密碼 子，以引入期望的多樣性。實現(xiàn)相同目的的其他密碼子也是有用的，包括NNN密碼子，其導(dǎo) 致其他終止密碼子TGA和TAA的產(chǎn)生。這樣的靶向方法使得可以在目標(biāo)區(qū)域中開發(fā)所有的 序列空間。優(yōu)選的文庫包含蛋白酶抗性多肽,其是免疫球蛋白超家族的成員(例如,抗體或 其部分)。例如，文庫可以包含具有已知主鏈構(gòu)象的蛋白酶抗性抗體多肽。(參見，例如， Tomlinson等，W099/20749)?？梢栽诤线m的質(zhì)?；蜉d體中制備文庫。如在此所用的，載體指 的是用于將異源DNA引入用于其表達和/或復(fù)制的細胞中的離散元件?？梢允褂萌魏魏线m 的載體,包括質(zhì)粒(例如,細菌質(zhì)粒)、病毒或細菌噬菌體載體、人造染色體和游離型載體。 這樣的載體可以用于簡單克隆和誘變，或表達載體可以用于驅(qū)動文庫的表達。載體和質(zhì)粒 通常含有一個或更多個克隆位點(例如，多連接物)、復(fù)制起點和至少一個可選擇的標(biāo)記基 因。表達載體可以進一步含有用于驅(qū)動多肽轉(zhuǎn)錄和翻譯的元件,如增強子元件、啟動子、轉(zhuǎn) 錄終止信號、信號序列等?？梢砸钥刹僮鞯剡B接克隆的編碼多肽的插入物的方式來安置這 些元件，使得將該表達載體維持在適于表達的條件F (例如，在合適的宿主細胞中)時，表 達和產(chǎn)生多肽?？寺『捅磉_載體通常含有能夠使載體在一個或更多個選定的宿主細胞中復(fù)制的 核酸序列。通常,在克隆載體中，該序列能夠使載體獨立于宿主染色體DNA而復(fù)制,并包括 復(fù)制起點或自主復(fù)制序列。對于各種細菌、酵母和病毒，這樣的序列是公知的。來自質(zhì)粒 PBR322的復(fù)制起點適用于大部分革蘭氏陰性細菌，2微米質(zhì)粒起點適用于酵母,而各種病 毒起點(例如，SV40,腺病毒)適用于在哺乳動物細胞中克隆載體。通常,對于哺乳動物表達 載體是不需要復(fù)制起點的，除非將這些用于能夠復(fù)制高水平DNA的哺乳動物細胞中，如COS 細胞。克隆或表達載體可以含有也稱為可選擇標(biāo)記的選擇基因。這樣的標(biāo)記基因編碼在選擇性培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化宿主細胞的存活或生長需要的蛋白質(zhì)。因此，沒有用含有選擇 基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞在培養(yǎng)基中將不會存活。通常的選擇基因編碼給予對抗生素和 其他毒素(例如，氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素)抗性、補充營養(yǎng)缺陷不足或提供 生長培養(yǎng)基中不可獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)素的蛋白質(zhì)。合適的表達載體可以含有各種成分,例如，復(fù)制起點、可選擇標(biāo)記基因、一個或更 多個表達控制元件，如轉(zhuǎn)錄控制元件(例如，啟動子、增強子、終止子)和/或一個或更多個 翻譯信號、信號序列或前導(dǎo)序列等。表達控制元件和信號或前導(dǎo)序列如果存在，可以通過載 體或其他來源來提供。例如，克隆的編碼抗體鏈的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列可以用 來指導(dǎo)表達。 可以提供啟動子用于期望的宿主細胞中的表達。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型 的。例如，啟動子可以可操作地連接編碼抗體、抗體鏈或其部分的核酸，使得其指導(dǎo)核酸的 轉(zhuǎn)錄。用于原核宿主(例如,用于大腸桿菌的β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、 色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、lac、tac、T3、T7啟動子)和真核宿主(例如,猿病毒40早期或晚 期啟動子、勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)啟動子、巨細胞病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、EG-Ia 啟動子)的各種合適的啟動子是可獲得的。此外,表達載體通常含有用于選擇攜帶載體的宿主細胞的可選擇標(biāo)記，并且在可 復(fù)制表達載體的情況中,還含有復(fù)制起點。編碼給予抗生素或藥物抗性的產(chǎn)物的基因是常 用的可選擇標(biāo)記，并可以用于原核細胞(例如，內(nèi)酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)、用于 四環(huán)素抗性的Tet基因)和真核細胞(例如，新霉素(G418或遺傳霉素)、gpt (霉酚酸)、 氨芐青霉素或潮霉素抗性基因)。二氫葉酸還原酶標(biāo)記基因使得可以用氨甲喋呤在各種宿 主中選擇。編碼宿主營養(yǎng)缺陷標(biāo)記的基因產(chǎn)物的基因(例如，LEU2、URA3,HIS3)通常用作 酵母中的可選擇標(biāo)記。還考慮了使用病毒(例如，桿狀病毒)或噬菌體載體和能夠整合至 宿主細胞基因組的載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。用于在原核細胞(例如,細菌細胞,如大腸桿菌)或哺乳動物細胞中表達的合適表 達載體包括,例如,PET 載體(例如,pET- 12a、pET-36、pET_37、pET-39、pET-40, Novagen 等)、 噬菌體載體(例如，pCANTAB5E，Pharmacia)、pRIT2T(蛋白 A 融合載體，Pharmacia)、pCDM8、 pCDNAl. 1/amp、pcDNA3. 1、pRc/RSV、pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad，CA)、pCMV-SCRIPT、 pFB、pSG5、pXTl (Stratagene, La Jol la, CA)、pCDEF3 (Goldman, L A.等，Biotechniques, 21 :1013-1015(1996))、pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD)、pEF-Bos (Mizushima, S.等， Nucleic Acids Res. ,18 =5322(1990))等。適用于各種表達宿主如原核細胞(大腸桿菌)、 昆蟲細胞(果蠅Schnideer S2細胞，Sf9)、酵母(P. methanolica、巴斯德畢赤酵母、釀酒酵 母(S.cerevisiae))和哺乳動物細胞(例如，COS細胞)中的表達載體是可獲得的。優(yōu)選的載體是能夠表達對應(yīng)于多肽文庫成員的核苷酸序列的表達載體。因此,可 以通過分幵的繁殖和表達表達多肽文庫成員的單克隆的表達來進行使用通用配體和/或 目標(biāo)配體的選擇。如以上所述的，優(yōu)選的選擇展示系統(tǒng)是細菌噬菌體展示。因此，可以使 用噬菌體或噬粒載體。優(yōu)選的載體是具有大腸桿菌復(fù)制起點(用于雙鏈復(fù)制)以及噬菌 體復(fù)制起點(用于生產(chǎn)單鏈DNA)的噬粒載體。這些載體的操縱和表達是本領(lǐng)域公知的 (Hoogenboom和Winter (1992) ....1二文；Nissim等(1994)上文)。簡而言之，載體可以含有給 予對噬粒的選擇性的β -內(nèi)酰胺酶基因和表達盒上游的Iac啟動子，該表達盒含有合適前導(dǎo)序列、多克隆位點、一個或更多個肽標(biāo)記物、一個或更多個TAG終止密碼子和噬菌體蛋白 PlIIo因此，使用大腸桿菌的各種抑制和非抑制菌株并添加葡萄糖、異丙基硫- β -D-半乳 糖苷(IPTG)或輔助噬菌體如VCS Μ13，載體能夠作為沒有表達的質(zhì)粒復(fù)制，只產(chǎn)生大量多 肽文庫成員或產(chǎn)物噬菌體,其中一些在其表面上含有多肽11融合體的至少一個拷貝。本發(fā)明的文庫和集可以含有抗體形式。例如，文庫和集內(nèi)包含的多肽可以是完 整的抗體或其片段，例如，F(xiàn)ab、F(ab' )2、Fv或scFv片段、獨立的Vh或\結(jié)構(gòu)域，其中 任一個是修飾的或未修飾的?？梢允褂萌魏魏线m的方法，容易地產(chǎn)生scFv片段，以及其 他抗體多肽。各種合適的抗體工程化方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可以通過將編碼兩 個可變結(jié)構(gòu)域的核酸連接合適的編碼合適的連接肽的寡核苷酸來形成scFv,連接肽如 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3或其他合適的連接肽。連接物橋接第一 V區(qū)的C-端和第二 V區(qū) 的N-端?？梢允褂孟嗨频募夹g(shù)，用于構(gòu)建其他抗體形式,如Fv、Fab和F(ab’)2片段。為了 使Fab和F (ab’ ) 2格式化,可以將Vh和\多肽與恒定區(qū)片段組合，恒定區(qū)片段分離自重排 基因、種系C基因或從抗體序列數(shù)據(jù)合成的。根據(jù)本發(fā)明的文庫或集可以是Vtl或\文庫或 集。包含蛋白酶抗性可變結(jié)構(gòu)域的多肽優(yōu)選的包含目標(biāo)配體結(jié)合位點和/或通用配 體結(jié)合位點。在某些實施方式中,通用配體結(jié)合位點是用于超抗原(如蛋白A、蛋白L或蛋白 G)的結(jié)合位點?？勺兘Y(jié)構(gòu)域可以基于任何期望的可變結(jié)構(gòu)域,例如,人VH(例如,VtIla、VHlb、 VH2、VH3、VH4、VH5、VH6)、人 νλ (例如，V λ I、V λ II、V λ III、V λ IV、V λ V、V λ VI 或 V κ 1)或 AVK (例如，VK 2，Vic 3，Vic 4，Vk 5，VK 6, VK 7, VK 8，Vic 9 或 VK 10)。核酸、宿主細胞和生產(chǎn)蛋白酶抗性多肽的方法本發(fā)明還涉及分離的和/或重組的編碼蛋白酶抗性肽或多肽,例如,通過本文所 述的方法可選擇或選擇的肽或多肽，的核酸。在此稱為“分離的”核酸是已經(jīng)與原始環(huán)境(例如，在細胞或在核酸混合物如文庫 中)中的其他物質(zhì)(例如,其他核酸,如基因組DNA、cDNA和/或:RNA)分開的核酸。分離的 核酸可以作為載體(例如，質(zhì)粒)的一部分來分離。在此稱為“重組的”核酸是通過重組DNA方法產(chǎn)生的核酸，重組DNA方法包括依賴 于人工重組的方法，如克隆至載體或染色體中，使用例如，限制性酶、同源重組、病毒等，以 及使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備的核酸。本發(fā)明還涉及重組宿主細胞,其包括(一個或更多個)重組核酸或含有編碼蛋白 酶抗性肽或多肽的核酸的表達構(gòu)建體，所述蛋白酶抗性肽或多肽例如，通過本文所述的方 法可選擇的或選擇的肽或多肽。本發(fā)明還包括制備蛋白酶抗性肽或多肽的方法，其包括將 本發(fā)明的重組宿主細胞維持在適于蛋白酶抗性肽或多肽表達的條件下。如果需要,該方法 可以進一步包括分離或回收蛋白酶抗性肽或多肽的步驟。例如，可以使用任何適于選定宿主細胞的方法(例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、感染)， 將編碼蛋白酶抗性肽或多肽的核酸分子(即，一個或更多個核酸分子)，或含有該核酸分子 的表達構(gòu)建體(即，一個或更多個構(gòu)建體)引入合適的宿主細胞中，以形成重組宿主細胞， 使得核酸分子可操作地連接--個或更多個表達控制元件(例如,在載 體中、在通過細胞中 的加工形成的構(gòu)建體中、整合至宿主細胞基因組)?？蓪⑺玫降闹亟M宿主細胞維持在適于 表達的條件下(例如，在誘導(dǎo)劑的存在下、在合適的動物中、在補充了適當(dāng)鹽、生長因子、抗生素、營養(yǎng)補充劑等的合適培養(yǎng)基中等)，由此產(chǎn)生編碼的肽或多肽。如果需要，可以分離或 回收編碼的肽或多肽(例如，從動物、宿主細胞、培養(yǎng)基、乳)。該方法包括在轉(zhuǎn)基因動物的 宿主細胞中的表達(參見，例如，W092/03918，GenPharm International)。還可以在合適的體外表達系統(tǒng)中，通過化學(xué)合成或通過任何其他合適的方法,來 產(chǎn)生通過本文所述的方法選擇的蛋白酶抗性肽或多肽。多肽、dAb&拮抗劑如本文所述和舉例說明的，本發(fā)明的蛋白酶抗性dAb通常以高親和性結(jié)合它們的 目標(biāo)配體。因此，在另一個方面中，提供了選擇、分離和/或回收本發(fā)明的以高親和性結(jié)合 目標(biāo)抗原的多肽或dAb。通常,該方法包括提供肽或多肽(例如,dAb)的文庫或集,在適于蛋 白酶活性的條件下，將文庫或集與蛋白酶(例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme、胰酶、 痰液)組合,并選擇、分離和/或回收結(jié)合配體(例如，目標(biāo)配體)的肽或多肽。因為已經(jīng) 在蛋白酶敏感性肽或多肽將得到消化的條件下將文庫或集暴露于蛋白酶，因此蛋白酶的活 性可以消除具有低結(jié)合親和性的不太穩(wěn)定的多肽,并因此產(chǎn)生高親和性結(jié)合肽或多肽的集 合。例如，本發(fā)明的多肽或dAb可以以1 u M或更強、或約500nM到約0. 5pM的親和性(KD， ！^二！^乂！^出/^！^^，如通過表面等離子體共振所測定的)來結(jié)合目標(biāo)抗原。例如，本發(fā) 明的多肽或dAb可以以約500nM、約lOOnM、約lOnM、約InM、約500pM、約lOOpM、約10pM、約 lpM或約0.5pM的親和性結(jié)合目標(biāo)抗原(例如，TNFR1)。盡管我們沒有受到任何特定理論 的束縛，認(rèn)為能抵抗蛋白酶的肽或多肽具有較低的熵和/或較高的穩(wěn)定能量。因此，蛋白酶 抗性與高親和性結(jié)合之間的關(guān)聯(lián)可能與通過本文所述的方法選擇的肽和多肽和dAb表面 的緊密性和穩(wěn)定性相關(guān)。在一個實施方式中，本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑以約500nM到50pM、或100nM到 50pM、或10nM到100pM、或InM到100pM ；例如50nM或更低、或5nM或更低、或500pM或更低、 或200pM或更低、或100pM或更低的抑制濃度50 (IC50)抑制抗原配體(例如，TNF a )與它 的相關(guān)受體(例如，TNF a受體I (p55受體))的結(jié)合。在某些實施方式中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合目標(biāo)抗原,并與人目標(biāo)抗原 解離，具有300nM至lpM的解離常數(shù)(Kd)，或300nM至5pM，或50nM至lpM,或50nM至5pM， 或50nM至20pM，或約10pM，或約15pM,或約20pM，如通過表面等離子體共振所測定的。在 某些實施方式中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合目標(biāo)抗原(例如，TNFR1,人TNFRI)，并 與目標(biāo)抗原解離，具有SXIO、-1至lXloW或lXlO、-1至IXICTs—1、或lXlO、-1至 IXICTs—1、或lXlO、—1至丄父川 人或丄父川 弋或丄父川、-1的K。ff速度常數(shù)，如通過 表面等離子體共振所測定的。在某些實施方式中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合目標(biāo)抗 原(TNFR1,例如，人類 TNFRI),具有 1 X lO^s"1 至 1 X lO^M^s"1 的 K。n,或 1 X lO^r's"1 至 1 X lO-W1，或約1 X lO-Vs-1或約1 X KTW1。在--個實施方式中，多肽、dAb或拮抗劑 特異性地結(jié)合目標(biāo)抗原(例如，TNFR1，例如，人類TNFRI)，并與目標(biāo)抗原解離，具有在本段 落中限定的解離常數(shù)(Kd)和K。ff。在一個實施方式中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合目 標(biāo)抗原(例如，TNFR1,例如，人類TNFRI)，并與目標(biāo)抗原解離,具有本段落中限定的解離常 數(shù)(Kd)和K。n。在一些實施方式中，多肽或dAb特異性地結(jié)合目標(biāo)抗原(例如TNFR1,(例 如，人類TNFR1))，具有該段落中引用的KD和/或K。ff和/或K。n，并包括與附圖中所示免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為至少或至少約80 %、85 %、90 %、91 %、92 %、93 %、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列?？梢栽诖竽c桿菌或畢赤酵母屬種(例如，巴斯德畢赤酵母)中表達多肽、dAb或拮 抗劑。在一個實施方式中,在大腸桿菌或畢赤酵母屬種(例如，巴斯德畢赤酵母)中表達時， 以至少約0. 5mg/L的量來分泌配體或dAb單體。盡管,在大腸桿菌或畢赤酵母屬種(例如, 巴斯德畢赤酵母)中表達時,本文所述的配體和dAb單體是可分泌的,可以使用任何合適的 方法來生產(chǎn)，如合成的化學(xué)方法或沒有使用大腸桿菌或畢赤酵母屬種的生物生產(chǎn)方法。在一些實施方式中，多肽、dAb或拮抗劑不含有Camel id免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域, 或一個或更多個框架氨基酸，這些氨基酸對于由Caraelid種系抗體基因片段編碼的免疫球 蛋白可變結(jié)構(gòu)域是獨特的，例如,在位置108、37、44、45和/或47。根據(jù)本發(fā)明的拮抗劑可以是單價的或多價的。在一些實施方式中，拮抗劑是單價 的并含有一個與目標(biāo)抗原相互作用的結(jié)合位點，該結(jié)合位點是由本發(fā)明的多肽或dAb提供 的。單價拮抗劑結(jié)合一個目標(biāo)抗原并可以不誘導(dǎo)導(dǎo)致受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的細胞表面上的 目標(biāo)抗原(例如,受體抗原)的交聯(lián)或聚集(clustering)。在其他實施方式中，拮抗劑是多價的。多價拮抗劑可以含有兩個或更多個用于目 標(biāo)抗原的特定結(jié)合位點的拷貝或含有兩個或更多個結(jié)合目標(biāo)抗原的不同結(jié)合位點，至少一 個結(jié)合位點是由本發(fā)明的多肽或dAb提供的。例如,如本文所述的，拮抗劑可以是二聚體、 三聚體或多聚體，其含有兩個或更多個本發(fā)明的結(jié)合目標(biāo)抗原的特定多肽或dAb的拷貝， 或兩個或更多個本發(fā)明的結(jié)合目標(biāo)抗原的不同多肽或dAb。在一個實施方式中，多價拮抗 劑結(jié)合細胞表面受體抗原，并且在標(biāo)準(zhǔn)的細胞分析中基本上不激動抗原(作為抗原的激動 劑)。在某些實施方式中，多價拮抗劑含有兩個或更多個用于目標(biāo)抗原的期望的表位或 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點。在其它實施方式中，多價拮抗劑含有結(jié)合目標(biāo)抗原的不同表位或結(jié)構(gòu)域的、由本 發(fā)明的多肽或dAb提供的兩個或更多個結(jié)合位點。在某些實施方式中,給予有效量時,本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑在慢性炎癥疾病 的模型中是有效的。通常，有效量為約lmg/kg至約10mg/kg(例如，約lmg/kg，約2mg/kg,約 3mg/kg,約 4mg/kg,約 5mg/kg，約 6mg/'kg,約 7mg/'kg,約 8mg/kg，約 9mg/kg 或約 10mg/'kg)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為慢性炎癥的模型(參見W02006038027中描述的那些)預(yù)示著在人體 中的治療功效。通常，本發(fā)明的配體(例如，拮抗劑)將以純化的形式與藥物學(xué)....丨二合適的載體一起 使用。通常，這些載體包括水或醇/水溶液、乳液或懸浮液、任何包括鹽和/或緩沖的基質(zhì)。 腸胃外載體包括氯化鈉溶液、Ringer’ s葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸化Ringer’ s。如果 需要在懸浮液中保持多肽復(fù)合物,合適的生理學(xué)上可接受的佐劑可以選自增稠劑，如羧甲 基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽。靜脈內(nèi)載體包括流體和營養(yǎng)補充劑和電解質(zhì)補充劑，如基于Ringer’ s葡萄糖 的那些。防腐劑和其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體,也可以存在 (Mack(1982) Remington' sPharmaceutical Sciences,第 16 版)?？梢允褂酶鞣N合適的制 劑，包括緩釋制劑。本發(fā)明的配體(例如,拮抗劑)可以用作分開給藥的組合物或聯(lián)合其他藥劑。這些可包括各種免疫治療藥物，如環(huán)孢霉素、氨甲喋呤、阿霉素或順鉬和免疫毒素。藥物組合 物可以包括各種細胞毒性或其他藥劑與本發(fā)明配體聯(lián)合的“cocktails”，或甚至是根據(jù)本 發(fā)明的具有不同特異性的配體的組合，如使用不同目標(biāo)抗原或表位選擇的配體，不管是否 是在給藥之前混合。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑可以是任何本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些。對 于治療，包括但不限于免疫治療，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將本發(fā)明選定的配體給藥于任何患者。 給藥可以是任何合適的模式，包括腸胃外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、通過肺的 途徑，或者其他,合適地，通過用導(dǎo)管直接灌輸。給藥的劑量和頻率將取決于患者的年齡、性 別和狀況、其他藥物的同時給藥、禁忌和醫(yī)師將要考慮的其他參數(shù)。如所示的,給藥可以是 局部(例如，通過肺部給藥局部遞送至肺，例如，鼻內(nèi)給藥)或全身的。可以將本發(fā)明的配體凍干，用于存儲以及在使用前在合適的載體中重建。已經(jīng)表 明該技術(shù)對常規(guī)的免疫球蛋白是有效的，并可以使用本領(lǐng)域已知的凍干和重建技術(shù)。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將認(rèn)識到凍干和重建可能導(dǎo)致抗體活性不同程度的損耗(例如，使用常規(guī)的免 疫球蛋白，IgM抗體的活性損耗易于比IgG抗體高)，可以調(diào)高使用水平來補償。可以將含有本發(fā)明配體(例如，拮抗劑)或其cocktail的組合物給藥來用于預(yù)防 和/或治療處理。在特定的治療應(yīng)用中，將實現(xiàn)選定細胞群的至少部分抑制(inhibition)、 阻抑(suppression)、調(diào)節(jié)、殺滅或一些其他可測量參數(shù)的適當(dāng)含量定義為“治療有效量”。 實現(xiàn)該劑量需要的含量將取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者自身免疫系統(tǒng)的一般狀況，但通常 為0. 005至5. Omg配體/kg體重，配體例如為dAb或拮抗劑，更常使用0. 05至2. Omg/kg/齊 的劑量。對于預(yù)防性應(yīng)用，可以給藥相似或略低劑量的含有本發(fā)明配體或其cocktail的組 合物，以預(yù)防、抑制或延遲疾病的發(fā)作(例如，維持緩解或靜止,或防止急性期)。本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠測定治療、阻抑或預(yù)防疾病的合適給藥間隔。將TNFRl的配體(例如，拮抗劑) 給藥來治療、阻抑或預(yù)防慢性炎癥疾病時,可以給藥最高達四次/天，每周兩次，每周一次， 每兩周一次,一月一次或每兩月一次,例如，劑量為約10 μ g/kg至約80rag/kg,約100 μ g/kg 至約 80mg/kg,約 lmg/kg 至約 80mg/'kg,約 lmg/kg 至約 70mg/kg,約 lmg/'kg 至約 60mg/kg, 約 lmg/kg 至約 50mg/kg，約 lmg/kg 至約 40mg/kg，約 lmg/kg 至約 30mg/kg,約 lmg/kg 至約 20mg/kg,約 lmg/kg 至約 10mg/kg,約 10 μ g/kg 至約 1 Omg/kg,約 10 μ g/kg 至約 5mg/kg,約 10 μ g/kg 至約 2. 5mg/kg,約 lmg/kg,約 2mg/kg,約 3mg/kg,約 4rag/kg,約 5mg/kg,約 6mg/ kg,約7mg/kg,約8mg/kg,約9mg/kg或約10mg/kg。在特定的實施方式中，將TNFRl的配體 (例如，拮抗劑)給藥來治療、阻抑或預(yù)防慢性炎癥疾病，每兩周一次或一月一次，劑量為約 10 μ g/kg 至約 1 Omg/kg (例如，約 10 μ g/kg,約 100 μ g/kg,約 lmg/kg,約 2mg/kg,約 3mg/kg, 約 4rag/kg，約 5mg/:kg,約 6mg/kg,約 7mg/kg,約 8mg/kg,約 9rag/kg 或約 10rag/kg)。如果相對于治療前存在的癥狀，或相對于沒有用該組合物治療的個體(人或 模型動物)或其他合適對照中的癥狀，一種或更多種癥狀得到減輕(例如，至少10%或 臨床評價等級的至少一個點)，認(rèn)為使用本文所述的組合物進行的處理或治療是"有效 的”。癥狀將根據(jù)靶向的疾病或病癥而明顯不同，但可以通過普通醫(yī)師或技術(shù)人員來測 量。例如,可以通過監(jiān)控疾病或病癥的一個或更多個生化指示劑的水平(例如，與疾病相 關(guān)的酶或代謝產(chǎn)物的水平、受影響細胞的數(shù)目等)、通過監(jiān)控身體表現(xiàn)(例如，炎癥、腫瘤 大小等)，或通過公認(rèn)臨床評價等級，例如，擴展的殘疾狀態(tài)等級(Expanded DisabilityStatus Scale,用于多發(fā)性硬化)、Irvine 炎癥性腸病問卷(Irvine Inflammatory Bowel DiseaseQuestionnaire (32點評定評估關(guān)于腸功能、全身性癥狀、社會功能和情緒狀態(tài)的生 活質(zhì)量,計分從32到224，更高的計分表明更好的生活質(zhì)量)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的生活質(zhì)量 等級(Quality of Life RheuraatoidArthritis Scale),或本領(lǐng)域已知的其他公認(rèn)的臨床評 估等級,來測量該癥狀。在疾病或病癥癥狀方面維持降低(例如,一天或更多天,或更久) 至少10%或給定臨床等級的一個或更多個點值，是“有效的”治療的指示。相似地，如果相對于未用組合物治療的相似個體(人或動物模型)中的癥狀，一種或更多種癥狀的發(fā)作或 嚴(yán)重程度得到了延遲、減輕或消除,使用本文所述的組合物進行的預(yù)防是"有效的"?？梢栽陬A(yù)防或治療情境中使用含有根據(jù)本發(fā)明的配體(例如，拮抗劑)或其 cocktail的組合物，以幫助改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中選定的目標(biāo)細胞群。此外，本 文所述的選定的多肽集可以體外地(extracorporealIy)或在體外(in vitro)選擇性地從 異源細胞集合中殺滅、耗盡或另外有效地除去目標(biāo)細胞群?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將來自哺乳 動物的血液在體外與配體組合，由此殺滅或另外從用于返回至哺乳動物的血液中除去不期 望的細胞?？梢栽陬A(yù)防或治療情況中使用含有根據(jù)本發(fā)明的配體(例如，拮抗劑)的組合物， 以幫助改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中選定的目標(biāo)細胞群?？梢詫⑴潴w(例如,抗_目標(biāo)抗原拮抗劑、dAb單體)給藥,和或與一種或更多種 其他的治療劑或活性劑一起配制。配體(例如，dAb)與其他的治療劑一起給藥時，可以在 給藥其他藥劑之前、同時或之后，給藥配體。通常，以提供重疊治療效果的方式來給藥配體 和其他藥劑。在一個實施方式中,本發(fā)明是用于治療、阻抑或預(yù)防慢性炎癥疾病的方法,包括將 治療有效劑量或數(shù)量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑給藥于需要其的哺乳動物。在一個實施方式中，本發(fā)明是治療、阻抑或預(yù)防關(guān)節(jié)炎(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強硬性脊椎炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎)的方法,包括向需要其的哺 乳動物施用治療有效劑量或數(shù)量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑。在另一個實施方式中，本發(fā)明是治療、阻抑或預(yù)防銀屑病的方法，包括向需要其的 哺乳動物施用治療有效劑量或數(shù)量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑。在另一個實施方式中，本發(fā)明是治療、阻抑或預(yù)防炎癥性腸病(例如，Crohn' s 病、潰瘍性結(jié)腸炎)的方法,包括向需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或數(shù)量的根據(jù)本 發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑。在另一個實施方式中,本發(fā)明是治療、阻抑或預(yù)防慢性阻塞性肺病(例如,慢性支 氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎、肺氣腫)的方法,包括向需要其的哺乳動物施用治療有效劑 量或數(shù)量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑。在另一個實施方式中，本發(fā)明是治療、阻抑或預(yù)防肺炎(例如，細菌性肺炎，例如 葡萄球菌肺炎)的方法，包括向需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或數(shù)量的根據(jù)本發(fā)明 的多肽、dAb或拮抗劑。本發(fā)明提供了治療、阻抑或預(yù)防除了慢性阻塞性肺病和肺炎之外的其他肺部疾病 的方法。根據(jù)本發(fā)明可以被治療、阻抑或預(yù)防的其他肺部疾病包括，例如，囊性纖維化和哮 喘(例如，類固醇抗性哮喘)。因而，在另一個實施方式中,本發(fā)明是治療、阻抑或預(yù)防肺部疾病(例如,囊性纖維化，哮喘)的方法，包括向需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或數(shù) 量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑。在特定的實施方式中，拮抗劑是經(jīng)由肺部遞送，例如，通過吸入(例如,支氣管內(nèi) 的、鼻內(nèi)的或口腔的吸入,鼻內(nèi)的滴劑)或通過全身性遞送(例如,腸胃外的、靜脈內(nèi)的、肌 肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮下的)來施用的。在另一個實施方式中，本發(fā)明是治療、阻抑或預(yù)防膿毒性休克的方法，包括向需要 其的哺乳動物施用治療有效劑量或數(shù)量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑。在本發(fā)明的進一步的方面中，提供了組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或拮 抗劑，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。此外，本發(fā)明提供了利用根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑或組合物治療疾病的 方法。在一個實施方式中，所述疾病是癌癥或炎性疾病，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘或 Crohn，s 病。形式提高的半衰期在免疫球蛋白，特別是抗體，最特別是小尺寸的抗體片段的體內(nèi)應(yīng) 用中是有用的。這樣的片段(Fv、二硫化物鍵合的FV、Fab、scFV、dAb)能從體內(nèi)快速清除； 因此，盡管它們能夠快速地到達身體的大部分部位,并且能快速產(chǎn)生和更容易操作,但它們 在體內(nèi)的應(yīng)用受到僅在體內(nèi)短暫持續(xù)的限制。本發(fā)明的一個實施方式通過提供體內(nèi)半衰期 延長的配體并且隨后配體的功能活性在體內(nèi)持續(xù)更長時間來解決了該問題。藥物動力學(xué)分析和配體半衰期的測定的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。可 以 在 Kenneth, A 等Chemical Stability of Pharmaceuticals :AHandbook for Pharmacists (藥物動力學(xué)的化學(xué)穩(wěn)定性藥劑師手冊)和Peters等，Pharmacokinetc analysis =A Phactical Approach(藥物動力學(xué)分析實踐方法)(1996)中找到詳細內(nèi)容。 還可以參考“Pharmacokinetics”(藥物動力學(xué))，M Gibaldi & D Perron, Mtircel Dekker 出版，2nd ReV.eXediti0n(1982),其描述了藥物動力學(xué)參數(shù),如tcx和 β半衰期和曲線下 面積(AUC)?？梢詮呐潴w隨時間的血清濃度曲線確定半衰期(t1/2a和t1/20)和AUC。例如，可 以使用 WinNonlin 分析包(從 Pharsight Corp.，MountainView, CA94040, USA 獲得)來模 擬曲線。在第一期中(α期)，配體主要經(jīng)歷在患者中的分布,并有一些清除。第二期(β 期)是配體已經(jīng)得到分布的末期，血清濃度隨著配體從患者體內(nèi)清除出去而降低。t α半衰 期是第一期的半衰期，而t.13半衰期是第二期的半衰期。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明 提供了具有15分鐘或更長t α半衰期的根據(jù)本發(fā)明的配體或含有配體的組合物。在一個 實施方式中，范圍的下限是30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、 7小時、10小時、11小時或12小時。此外,或可替換地,根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物將具有 最高達并包括12小時的ta半衰期。在一個實施方式中，范圍的....Ll限是11、10、9、8、7、6或 5小時。合適范圍的實例是1至6小時，2至5小時或3至4小時。在一個實施方式中，本發(fā)明提供具有2. 5小時或更長t β半衰期的根據(jù)本發(fā)明的 配體(多肽、dAb或拮抗劑)或含有配體的組合物。在一個實施方式中，范圍的下限是3小 時，4小時，5小時，6小時，7小時，10小時，11小時或12小時。此外，或可替換地，根據(jù)本發(fā) 明的配體或組合物將具有最高達并包括21天的t β半衰期。在一個實施方式中，范圍的上限是12小時,24小時,2天,3天,5天，10天，15天或20天。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā) 明的配體或組合物將具有12至60小時的t β半衰期。在進一步的實施方式中，將是12至 48小時。在仍然進一步的實施方式中，將是12至26小時。對于以上標(biāo)準(zhǔn)，另外或可替換地,本發(fā)明提供了具有l(wèi)mg.min/m:[或更高AUC值 (曲線下面積)的根據(jù)本發(fā)明的配體或含有配體的組合物。在--個實施方式中，范圍的下限 是5、10、15、20、30、100、200或300mg. min/ml。此外，或可替換地，根據(jù)本發(fā)明的配體或組合 物具有最高達600mg. min/ml的AUC。在一個實施方式中，范圍的上限是500、400、300、200、 150、100、75或50rag. min/ml。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的配體具有選自以下范圍的 AUC 15 至 150mg. min/ml, 15 至 IOOmg. min/ml, 15 至 75mg. min/ml 禾Π 15 至 50mg. min/ml。例如，通過連接PEG基團、血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或至少其轉(zhuǎn)鐵蛋 白結(jié)合部分、抗體Fc區(qū)，或通過綴合抗體結(jié)構(gòu)域,將本發(fā)明的多肽和dAb以及含有這些的拮 抗劑格式化，以具有較大的流體動力學(xué)大小。例如，將多肽dAb和拮抗劑格式化成較大的抗 體的抗原結(jié)合片段或抗體(例如,格式化成Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、IgG、scFv)。 可以使用本領(lǐng)域公知的方法來測定本發(fā)明配體(例如，dAb單體或多聚體)的流 體動力學(xué)大小。例如,凝膠過濾色譜可以用來測定配體的流體動力學(xué)大小。用于測定配體 的流體動力學(xué)大小的合適的凝膠過濾基質(zhì)，如交聯(lián)的瓊脂糖基質(zhì)，是公知的并容易獲得。配體形式的大小(例如,連接dAb單體的PEG部分的大小)可以根據(jù)期望的應(yīng)用 而改變。例如，在打算將配體離開循環(huán)并進入外周組織的情況中，希望保持低的配體流體動 力學(xué)大小，以促進從血流中外滲?；蛘?，在期望配體在全身循環(huán)中保持更長時間的情況中， 可以提高配體的大小，例如,通過格式化成Ig樣蛋白。通.過靶_提-高體內(nèi)丨半衰其月的抗JL或表位來延長半衰其月如本文所述的，還可以通過將本發(fā)明的目標(biāo)抗原結(jié)合多肽、dAb或拮抗劑綴合或 締合結(jié)合提高體內(nèi)半衰期的抗原或表位的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，抗體或抗體片段)來提高 配體的流體動力學(xué)大小及其血清半衰期。例如,可以將目標(biāo)抗原結(jié)合劑(例如，多肽)綴 合或連接抗_血清白蛋白或抗-新生兒Fc受體抗體或抗體片段,例如，抗-SA或抗新生 兒Fc受體dAb、Fab、Fab，或scFv，或抗-SA affibody或抗-新生兒Fc受體affibody或 抗-SA avimer，或抗-SA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其包含選自但優(yōu)選不限于CTLA-4、lipocallin, SpA, affibody,avimer,GroEl和纖連蛋白的支架(對于這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域的公開內(nèi)容,參見,PCT/ GB2008/000453,2008年2月8日申請,在此將該結(jié)構(gòu)域及其序列通過援引并入,并形成本發(fā) 明文本公開內(nèi)容的部分)。綴合指的是含有結(jié)合(共價或非共價)于結(jié)合血清白蛋白的結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑的組合物。提高體內(nèi)血清半衰期的合適多肽包括,例如,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性配體-神經(jīng)藥 劑融合蛋白(參見,U. S.專利No. 5，977，307,在此將其教導(dǎo)通過援引并入)、腦毛細管內(nèi)皮 細胞受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(例如，可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)、胰島素、胰島素樣生長 因子I(IGFl)受體、胰島素樣生長因子2(IGF2)受體、胰島素受體、凝血因子X、α 1-抗胰蛋 白酶和HNFl α。合適的提高血清半衰期的多肽還包括α 1-糖蛋白(血清類粘蛋白；AAG)、 α 1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α 1-微球蛋白(蛋白HC ；AIM)、抗凝血酶III (AT III)、載脂 蛋白A-l(Ap0 A-1)、載脂蛋白B(Apo B)、血漿銅藍蛋白(Cp)、補體成分C3 (C3)、補體成分 C4(C4)、Cl彈性蛋白酶抑制劑(Cl INH)、C-反應(yīng)性蛋白(CRP)、鐵蛋白(FER)、血紅素結(jié)合蛋白(HPX)、脂蛋白(a) (Lp (a))、甘露糖-結(jié)合蛋白(MBP)、肌紅蛋白(Myo)、前清蛋白(甲 狀腺素運載蛋白(transthyretin) ；PAL)、視黃醇-結(jié)合蛋白(RBP)和類風(fēng)濕因子(RF)。來自胞外基質(zhì)的合適蛋白包括，例如，膠原蛋白、層粘連蛋白、整聯(lián)蛋白和纖連蛋 白。膠原蛋白是胞外基質(zhì)主要的蛋白。目前已知約15種類型的膠原蛋白分子，在身體的不 同部位發(fā)現(xiàn)，例如,在骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內(nèi)臟中發(fā)現(xiàn)的I型膠 原蛋白(占身體膠原蛋 白的90% )，或在軟骨、脊椎盤、脊索和眼的玻璃體液中發(fā)現(xiàn)的II型膠原蛋白。來自血液的合適蛋白包括，例如，血漿蛋白(例如，纖維蛋白、α -2巨球蛋白、血清 白蛋白、纖維蛋白原(例如,纖維蛋白原Α、纖維蛋白原B)、血清淀粉狀蛋白Α、結(jié)合珠蛋白、 抑制蛋白、泛素、子宮球蛋白和β -2-微球蛋白)、酶和酶抑制劑(例如,纖維蛋白溶酶原、溶 菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CyStatin)C、α -1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑)、免 疫系統(tǒng)的蛋白，如免疫球蛋白(例如，IgA、IgD, IgE, IgG、1#、免疫球蛋白輕鏈(κ / λ))、 轉(zhuǎn)運蛋白(例如,視黃醇結(jié)合蛋白、α 微球蛋白)、防衛(wèi)素(例如，β —防衛(wèi)素1、嗜中性白 細胞防衛(wèi)素1、嗜中性白細胞防衛(wèi)素2和嗜中性白細胞防衛(wèi)素3)等。在血腦屏障或神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的合適蛋白包括，例如，黑皮質(zhì)素受體、髓磷脂、抗 壞血酸轉(zhuǎn)運蛋白等。提高體內(nèi)血清半衰期的合適多肽還包括位于腎臟中的蛋白(例如，多囊蛋白、IV 型膠原蛋白、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白KKHeymann’ s抗原)、位于肝臟中的蛋白(例如,醇脫 氫酶、G250)、位于肺中的蛋白(例如，分泌成分，其結(jié)合IgA)、位于心臟中的蛋白(例如， HSP27，其與擴張型心肌病相關(guān))、位于皮膚中的蛋白(例如，角蛋白)、骨特異性蛋白，如 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP),其是顯示了骨形成活性的蛋白的轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的亞組 (例如，ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8)、腫瘤特異性蛋白(例如,滋養(yǎng)層抗原、 herceptin受體、雌激素受體、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B，其可以在肝臟和脾臟中找 到)。合適的疾病特異性蛋白包括，例如，只在激活的T-細胞上表達的抗原，包括 LAG-3(淋巴細胞激活基因)、骨保護素配體(0PGL ；參見Nature 402，304-309 (1999)), 0X40 (TNF受體家族的成員，在激活的T細胞上表達并在人I-型T細胞白血病病毒(HTLV-I) 產(chǎn)生細胞中特異性地上調(diào)；參見Immunol. 165(1) :263-70 (2000))。合適的疾病特異性 蛋白還包括，例如，金屬蛋白酶(與關(guān)節(jié)炎/癌癥相關(guān))，包括CG6512果蠅、人截癱蛋白 (paraplegin)、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH ；和血管生成生長因子,包括酸性成纖維細胞生 長因子(FGF-I)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF-2)、血管內(nèi)皮生長因子/血管通透因子 (VEGF/VPF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α (TGF α )、腫瘤壞死因子-α (TNF- α )、血管生成素、白細胞 介素(IL~3)、白細胞介素-8 (IL~8)、血小板衍生內(nèi)皮生長因子(PD-ECGF)、胎盤生長因子 (PlGF)、中期因子(midkine)血小板-衍生生長因子-BB (PDGF)和CXXXC趨化因子。提高體內(nèi)血清半衰期的合適多肽還包括應(yīng)激蛋白，如熱休克蛋白(HSP)。HSP通常 在細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。在胞外發(fā)現(xiàn)時,它是細胞已經(jīng)死亡并溢出其內(nèi)含物的指示劑。作為創(chuàng)傷、疾 病或損傷的結(jié)果時,發(fā)生這種非程序化細胞死亡(壞死)，胞外HSP引發(fā)了來自免疫系統(tǒng)的 應(yīng)答。結(jié)合胞外HSP可以導(dǎo)致將本發(fā)明的組合物定位于患病部位。涉及Fc轉(zhuǎn)運的合適蛋白包括，例如，Brambell受體(也稱為FcRB)。這種Fc受 體具有兩個功能，對于遞送都是潛在有用的。功能是(1)通過胎盤將IgG從母體轉(zhuǎn)運至子女，(2)保護IgG免受降解，由此延長其血清半衰期。認(rèn)為受體使來自核內(nèi)體的IgG再循環(huán)。(參見，Holliger 等，Nat Biotechnol 15(7) :632_6 (1997))。齢血清傾_dAb在一個實施方式中，本發(fā)明提供了多肽或拮抗劑(例如,雙特異性配體)，其含有 結(jié)合目標(biāo)抗原的抗目標(biāo)抗原dAb (第一 dAb)和結(jié)合血清白蛋白(SA)的第二 dAb,第二 dAb結(jié) 合SA，具有通過表面等離子體共振測定的InM至1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、 200、300、400 或 500 μ M(即，X 10 9 至 5Χ 10 4)的 Kd,或 IOOnM 至 10 μ Μ,或 1 至 5 μ Μ,或 3 至70ηΜ,或IOnM至1、2、3、4或5 μ Μ。例如,30至70ηΜ,如通過表面等離子體共振所測定 的。在一個實施方式中，第一dAb(或dAb單體)結(jié)合SA (例如,HSA),具有通過表面等離子 體共振測定的大約1、50、70、100、150、200、300崖或1、2或3 μ M的Kd。在一個實施方式中， 對于含有第一抗-Sk dAb和第二對目標(biāo)抗原的dAb的雙特異性配體，第二 dAb對其目標(biāo)的 親和性(例如!^和/或^…如通過表面等離子體共振所測量的,例如使用BiaCore)為第 -一 dAb對SA的親和性的1至100000倍(例如，100至100000，或1000至100000，或10000 至100000倍)。在一個實施方式中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。例如，第一 dAb以 大約10 μ M的親和性結(jié)合SA，而第二 dAb以IOOpM的親和性結(jié)合其目標(biāo)。在一個實施方式 中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一個實施方式中，第一 dAb以大約50，例如,70、 100、150或200nM的Kd結(jié)合SA (例如，HSA)。雙特異性配體的詳細內(nèi)容可以在W003002609、 W004003019 和 W004058821 中找到。在一個實施方式中，本發(fā)明的配體包含結(jié)合血清白蛋白(SA)的dAb，具有通過表 面等離子體共振測定的 InM 至 1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400 或
500 μ M(即，XliT9 至 5X1CT4)的&,或 IOOnM 至 10 μ M,或 1 至 5 μ M,或 3 至 70ηΜ,或 IOnM 至1、2、3、4或5 μ Μ。例如，30至70ηΜ，如通過表面等離子體共振所測定的。在一個實施方 式中，第一 dAb (或dAb單體)結(jié)合SA (例如,IISA)，具有通過表面等離子體共振測定的大約 1、50、70、100、150,200,SOOnM或1、2或3 μ M的KD。在一個實施方式中，第一和第二 dAb通 過連接物連接，例如，1至4個氨基酸的連接物,或1至3個氨基酸,或多于3個氨基酸,或多 于4、5、6、7、8、9、10、15或20個氨基酸。在一個實施方式中，可以使用較長的連接物(多于 3個氨基酸)來提高功效(拮抗劑中一個或兩個dAb的Kd)。在配體和拮抗劑的特定實施方式中，dAb結(jié)合人血清白蛋白并與選自以下的dAb 競爭與白蛋白的結(jié)合MSA-16、MSA-26 (對于這些序列的公幵內(nèi)容，參見W004003019，在此將該序列及其 核酸對應(yīng)物通過援引并入并形成本發(fā)明文本公開內(nèi)容的部分)，D0M7m-16(SEQ ID NO :473) , D0M7m-12 (SEQ ID NO :474) , D0M7m-26 (SEQ ID NO 475), D0M7r-l(SEQ ID NO 476), D0M7r-3(SEQ ID NO :477), D0M7r_4(SEQ ID NO: 478) , D0M7r-5(SEQ ID NO :479)，D0M7r_7(SEQ ID NO :480)，D0M7r_8(SEQ ID NO: 481)，D0M7h-2(SEQ ID NO :482)，D0M7h-3(SEQ IDNO :483)，D0M7h-4(SEQ ID NO :484)， D0M7h-6(SEQ ID Μ) :485) , D0:M:7h-1 (SEQ ID NO :486)，D0M7h-7 (SEQ ID NO 487), D0M7h-22(SEQ ID NO :489), D0M7h_23(SEQ ID NO :490), D0M7h_24(SEQ ID NO 491), D0M7h-25(SEQ IDNO :492), D0M7h_26(SEQ ID NO :493)，D0M7h_21(SEQ ID NO 494), D0M7h-27(SEQ ID NO :495)，D0M7h-8(SEQ ID NO :496), D0M7r-13(SEQ ID NO :497),D0M7r-14(SEQ ID NO 498)，DOM7r_15(SEQ ID NO :499)，DOM7r_16(SEQ IDNO :500)，
D0M7r-17(SEQ ID NO :501)，D0M7r_18(SEQ ID NO :502)，D0M7r_19(SEQ ID NO 503), D0M7r—20(SEQ ID NO :504)，D0M7r—21(SEQ ID NO :505)，D0M7r—22(SEQ ID NO :506)， D0M7r 23 (SEQ ID NO :507), D()M7r-24 (SEQ IDNO :508), D()M7r-25 (SEQ ID KO 509), D0M7r-26(SEQ ID NO :510), D0M7r_27(SEQ ID NO :511), D0M7r_28(SEQ IDNO 512), D0M7r-29(SEQ IDNO :513)，D0M7r_30(SEQ ID NO :514)，D0M7r_31(SEQ ID NO :515), D0M7r-32(SEQ IDNO :516)，D0M7r-33(SEQ ID NO :517)(對于這些序列的公開內(nèi)容,參見TO2007080392,在此將其序列及其核酸對應(yīng)物 通過援引并入并形成本發(fā)明文本公開內(nèi)容的部分；該段落中的SEQ ID NO是W02007080392 公開的那些)，dAb8 (dAblO) , dAb 10，dAb36，dAb7r20 (D0M7r20)，dAb7r21 (D0M7r21)， dAb7r22 (D0M7r22), dAb7r23 (D0M7r23), dAb7r24(D0M7r24), dAb7r25 (D0M7r25), dAb7r26(D0M7r26)，dAb7r27(D0M7r27)，dAb7r28(D0M7r28)，dAb7r29 (D0M7r29)， dAb7r29(D0M7r29)， dAb7r31(D0M7r31)， dAb7r32(D0M7r32)， dAb7r33(D0M7r33)， dAb7r33(D0M7r33), dAb7h22 (D0M7h22)，dAb7h23(D0M7h23), dAb7h24(D0M7h24), dAb7h25(D0M7h25), dAb7h26(D0M7h26)， dAb7h27(D0M7h27)， dAb7h30(D0M7h30), dAb7h31(D0M7h31)，dAb2(dAbs 4,7,41)’ dAb4, dAb7, dAbll, dAb12(dAb7ml2)， dAb13(dAb15)， dAbl5, dAbl6(dAb21, dAb7ml6)， dAbl7, dAb18， dAb19， dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25(dAb26, dAb7m26), dAb27，dAb30 (dAb35), dAb31，dAb33, dAb34, dAb35, dAb38(dAb54), dAb41, dAb46(dAbs 47,52 和 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7ml2, dAb7ml6, dAb7m26, dAbTrl(DOM 7rl)， dAb7r3(D0M7r3)， dAb7r4(D0M7r4)，dAb7r5(D0M7r5)，dAb7r7(D0M7r7)，dAb7r8(D0M7r8)，dAb7rl3 (D0M7rl3)， dAb7rl4(D0M7rl4)，dAb7r15 (D0M7r15) , dAb7r16 (D0M7r16) , dAb7r17 (D0M7r17)， dAbTrl 8 (D0M7rl8) , dAb7r 19 (D0:M:7r 1 9)，dAb7h 1 (D0:M:7h 1) , dAb7h 2 (D0M7h2), dAb7h6(D0M7h6)’dAb7h7(D0M7h7),dAb7h8(D0M7h8), dAb7h9(D0M7h9)，dAb7hlO(DOM7hlO)， dAbThll (DOMThll)，dAb7hl2 (D0M7hl2)，dAb7hl3 (D0M7hl3)，dAb7hl4 (D0M7hl4)， dAb7pl (DOMTpl)，和 dAb7p2 (D0M7p2)(對于這些序列的公開內(nèi)容,參見PC']yGB2008/000453,2008年2月8日申請,在此 將其序列及其核酸對應(yīng)物通過援引并入并形成本發(fā)明文本的公開內(nèi)容的部分)。dAb后括 號中顯示了可替換的名稱，例如dAb8具有可替換的名稱dAb 10，即dAb8 (dAb 10)。還在圖 51 a和b中列出了這些序列。 在某些實施方式中，dAb結(jié)合人血清白蛋白，并包含與選自以下的dAb的氨基酸序 列具有至少約80%,或至少約85%,或至少約90%,或至少約95%,或至少約96%,或至少 約97%，或至 少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列MSA—16，MSA—26,D0M7ra-16(SEQ ID NO :473) , D0M7ra-12 (SEQ ID NO :474) , D0M7ra-26 (SEQ ID NO 475), D0M7r-l(SEQ ID NO 476), D0M7r-3(SEQ ID NO :477), D0M7r_4(SEQ ID NO: 478) , D0M7r-5(SEQ ID NO 479), D0M7r-7(SEQ ID NO 480), D0M7r-8(SEQ ID NO 481), D0M7h-2(SEQ ID NO :482)，D0M7h-3(SEQ IDNO :483)，D0M7h-4(SEQ ID NO :484),D0M7h-6(SEQ ID NO :485), D0M7h_l(SEQ ID NO :486), DOM7h_7(SEQ ID NO :487), DOM7h-22(SEQ ID NO 489), DOM7h-23(SEQ ID NO :490)，DOM7h_24(SEQ ID NO 491), DOM7h-25(SEQ IDNO :492)，D0M7h-26(SEQ ID NO 493)，D0M7h-21(SEQ ID NO :494)， D()M7h—27 (SEQ ID NO :495), D0M7h 8 (SEQ ID NO :496), D0:M:7r—13 (SEQ ID NO 497), D0M7r-14(SEQ ID NO 498)’ DOMTr-15(SEQ ID NO 499)，D0M7r_16(SEQ IDNO 500)， D0M7r-17(SEQ ID NO :501), D0M7r_18(SEQ ID NO :502)，D0M7r_19(SEQ ID NO :503)， D0M7r-20(SEQ ID NO :504)，D0M7r-21(SEQ ID NO :505), D0M7r-22(SEQ ID NO :506)， D0:M:7r-23(SEQ ID NO 507), D0M7r 24 (SEQ IDNO 508) , D0M7r 25 (SEQ ID NO :509), D0M7r-26(SEQ ID NO 510), D0M7r-27(SEQ ID NO 511), D0M7r-28(SEQ ID NO 512), D0M7r-29(SEQ ID NO 513), D0M7r-30(SEQ ID NO :514)，D0M7r_31(SEQ ID NO :515), D0M7r-32(SEQ IDNO :516)，D0M7r-33(SEQ ID NO :517)(該段落中的SEQ ID NO是W02007080392中公開的那些)， dAb8, dAblO, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4，dAb7, dAbll, dAb!2, dAbl3, dAbl5, dAb!6, dAbl7, dAbl.8, dAb!9, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7ml2, dAb7ml6, dAb7m26, dAb7rl, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5,dAb7r7,dAb7r8,dAb7rl3,dAb7rl4,dAb7r!5,dAb7rl6,dAb7r!7,dAb7r!8,dAb7rl9, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hl(), dAbThll, dAb7hl2, dAb7hl.3, dAb7hl4, dAb7pl,和 dAb7p2.例如，結(jié)合人血清白蛋白的dAb可以含有與以下序列具有至少約90 %，或至少約 95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性的氨 基酸序列D0M7h-2(SEQID NO :482) , D0M7h_3 (SEQ ID NO :483), D0M7h_4 (SEQ ID NO: 484)，D0M7h-6(SEQ ID NO :485)，D0M7h_l(SEQ ID NO :486)，D0M7h_7(SEQ ID NO :487), D0M7h-8(SEQ ID NO :496)，D0M7r-13(SEQ IDNO :497)，D0M7r-14(SEQ ID NO :498)， D0M7h-22(SEQ ID NO :489), D()M7h-23 (SEQ ID NO :490), D0M7h-24 (SEQ ID NO 491), D0M7h-25(SEQ ID NO :492), D0M7h_26(SEQ ID NO :493), D0M7h_21(SEQ ID NO 494), D0M7h-27(SEQ IDNO 495)(該段落中的SEQ ID NO是W02007080392中公開的那些)，dAb8, dAb10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAbll, dAbl2, dAbl3, dAbl5, dAb 16’ dAbl7, dAb18， dAb19， dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33,
dAb34，dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb’52, dAb’53, dAb’54, dAb55, dAb56, dAb7hl， dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hl(), dAb7hll, dAb7h!2, dAb7h!3 和 dAb7h!4.在某些實施方式中，dAb結(jié)合人血清白蛋白并含有與選自以下的dAb的氨基酸序 列具有至少約80 %，或至少約85 %，或至少約90 %，或至少約95 %，或至少約96 %，或至少 約97%’或至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列
D0M7h-2 (SEQ ID NO :482), D0M7h_6 (SEQ ID NO :485), D0M7h_l (SEQID NO: 486)，D0M7h-7(SEQ ID NO 487), D0M7h_8(SEQ ID NO 496), D0M7h_22(SEQ ID NO :489), D0M7h-23(SEQ ID NO :490)，D0M7h-24(SEQ ID NO :491)，D0M7h-25(SEQ ID NO :492)， D0M7h-26 (SEQ ID NO :493), D()M7h-21 (SEQ IDNO :494), D0M7h-27 (SEQ ID NO :495)
(該段落中的SEQ ID NO是W02007080392中公開的那些),dAb7h21,dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2,dAb4,dAb7,dAb38，dAb41，dAb7hl，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h!0, dAbThll, dAb7hl2, dAb7h!3 和 dAb7h!4.在更特別的實施方式中，dAb是結(jié)合人血清白蛋白的VKdAb,并具有選自以下的
氨基酸序列D0M7h-2(SEQ ID NO :482)，D0M7h-6 (SEQ ID NO :485)，D0M7h-l (SEQID NO: 486), D0M7h-7 (SEQ ID NO :487), D()M7h-8 (SEQ ID NO :496)(該段落中的 SEQ ID NO 是 W02007080392中公開的那些),dAb2, dAb4,dAb7,dAb38,dAb41,dAb54,dAbThl,dAb7h2,dAb7h6,dAb7h7,dAb7h8,
dAb7h9, dAb7h!0, dAb7hll, dAb7h!2, dAb7hl3 和 dAb7hl4.，在更特別的實施方式中，dAb是結(jié)合人血清白蛋白的Vh dAb,并具有選自dAb7h30 和dAb7h31的氨基酸序列。在更特別的實施方式中，dAb是dAbThl 1或dAb7hl4。在其他實施方式中，dAb、配體或拮抗劑結(jié)合人血清白蛋白，并含有之前任一氨基 酸序列的一個、兩個或三個CDR，例如，dAbThl 1或dAb7hl4的一個、兩個或三個CDR。合適的結(jié)合Jill 清白蛋白的 Camelid Vffli 包括 W02004/041862 (AbIvnxN. V.)和 W02007080392中公幵的那些(在此將其Vffil序列及其核酸對應(yīng)物通過援引并入，并形成本發(fā) 明文本公開內(nèi)容的一部分)，如序列A(SEQID N0:518)J^^ljB(SEQ ID NO 519)、序列C (SEQ ID NO 520)、序列 I) (SEQ ID NO :521)、序列 E (SEQ ID NO :522)、序列 F(SEQ IDNO :523)、序 列 G (SEQ ID NO :524)、序列 H(SEQ ID NO :525)、序列 I (SEQ ID NO :526)、序列 J (SEQ ID NO 527)、序列 K(SEQ ID NO 528)、序列 L(SEQ ID NO 529)、序列 M(SEQ ID NO 530)、序列 N(SEQ IDNO 531)、序列 0(SEQ ID NO 532)、序列 P (SEQ ID NO 533)、序列 Q(SEQ ID NO 534),這些序列編號對應(yīng)于W()2007080392或TO2004/041862(Ablynx N. V.)中引用的那些。 在某些實施方式中，Camelid Vffil結(jié)合人血清白蛋白并含有與W02007080392中公開的ALBl 或SEQ ID NO :518-534中任一個具有至少約80%，或至少約85%，或至少約90%，或至少 約95 %，或至少約96 %，或至少約97 %，或至少約98 %，或至少約99 %氨基酸序列同一性的 氨基酸序列，這些序列編號對應(yīng)于W02007080392或W02004/041862中引用的那些。在--些實施方式中，配體或拮抗劑含有與在此公開的任一抗-血清白蛋白dAb競 爭與血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)結(jié)合的抗-血清白蛋白dAb。在可替換的實施方式中，拮抗劑或配體含有目標(biāo)抗原(例如，人TNFR1)特異性的 結(jié)合部分，其中該部分含有非免疫球蛋白序列，如2008年2月8日申請的共同未決申請 PCT/GB2008/000453中所述的,這些結(jié)合部分、它們的生產(chǎn)和選擇方法(例如,來自不同的 文庫)及其序列的公幵內(nèi)容在此通過援引并入，作為本發(fā)明文本的公幵內(nèi)容的部分。與半衰其月延長部分(例如’白g白)的 合
在一個實施方式中，將(一個或更多個)半衰期延長部分(half-lifeextending moiety)(例如，白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及其片段和類似物)綴合或締合本發(fā)明的目標(biāo)抗原-結(jié)合 多肽、dAb或拮抗劑。對用于目標(biāo)抗原-結(jié)合形式中的合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變 體的實例描述于TO2005077042中，在此將其公開內(nèi)容通過援引并入，并形成本發(fā)明文本的 公開內(nèi)容的部分。特別地，以下的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體可以用于本發(fā)明中.SEQ ID NO :1 (如W02005077042中公開的，在此明確地將該序列通過援引引入本 發(fā)明公開內(nèi)容中)；·含有 W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 1-387 或由 W02005077042 中的 SEQ ID NO 1的氨基酸1-387組成的白蛋白片段或變體；·白蛋白、或其片段或變體，含有選自以下的氨基酸序列(a)W02005077042中 的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 54 至 61 ； (b) W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 76 至 89 ； (c)W02005077042 中的 SEQ IDNO 1 的氨基酸 92 至 100 ； (d) W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 170 至 176 ； (e) W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 247 至 252 ； (f)W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 266 至 277 ； (g) W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 280 至 288 ； (h) W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 362 至 368 ； (!) W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 439 至 447 ； (j) W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 462 至 475 ； (k)W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 478 至 486 ；和(1) W02005077042 中的 SEQ ID NO 1 的氨基酸 560 至 566。對用于目標(biāo)抗原結(jié)合形式中的合適白蛋白、片段或類似物的更多實例描述于 W003076567中，在此將其公開內(nèi)容通過援引并入,并形成本發(fā)明文本的公開內(nèi)容的一部分。 特別地，以下的白蛋白、片段或變體可以用于本發(fā)明中 如W003076567中所述的人血清白蛋白，例如，圖3中(在此明確地將該序列信息 通過援引引入本發(fā)明公開內(nèi)容中)；·由具有66，500通式分子量的585個氨基酸的單非糖基化多肽鏈組成的人血清 白蛋白(HA)(參見，Meloun 等，F(xiàn)EBS Letters 58 =136(1975) ；Behrens 等，F(xiàn)ed. Proc. 34 591 (1975) ；Lawn 等，Nucleic Acids Research9 6102-6114 (1981) ；Minghetti 等，J. Biol. Chem. 261 6747(1986))；·白蛋白的多態(tài)變體或類似物或片段,如Wei tkamp等，Ann. Hum. Genet. 37 219(1973)中所述的·如EP322094中所述的白蛋白片段或變體，例如，HA (1-373)、HA (1-388)、 HA (1-389)、HA (1-369)和 HA (1-419)以及 1-369 和 1-419 之間的片段；·如ΕΡ399666中所述的白蛋白片段或變體,例如，ΗΑ(1-177)和HA(卜200)以及 HA(I-X)之間的片段,其中X是178至199的任何數(shù)字。在將(一個或更多個)半衰期延長部分(例如，白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及其片段和類似 物)用于格式化本發(fā)明的目標(biāo)抗原-結(jié)合多肽、dAb和拮抗劑的情況中，可以使用任何合適 的方法來綴合,如通過直接融合目標(biāo)抗原-結(jié)合部分(例如,抗-TNFRl dAb),例如，通過使 用編碼融合蛋白的單個核苷酸構(gòu)建體,其中將融合蛋白編碼為單多肽鏈,在位于目標(biāo)抗原 結(jié)合部分的N-或C-端具有半衰期延長部分?；蛘撸梢酝ㄟ^在部分之間使用肽連接物來 完成綴合，例如,W003076567或W02004003019中所述的肽連接物(在此將這些連接物的公開內(nèi)容通過援引并入，以提供用于本發(fā)明中的實例)。通常,提高體內(nèi)血清半衰期的多肽是 在體內(nèi)天然存在的多肽，并且能抵抗從生物體內(nèi)(例如，人)除去不利物質(zhì)的內(nèi)源機制的降 解或去除。例如,提高體內(nèi)血清半衰期的多肽可以選自胞外基質(zhì)的蛋白，血液中發(fā)現(xiàn)的蛋 白，血腦屏障或神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白，位于腎臟、肝臟、肺、心臟、皮膚或骨中的蛋白，應(yīng)激 蛋白，疾病特異性蛋白或涉及Fc轉(zhuǎn)運的蛋白。在整個公幵內(nèi)容中所述的本發(fā)明的實施方式中，替代本發(fā)明的拮抗劑或配體中的 抗-目標(biāo)抗原“ dAb ”的使用，考慮了本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用含有本發(fā)明的結(jié)合目標(biāo)抗原 的dAb的一個或更多個或全部3個CDR的多肽或結(jié)構(gòu)域(例如，移植在合適蛋白支架或骨 架上的CDR,支架或骨架例如為，affibody, SpA支架、LDL受體A類結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域)。 因此，認(rèn)為該公開內(nèi)容作為整體提供了使用這樣的結(jié)構(gòu)域替代dAb的拮抗劑的公幵內(nèi)容。 在這點上，參見2008年2月8日申請的PCT/GB2008/000453，在此將其公開內(nèi)容通過援引并 入)。因此,在一個實施方式中，本發(fā)明的拮抗劑包含具有目標(biāo)抗原結(jié)合特異性的免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)或該dAb合適形式的互補性決定區(qū)。拮抗劑可以 是由該dAb組成的多肽，或基本上是由該dAb組成的多肽。拮抗劑可以是包含合適形式的 dAb (或dAb的CDR)的多肽，如抗體形式(例如，IgG-樣形式，scFv、Fab, Fab'、F (ab' ) 2)， 或含有結(jié)合目標(biāo)抗原的dAb和結(jié)合另一個目標(biāo)蛋白、抗原或表位(例如,血清白蛋白)的第 二 dAb的雙特異性配體。
可以將根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb和拮抗劑格式化成本領(lǐng)域已知的各種合適的抗體 形式,如IgG 樣形式、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、 抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同型二聚體和雜二聚體、之前任一項的抗原結(jié)合片段(例 如，F(xiàn)v片段(例如，單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab，)2片 段)、單可變結(jié)構(gòu)域(例如，VH、VJ、dAb和之前任一項的修飾形式(通過共價連接聚亞烷基 二醇(例如,聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合適聚合物的修飾)。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了為IgG-樣形式的配體(例如，抗-TNFRl拮抗 劑)。這樣的形式具有IgG分子常規(guī)的四條鏈結(jié)構(gòu)(2條重鏈和兩條輕鏈)，其中一個或更 多個可變區(qū)(Vh和或已經(jīng)由本發(fā)明的dAb替代。在一個實施方式中，每個可變區(qū)(2個 Vh區(qū)和2個\區(qū))由dAb或單可變結(jié)構(gòu)域替代,其中至少一個是根據(jù)本發(fā)明的抗-目標(biāo)抗 原dAb。IgG-樣形式中包括的dAb或單可變結(jié)構(gòu)域可以具有相同的特異性或不同的特異 性。在一些實施方式中，IgG-樣形式是三價的，并可以具有一種(只抗-目標(biāo)抗原)、兩種 (例如,抗-目標(biāo)抗原和抗 SA)、三種或四種特異性。例如，IgG樣形式可以是單特異性的， 并含有具有相同特異性的4個dAb ；是雙特異性的并含有3個具有相同特異性的dAb和另 一個具有不同特異性的dAb ；是雙特異性的并含有兩個具有相同特異性的dAb和兩個具有 共同的但不相同特異性的dAb ；三特異性的并含有具有相同特異性的第一和第二 dAb，具有 不同特異性的第三dAb和具有不同于第一、第二和第三dAb的特異性的第四dAb ；或四特異 性的，并含有四個具有各不相同特異性的dAb。可以制備IgG樣形式的抗原結(jié)合片段(例 如，F(xiàn)ab、F(ab’ ) 2、Fab’、Fv、scFv)。在一個實施方式中，IgG樣形式或其抗原結(jié)合片段不與 目標(biāo)抗原交聯(lián)，例如，該形式對于目標(biāo)抗原可以是單價的。如果需要補體激活和/或抗體依 賴性細胞毒性(ADCC)功能，配體可以是IgGl 樣形式。如果需要，IgG-樣形式可以包含突變的恒定區(qū)(變體IgG重鏈恒定區(qū)),以最小化與Fc受體的結(jié)合和/或固定補體的能力。 (參見，例如，Winter 等，GB2, 209, 757B ；Morri son 等，W089/07142 ；Morgan 等，W094/29351， 1994 年 12 月 22 曰)。本發(fā)明的配體(多肽、dAb和拮抗劑)可以格式化成融合蛋白，其含有與第二免疫 球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域直接融合的第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。如果需要,該形式可以進 一步包含半衰期延長部分。例如，配體可以包含與第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域直接融合 的第一免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域,而第二免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與結(jié)合血清白蛋白的免 疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域直接融合。通常,具有對目標(biāo)有結(jié)合特異性的結(jié)合位點的多肽結(jié)構(gòu)域的方向，以及配體是否 包含連接物，是設(shè)計選擇的問題。然而，一些方向，使用或不使用連接物，可以提供比其他 方向更好的結(jié)合特征。本發(fā)明包括的所有方向(例如，dAbl 連接物-dAb2 ;dAb2 連接 物-dAbl)。含有提供期望的結(jié)合特征的方向的配體可以通過篩選容易地鑒定。根據(jù)本發(fā)明的多肽和dAb,包括dAb單體、二聚體和三聚體,可以連接抗體Fc區(qū)， 包含CH2 和Ch3結(jié)構(gòu)域中的一個或兩個，和任選鉸鏈區(qū)。例如，作為單個核苷酸序列連接Fc 區(qū)的編碼配體載體可以用來制備這樣的多肽。此外，本發(fā)明提供了上述dAb單體的二聚體、三聚體和多聚體。密碼子優(yōu)化序列如上所述，本發(fā)明的實施方式提供了編碼本發(fā)明的多肽和可變結(jié)構(gòu)域的密碼子優(yōu) 化核苷酸序列。如以下說明中所示的,可以產(chǎn)生編碼相同可變結(jié)構(gòu)域的約70%同一性的密 碼子優(yōu)化序列(在該情況中，可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與DOM lh-1.31-206相同)。在這種情 況下,對于通過巴斯德畢赤酵母(密碼子優(yōu)化序列1-3)或大腸桿菌(密碼子優(yōu)化序列4和 5)的表達，將序列優(yōu)化。我們在考慮了遺傳密碼的簡并性之后進行了計算，并將通過附圖19所示的DOM lh-131-206的核苷酸序列和理論核苷酸序列編碼的每個簡并密碼子內(nèi)的核苷酸變化數(shù)量 最大化,理論核苷酸序列仍然編碼與DOM lh-131-206相同的可變結(jié)構(gòu)域。計算揭示了理論 序列與附圖19中所示的DOM lh-131-206的核苷酸序列只具有57%的同一性。密碼子優(yōu)化序列1DKA 序列g(shù)aggttcaattgttggaatccggtggtggattggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgctgcttccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatgggtttcccacattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatctccagagacaactccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgtttaccactgtgctttgttgccaaagagaggaccttggtttgattactggggacagggaactttggttactgtttcttcc相應(yīng)的AA序列evq1Iesggg1vqpggs1r1scaasgft fah e tmvwvrqap gk g1ewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntIylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss·與WT序列74. 1 %的核苷酸序列同一性150
Domlh-131 —206 密碼子優(yōu)^(匕的 (1)Τ·:.》ΑΤ·,\υ ·<; Λ、Α· 00広i :Τ·.\;Τ、々Α:Χ義7 Τ0ΛΑ· 々'「·5 Τ《<:Τ·ι:‘'·
Domlh-131 -206 WT (1) -^' Gi^GC; v^i^^G';vC^J ^Α^.Αβ
一致序列 (1) GAGGT CA TGTTGGA TC GG GG GG TTGGT CA CCTGG GG TC 51100
Domlh-131-206 密碼子優(yōu)化的 {51) TnKvATXGW、 KJ χ;Τ、Π 3Τ.Π T V:T.C CiK-1TUACd Domlh-131-206 WT {51) CC:i'3C〈VrCXC).rC’、:J、·r:CC、〕V' 3A「 CA^C.-TTGCG^VTCaC爻(.Giv 敵序列 (51) TG G T TCCTGTGC GC TCCGG TT AC TT GC CA GAGAC A ,101150
Domlh—131 — 206 密碼子優(yōu)化的 (101)AT !'G^AArsi-ij^TTTCC-AC
Domlh-131-206 WT (3.01)
一致序列u〇l)TGGT TGGGT G CAGGC CCAGG AA GG T GA TGGGT TC CA
151200
Domlh-131-206 密碼子優(yōu)化的(151}爻TGSrCAAi^ZiCCiV^TCr^OSCTi^GT1') ？‘· Τ ^;··: ‘3ΑΑ二
Domlh-131-206 WT(151)C-TCC^G 汽 、？；·ΓΑσ · ?！?ΧΧΤΓΓ -· 7^>^ Α<ν GTCsXTiG久及GGdCCG
一致序列(151)ATTCC CC GATGGTCA GATCC TTCTACGC GACTCCGT AAGGG G
201250
Domlh-131-206 密碼子優(yōu)化的(201)A^I’^ ？S,C AG^'i' ^
Domlh-131-206 WT{201)G%"'3 v, .V:c >"ic C^lC^C^AC^TTO^/vA-.^^'.^ftCGCTA-T^TCn
一&L· 床糾(201)TTCAC ATC丁CC G GACAA TCCAAGAACAC T TA TGCA ATGA
雙“幻251300
Domlh-131-206 密碼子優(yōu)化的(251)；v^TCC-'TT T CO Λ^ ^TCCTT O TfGCOA
Domlh-131-206 WT(2511AOAGC.CrCCCTi^.CGAi'SACAGAG-rGC^A^^T.rdC^krCC^GC.r&C^TCJT
一敎床石fl(251)AC C TG G GC GAGGA AC GC GT TA CACTGTGC TG T CC
^rr7i301350
Domlh—131—206 密碼子優(yōu)化的(301)· . )·.ΤΓΓ7δ.\:Γ’7·‘ΓΓ<3^.^ '·Α’:Χ4·· 3 ,λ ^.Τ:ΡΓ<^ .3·Τ ν.,::Τ、^
Domlh-131-206 WT(301)^ ν^Χ η —N^T ^ ^ \Γ- ,C^
一致序列(301)AAGAG GG CCTTGGTTTGA TACTGGGG CAGGGAAC TGGT AC GT
3 υ 丄.·5 6 3
Domlh-131-206 密碼子優(yōu)化的 (351) SA
Domlh-131-206 WT (351) C--
一致序列(351)L:密碼子優(yōu)化序列2DNA 序列g(shù)agaaaagagaggttcaattgcttgaatctggaggaggtttggtccagccaggagggtcccttcgactaagttgtgctgccagtgggtttacgtttgctcatgaaactatggtatgggtccgacaggcacctggtaaaggtcttgaatgggtttcacatatccctccagacggtcaagacccattttacgctgattccgtgaaaggcagatttacaatttcacgagataattctaaaaacaccttgtacttacaaatgaactcattgagagctgaggacactgcagtttatcactgcgctttactaccaaaacgtggaccttggtttgattattggggccaaggtacgttagtgactgttagttct相應(yīng)的AA序列ekrevqlIesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntIylqmnslraedtavyhcalIpkrgpwfdywgqgtlvtvss·與WT序列71. 1%的核苷酸序列同一性
Dorrilh-131-2 06 WT (342) G、5 C ^ Cv Cvj C-, AGiS-僅畢赤酵母 MFa 206 dAb (351)廣‘義’^丁嚴(yán).——.A、TT :.T 一致序歹(351) GT AC GT T G C密碼子優(yōu)化序列3DNA 序列g(shù)aagtgcagcttcttgaaagtggtggagggctagtgcagccagggggatctttaagattatcatgcgctgccagtggatttacttttgctcacgagacgatggtctgggtgagacaagctcctggaaaaggtttagagtgggtttctcacattccacctgatggtcaagatcctttctacgcagattccgtcaaaggaagatttactatctccagagataatagtaaaaacactttgtacctacagatgaactcacttagagccgaagataccgctgtgtaccactgcgccttgttgccaaagagaggtcc ttggttcgattactggggtcagggtactctggttacagtctcatct相應(yīng)的AA序列evqlIesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntIyIqmnsIraedtavyhcalIpkrgpwfdywgqgtIvtvss·與WT序列72. 6%的核苷酸序列同一性 密碼子優(yōu)化序列4DNA 序列g(shù)aagtacaactgctggagagcggtggcggcctggttcaaccgggtggttccctgcgcctgtcctgtgcggcatctggtttcaccttcgcacacgaaaccatggtgtgggttcgccaagctccgggcaaaggcctggaatgggtaagccacattcctccagatggccaggacccattctatgcggattccgttaagggtcgctttaccatttctcgtgataactccaaaaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgcgccgaggatactgcggtgtaccattgtgcgctgctgcctaaacgtggcccgtggttcgattactggggtcagggtactctggtcaccgtaagcagc相應(yīng)的AA序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss·與WT序列76. 5%的核苷酸序列同一性 密碼子優(yōu)化序列5DNA 序列g(shù)aggttcaactgctggaatctggtggtggtctggtacaaccgggtggttccctgcgtctgagctgtgcagcctctggtttcaccttcgctcatgagaccatggtttgggtacgccaggctccgggtaaaggcctggagtgggtaagccatatccctcctgatggtcaggacccgttctatgetgattccgtcaaaggccgttttaccatttctcgtggcaaaaacactctgtacctgcaaatgaactccctgcgtgcagaagacacggcggtttatcactgtgcactgctgccaaaacgcggcccttggttcgactactggggccagggtactctggtcactgtatcttct相應(yīng)的AA序列evqllesggglvqpggsIrIscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntIylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss·與ffT序列78. 4%的核苷酸序列同一性 實施例A 人TNFRl的結(jié)構(gòu)域抗體的前導(dǎo)選擇(lead selection) &表征結(jié)構(gòu)域抗體從噬菌體文庫產(chǎn)生。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法進行被動吸收人TNFRl的可溶 性選擇和淘選。從 R&D systems (Cat No 636-R1-025/CF)或 Peprotech (Cat no. 310-07) 購買人TNFRl作為可溶性重組蛋白，直接使用(在被動選擇的情況中)，或在使用通過伯胺 偶聯(lián)生物素化接著在生物測試中質(zhì)量控制其活性以及通過質(zhì)譜分析其MW和生物素化程度 后使用。通常，利用每F—輪中降低水平的抗原來進行3輪選擇。對于抗-TNFRl結(jié)合克隆的存在，通過噬菌體ELISA來篩選來自選擇的輸出。從這 些噬菌體選擇中分離DNA并亞克隆至用于可溶性dAb片段表達的表達載體中。在96-孔 平板中表達可溶性dAb片段，并將上清液用于篩選抗-TNFRl結(jié)合dAb的存在，使用直接結(jié) 合ELISA，其使用抗-c-myc檢測，或使用鏈霉抗生物素/生物素化TNFRl BIAcore 芯片的 BIAcore ，并根據(jù)解離速率(off-rate)來分級。以下所述的前導(dǎo)分子(lead molecule)源自親本dAb，命名為DOMlh-131 (公開于 W02006038027中)。使用60nM生物素化抗原的3輪選擇后，從噬菌體展示文庫中選擇了該 分子。將鏈霉抗生物素或neutravidin覆蓋的Dyna珠子替換為每輪選擇中的捕獲試劑，以 防止對抗鏈霉抗生物素或neutravidin的粘合劑的選擇。該階段的前導(dǎo)DOM lh 131功效是 低微摩爾范圍的，如通過MR05成纖維細胞/IL-8釋放細胞測試所測定的。通過BIAcore 測定的結(jié)合動力學(xué)通常呈現(xiàn)出快結(jié)合/快解離速率(fast-on/fast-off rate)。該DOM lh-131前導(dǎo)分子的大腸桿菌表達水平，作為C-端myc標(biāo)記的單體，在8mg/l的范圍中。前導(dǎo)的親和性成熟促使DOM lh-131親和性成熟，以產(chǎn)生具有較高功效和改進的生物物理特征的 突變體(對于DOM lh-131產(chǎn)生的前導(dǎo)的氨基酸序列，參考圖3)。使用易錯PCR聚合酶(Genemorph II, Stratagene)產(chǎn)生易錯文庫后(1個氨基酸變化/dAb序列的平均數(shù),文庫 大小8X IO7)，利用這些易錯文庫進行了七輪選擇。該策略導(dǎo)致克隆DOM lh-131-8的分離， 這是其中有4個氨基酸變化的分子(一個在框架1中(FRl)、一個在CDRl中、一個在CDR3 中和一個在FR4中)，獲得了大約100倍的功效提高,如通過MRC-5細胞測試所測量的( 4nM)。在該測試中，用測試樣品將MRC-5細胞孵育一小時,然后加入TNF-α (200pg/ml)。在 過夜孵育后，使用IL-8ABI 8200細胞檢測測試(FMAT)測定IL-8釋放。在每個實驗中包括 TNF-α劑量曲線。用于與dAb競爭與TNFRl結(jié)合的TNF-α濃度(200pg/ml)大約為該測試 中最大TNF-α應(yīng)答的70%。為了進一步提高功效,通過在易錯前導(dǎo)共有序列信息暗示的關(guān)鍵位置的寡-定向 突變使單個氨基酸位置多樣化。在該方法的過程中，通過BIAcore 篩選分離DOM lh-131-8 克隆的改進形式，DOM lh-131-24 (在校正之前最初命名為DOM lh-131-8-2)，其具有單個 K94R氨基酸突變(根據(jù)Kabat氨基酸編號)和20(K300pM的RBA功效。
產(chǎn)生進一步的基于該前導(dǎo)的易錯文庫和源自其的NNS文庫,并接受三輪使用 熱處理的噬菌體選擇(對于方法，參見Jespers L等，Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heatdenaturation (通過熱變性在唾菌體上選擇的抗 聚集結(jié)構(gòu)域抗體)，NatBiotechnoL 2004年9月；22(9) :1161-5)。在該選擇過程中，將文 庫集合,并且源自第二輪選擇的克隆產(chǎn)生了 dAb,如DOM lh-131-53,認(rèn)為其熱穩(wěn)定性更高。 推測這些克隆具有更好的生物物理特征。將克隆D0Mlh-131-53中的一些框架突變種系化， 以產(chǎn)生克隆DOM lh 131-83。該克隆形成了進一步通過寡-定向單個⑶R突變來多樣化的 基礎(chǔ),可以使用如上所述的噬菌體展示選擇或使用體外區(qū)室化技術(shù),該技術(shù)使用乳液。噬菌 體展示策略產(chǎn)生了前導(dǎo)DOM lh-131-117和DOM lh_131_151。體外區(qū)室化技術(shù)產(chǎn)生了 DOM lh-131-151。在該階段，在生物物理和生物測試中比較了這三個前導(dǎo)，DOMlh-131-511是具有最 佳特征的分子。此外,測試了這些分子在胰蛋白酶或leucozyme的存在下對蛋白水解裂解 的抵抗性。Leucozyme由來自囊性纖維化患者的集合痰液組成,并含有高水平的彈性蛋白酶 和其他蛋白酶，并用作肺病體內(nèi)狀況的替代品。該數(shù)據(jù)表明全部三種前導(dǎo)D0Mlh-131-117、 DOM lh-131-151和DOM lh-131-511在胰蛋白酶或leucozyme的存在下快速降解。這種 發(fā)現(xiàn)引起了對DOM lh 131 511在患者中時的體內(nèi)持久性的關(guān)注，并且研發(fā)了一種策略來 選擇對胰蛋白酶提高的抵抗性。推測這種提高的胰蛋白酶抗性對分子的其他生物物理特 征具有有益作用。基本上，改進了標(biāo)準(zhǔn)噬菌體選擇方法，以允許在對抗原選擇之前在蛋白 酶的存在下進行選擇。因此，工程化了一種新的噬菌體載體，其中檢測c-myc標(biāo)記物，以允 許在胰蛋白酶存在下的選擇而沒有裂解噬菌體的展示的dAb。產(chǎn)生了基于易錯文庫的DOM lh-131-511,并在pD0M33載體中克隆(對于pD0M33載體圖譜,參見圖50)。用lmg/ml或 100 μ g/ml胰蛋白酶在37tTF將從該文庫產(chǎn)生的噬菌體備料預(yù)處理24小時，隨后將Roche Complete Protease Inhibitors (2x)的蛋白酶抑制劑加入，以在對相關(guān)抗原選擇之前阻斷 胰蛋白酶活性。進行了四輪選擇。在胰蛋白酶(l()0yg/ml或100(48/!111終胰蛋白酶濃 度)的存在或不存在下在37°C下孵育一小時或過夜的過程中，使用BIAcore 測定可溶性 表達的TNFRl結(jié)合dAb在蛋白酶存在或不存在下結(jié)合TNFRl的能力。這導(dǎo)致兩種前導(dǎo)分子DOM lh-131-202和DOM lh-131-206的分離，其顯示了提高的蛋白酶抗性，如通過BIAcore 抗原結(jié)合實驗所顯示的。感興趣的是注意到與DOM lh-131-511相比，DOM lh-131-202只在CDR2中含有一個突變(V53D)，所有氨基酸編號根 據(jù)Kabat，而DOMlh-131-206只含有兩個突變第一突變與DOM lh 131 202中的相同(CDR2 中的V53D突變)，第二突變是FR3中的Y91H突變(參見，圖3)。該FR3中的Y91H突變在 3-20種人種系基因中發(fā)生,表明該殘基在人抗體中產(chǎn)生。三個克隆DOM lh-131-511、DOM lh-131-202和DOM lh-131-206具有如圖3中所示的氨基酸序列。如下測定分子的活性DOM 1H-13卜202、DOM 1-13卜511禾卩1)(邏 1H-131-206 與人 TNFRl 結(jié)合的 BIAcore 結(jié)合親和性測定。通過BIAcore 分析測定 DOM 1H-131_202、D0M 1H-131-511 和 DOM 1H-131-206 對 結(jié)合人重組大腸桿菌表達的人TNFRl的結(jié)合親和性。使用生物素化的人TNFRl進行分析。 將1400RU生物素化的TNFRl覆蓋在鏈霉抗生物素(SA)芯片上。使用弱酸洗脫條件將表面 再生回基線。使用50 μ 1/min的流速,將限定濃度的DOM 1H-131-202、D0M1H-131-511和 DOM 1H-131-206通過該表面。在BIAcore 3000機器上進行工作，并分析數(shù)據(jù)和使其擬合 于1 1的結(jié)合模型。對于所有測試的分子，結(jié)合數(shù)據(jù)很好擬合于1 1模型。從k。n* k。ff速率計算所有Kd值。在25°C下進行BIAcore 運行。從三個單獨的實驗產(chǎn)生以下的數(shù)據(jù)。在每個實驗中，通過平均擬合的數(shù)量來計 算結(jié)果，對于kd，使用最高的dAb濃度，對于ka，使用較低的濃度。數(shù)據(jù)作為結(jié)果的平均 值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(括號中)來呈現(xiàn)(表1)。表1 =DOM 111-131-202、DOM 111-131-511和DOM 1H-131-206 結(jié)合人 TNFRl 的 BIAcore 數(shù)據(jù) DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511 和 DOM 1H-131-206 相似地，并以高親和性結(jié) 合人 TNFRl。DOM 1H-131-202 和 DOM 1H-131-206 各自以 0. 55nM 和 0. 47nM 的平均親和性 結(jié)合。與DOM 1.H-131-51.1相比(其具有1. 07nM的平均親和性)，DOM 1H-131-202和DOM 1H-13-206兩者具有略高的親和性。受體結(jié)合測試在受體結(jié)合測試中測定dAb對抗人TNFRl的效力。該測試測量了 TNF- α與TNFRl 的結(jié)合和可溶性dAb阻斷這種相互作用的能力。在預(yù)先覆蓋山羊抗人I:gG(H&L)的珠子上 捕獲TNFRl-FC融合體。在黑邊透明底384孔平板中用TNF- α (lOmg/ml)、dAb、生物素綴合的抗-TNF-α和鏈霉抗生物素alexa fluor 647孵育受體覆蓋的珠子。6小時后,在ABI 8200Cellular Detection系統(tǒng)上閱讀平板，并測定珠子相關(guān)的熒光。如果dAb阻斷TNF-α 結(jié)合TNFRl，熒光強度將降低。使用ABI: 8200分析軟件分析數(shù)據(jù)。使用feaphPad Prism和具有可變斜率的S形 劑量應(yīng)答曲線測定濃度效應(yīng)曲線和功效(EC5ci)值。對三種分開的情況重復(fù)測試。在每次 實驗中包括TNF-α劑量曲線(圖38和39)。用于與dAb競爭結(jié)合TNFRl的TNF-α濃度 (lOng/ml)大約為該測試中最大TNF-α應(yīng)答的90%。代表性的圖顯示于圖39中，顯示了 dAb抑制TNF-α結(jié)合TNFRl的能力。在所有 三個實驗中，陰性對照樣品(HEL4,抗-雞蛋白色lysozyme (^}3和％模型(dummy))在高濃 度下微弱地抑制TNF-α和TNFRl之間的相互作用。對于測試樣品和陽性對照(獲自R&D Systems 的抗-TNFRlmAb，mAb 225)和 Enbrel (etanerc印t ；由連接 IgGl 的 Fc 部分的 TNFR2組成的二聚融合體；得到許可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的平均功效(EC5ci)值顯示 于表2中。表2 在三次重復(fù)實驗的TNFRl受體結(jié)合測試中對DOM 1H-131-202、DOM III-131-206 和 DOM III-131-511 的功效(EC5q)值。 在該測試中，DOM 1Η-131-206顯示出比其他兩個測試的dAb功效高，并具有與可 購得的抗-TNFRlmAb, MAB225 (R&D Systems)相似的功效。如下進行從巴斯德畢赤酵母的前導(dǎo)克隆的表達將三個前導(dǎo)分子的一級氨基酸序列用來產(chǎn)生用于在巴斯德畢赤酵母中分泌表達 的密碼子優(yōu)化基因。在密碼子優(yōu)化和非密碼子優(yōu)化的D0M1H-131-206之間存在75 %的序列 同一性。將三個合成基因克隆至表達載體pPIC-Za中(來自Irwitrogen)，然后轉(zhuǎn)化至兩 個畢赤酵母菌株中，X33和KM71H。將轉(zhuǎn)化的細胞涂布于遞增濃度的Zeocin (100、300、600 和90(Wml)上,來選擇具有多個成分的克隆。對于每個細胞系和構(gòu)建體,選擇大約15個 克隆，用于表達篩選。因為高/低基因拷貝數(shù)和表達水平之間的相關(guān)性在巴斯德畢赤酵母 中沒有被完全理解，從Zeocin濃度范圍中選擇了幾個克隆。使用沒有對高生產(chǎn)率大范圍篩 選的克隆來進行5L發(fā)酵罐運行。這使得生產(chǎn)了大量的材料用于進一步研究。用于蛋白質(zhì)表征的材料生產(chǎn)
基于蛋白A的色譜樹脂已經(jīng)廣泛用于從微生物培養(yǎng)上清液中純化VHdAb。盡管這 使得可以用單步驟純化方法用于生產(chǎn)高純度材料，但通常在>90%的大部分情況中，對于 一些分子，低pli洗脫條件會導(dǎo)致聚集物的形成。還存在親和性樹脂對dAb能力有限的問題； 這意味著對于來自發(fā)酵罐的過程需要使用大量樹脂。為了產(chǎn)生高質(zhì)量的材料用于表征以及 進一步的穩(wěn)定性和噴霧器研究，使用混合模式電荷誘導(dǎo)樹脂作為最初的捕獲步驟接著陰離 子交換來設(shè)計F游純化方法。沒有明顯的優(yōu)化，這使得回收了 70%的純度為 95%的表 達的dAb。對于混合模式電荷誘導(dǎo)樹脂上(來自GE Healthcare的Capto翻C)的捕獲步驟， 使用50mM磷酸鈉pH6. 0進行柱平衡，并且裝載上清液,而不需要稀釋或pH調(diào)節(jié)。柱子洗滌 后，使用50mM Tris pH9. 0的洗脫緩沖液通過pH梯度洗脫蛋白質(zhì)。特定的洗滌和梯度條件 將根據(jù)待洗脫蛋白質(zhì)的Pi而略有改變。然后使用流過步驟進一步純化洗脫物峰,使用陰離子交換色譜。這除去了殘余的 HMW污染,如醇氧化酶并減少了內(nèi)毒素。用PBS或不含鹽的磷酸鹽緩沖液pH7. 4將樹脂平 衡。將來自Capto MMC的洗脫物裝載在陰離子交換樹脂上時，dAb沒有結(jié)合，并從流過物中 回收。內(nèi)毒素和其他污染物結(jié)合樹脂。如果使用PBS緩沖液，鹽的存在將該步驟中的蛋白 質(zhì)回收提高至91%,而無鹽獲得了 86%回收。然而，鹽的存在降低內(nèi)毒素除去的有效性，使 得與沒有鹽存在時獲得的水平< L OEU/ml相比較,使用鹽的該步驟后的dAb的通常內(nèi)毒素 水平測量為58EU/ml。蛋白質(zhì)表征將產(chǎn)自5L發(fā)酵罐運行的材料進行表征，使用電噴霧質(zhì)譜進行同一性分析,氨基端 測序和等電子聚焦，以及使用SDS-PAGE, SEC和Gelcode糖蛋白染色試劑盒(Pierce)測定 純度。同一性每個蛋白的頭五個殘基的氨基末端序列分析與預(yù)期的相同(EVQU.....)。對蛋白質(zhì) 樣品進行了質(zhì)譜分析，該樣品已經(jīng)使用C4Zip-tips(Millip0re)緩沖交換至50 50H20 含有0. 冰醋酸的乙腈中。允許與內(nèi)部二硫化物鍵的形成為_2的質(zhì)量差異時，對于三個 蛋白各自測量的質(zhì)量在基于一級氨基酸序列的理論質(zhì)量的0. 5Da內(nèi)(使用平均質(zhì)量來計 算)。IEF用來鑒定蛋白質(zhì),基于每種蛋白質(zhì)各不相同的pi。將三種蛋白質(zhì)以111 g和10 11 g的量裝載于非還原SDS-PAGE凝膠....匕一式兩份。在 所有情況中觀察到單個條帶。還進行了大小排阻色譜來證明了純度的水平。對于大小排阻 色譜(SEC),將100 u g的各種蛋白裝載于T0S0H G2000SffXL柱上，以0. 5ml/rain流動。移動 相為PBS/10%乙醇。對候選物選擇的dAb穩(wěn)定性的研究對于C0PD的指示，需要將dAb遞送至肺,例如使用噴霧器裝置。這將意味著蛋白質(zhì) 將可能經(jīng)歷各種剪切和熱應(yīng)激,這取決于所用的噴霧器類型，并將接受肺環(huán)境中蛋白酶的 酶降解。測定了使用這種類型的裝置來遞送蛋白質(zhì)，是否形成正確的顆粒大小分布并在噴 霧器遞送后保持功能性。因此，研究了各個分子對各種物理應(yīng)力的內(nèi)在穩(wěn)定性，來測定基線 穩(wěn)定性和最敏感穩(wěn)定性指示測試。因為每種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性將取決于其溶解的緩沖溶液，
56因此需要一些預(yù)配制的工作。該信息,如緩沖液、PH,對于理解下游純化過程和隨后的存儲 過程中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性也是有用的。為了表征分子在暴露于各種物理應(yīng)力過程中的變化， 使用了各種分析技術(shù)，如大小排阻色譜(SEC)、SDS-PAGE和等電聚焦(IEF)。DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511 和 DOM 1.H-131-206 的蛋白酶穩(wěn)定性測定通過在過量蛋白酶下預(yù)孵育限定的時間點后殘余結(jié)合活性的BIAcore 分析來測 定 DOM 1H-131-202、DOM 1H-131-511 和 D0M1H-131-206 的蛋白酶穩(wěn)定性。將大約 1400RU 的生物素化TNFR1覆蓋鏈霉抗生物素(SA)芯片。只用PBS或用100 y g/ml胰蛋白酶、彈性 蛋白酶或 1 eucozyme 來孵育 250nM 的 DOM 1H-131-202、D0M 1H-131 -511 和 D0M1H-131-206， 在30°C下持續(xù)1、3和24小時。通過加入蛋白酶抑制劑的cocktail來停止反應(yīng)。然后使用 參考細胞減去將dAb/蛋白酶混合物在TNFR1覆蓋的芯片上通過。在每個注射循環(huán)之間用 10ul 0. 1M甘氨酸2使芯片表面再生。相對于沒有蛋白酶的dAb結(jié)合，測定用蛋白酶預(yù) 孵育的結(jié)合人 TNFR1 (在 10 秒時)的 DOM 1H-131-202、D()M 1H-131-511 和 DOM 1H-131-206 的部分。在25°C下進行BIAcore 運行。從三個獨立的實驗產(chǎn)生數(shù)據(jù)。條形圖表示平均值， 而誤差棒表示結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(對于結(jié)果，參見圖24)。發(fā)現(xiàn)與DOM III-131-511 相比 DOM 1H-131-202 和 DOM 1H-131-206 顯示出對胰 蛋白酶、彈性蛋白酶或:[eucozyme的蛋白水解降解具有更高的抵抗力。用胰蛋白酶Ihr 后和用彈性蛋白酶或leucozyme 3hr后，與D0M1H-131-511相比DOM 1H-131-202和D0M 1H-131-206之間的差異最明顯。使用DSC測定的熱穩(wěn)定性為了測定分子具有最大穩(wěn)定性的pH,使用差示掃描量熱法(DSC)來測量 Brit.ton-Robinson緩沖液中各種dAb的解鏈溫度(TJ。因為Britton-Robinson是由三種成 分的緩沖體系(醋酸鹽、磷酸鹽和硼酸鹽)制成的，因此可能在相同的溶液中產(chǎn)生3-10的 pll范圍。從蛋白質(zhì)一級氨基酸序列測定理論pi。從DSC,發(fā)現(xiàn)dAb具有最高內(nèi)在熱穩(wěn)定性的 pH,對于 DOM 1.H-131-202(202)為 pH7,對于 DOM 1.H-131-206 (206)為 pH 7-7. 5,和對于 D0M 1H-131-51K511)為pH7. 5。對于所有隨后的應(yīng)力和穩(wěn)定性工作,對于各種dAb,使用以下的 pH;在 Britton-Robinson 緩沖液中，對于 DOM 1H-131-202 (202)和 DOM 1H-131-206 (206) 為pH7. 0,而對于DOM III-131-511 (511)為pH 7. 5。結(jié)果概括于以下的表3中表3:在Britton-Robinson緩沖液中，以Img/ral通過DSC測定的 D0M1H-131_202(202)、D0M 1H-131-206 (206)和 DOM 1H-131-511 (511)的 pH 和 Tm 的概括 內(nèi)在穩(wěn)定性測試
在離心Vivaspin濃縮器(5K截留)中濃縮所有前導(dǎo)dAb,來測定最大的溶解性和 濃縮時的回收水平。在Britton-Robinson緩沖液中在最穩(wěn)定的pH下進行實驗。在整個時 間過程中測量樣品體積和濃度，記錄與預(yù)期濃度的偏差以及樣品的回收百分比。發(fā)現(xiàn)所有蛋白在Britton-Robinson緩沖液中可濃縮至超過l()0mg/m:L與DQM: 1H-131-511(511)相比，DOM lH-131-202(202)和 D0M1H-131-206 (206)顯示出低于預(yù)期的 回收，但仍然在可接受的水平內(nèi)。前導(dǎo)dAb的噴霧器遞送通過測試不同的噴霧器和配制緩沖劑，證明了使用各種噴霧裝置能有效地遞送 dAb。更重要地，第一次表明了配制緩沖液中的dAb的噴霧產(chǎn)生了有效肺遞送期望的粒徑分 布(使用< 5 u m的液滴的百分比來比較)，同時維持了蛋白的功能性。以下將對這進一步在六個噴霧器裝置中測試了 DOM 1H-131-511(511),所述六個噴霧器裝置包括來 自液體制劑的三個主要噴霧器組，即超聲波噴霧器、噴射噴霧器和振動篩噴霧器，的每組的 兩個裝置。在每個裝置中，使用各種PEG濃度，測試5mg/ml的dAb。對于每個樣品，使用 Malvern Spraytek 裝置(Malvern Instruments Limited, UK)測量液滴大小< 5 y m的百 分比，并且在圖35中顯示了結(jié)果。使用SEC測定噴霧后每個樣品的穩(wěn)定性，以分析在杯子 中剩余的材料中和在收集的氣溶膠中已經(jīng)二聚化的樣品量。在圖36中可看到結(jié)果。二聚 物形成的程度越低，穩(wěn)定性越高。大部分裝置可以遞送40%或更多的正確大小范圍中的液體制劑，但eFlow(振動 篩噴霧器裝置)和PARI LC(噴射噴霧器)裝置進行地較好,緩沖液中包括PEG時，PARI LC* (星號)裝置遞送超過80%。使用eFlow也觀察到了這種用PEG的遞送提高，而使用 PARI LC+，程度較低。重要地,還發(fā)現(xiàn)在噴霧后,保持了 dAb的活性(參見圖8中的結(jié)果)。緩沖添加劑的作用由于DOM 1H-131-511(511)較低的穩(wěn)定性，50mM磷酸鹽配制緩沖劑含有PEG 1000 和蔗糖，并且具有限定為約等于含有1.2% (w/v蔗糖)的50mM磷酸鹽緩沖液中約2%至 約10% PEG 1000溶液粘度的范圍內(nèi)的粘度，以幫助保護dAb免受剪切和熱應(yīng)激。因為DQM: lH-131-202(202)和DOM 1H-131-206 (206)都具有較高的Tm,并顯示出顯著提高的對熱應(yīng) 力的穩(wěn)定性，在最初的配制緩沖液和Britton-Robinson緩沖液中(其具有低于配制緩沖 液的粘度)測試了所有的分子。在E-flow和Pari LC+裝置中測試了 dAb，在5mg/ml的蛋 白質(zhì)濃度下使用3. 5分鐘的運行時間，并使用Malvern Sparytek裝置測定粒徑分布。作為 比較,在其自身的配制緩沖液中測試了使用噴霧器裝置遞送的用于囊性纖維化的市售藥物 (稱為標(biāo)準(zhǔn)蛋白X)。結(jié)果顯示于圖37中。對于良好遞送和分布至深肺中，理想的粒徑為小 于6微米，例如，< 5 ii m。在Britton-Robinson緩沖液和配制緩沖液中(如之前所述的)， 所有dAb獲得了低于5 u m的類似的粒徑水平。然而,配制緩沖液較高的粘度對產(chǎn)生正確大 小范圍內(nèi)的顆粒特別有益,例如,顆粒< 5um。在噴霧之前和之后通過測量來測定裝置 杯中的dAb濃度。發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)濃度沒有顯著變化，表明在遞送過程中沒有優(yōu)先將蛋白質(zhì) 或載體噴霧。霧，重要的是在噴霧后保持穩(wěn)定性和生物活性,并且在噴霧后不存在觀察到的明顯聚集。將 提高粘度的賦形劑如PEG加入緩沖液制劑中時，可以改善粒徑分布和液滴大小小于5 U m的 百分比，因此潛在地改善了將dAb遞送至深肺。 實施例1 使用了絲狀噬菌體(fd)展示載體，pD0M13。該載體產(chǎn)生具有噬菌體外殼蛋白III 的融合蛋白。圖1中說明了 PD0M13的多個克隆位點。作為Sall/NotI片段來克隆編碼dAb在pD0M13 中克隆編碼 dAb DOM 4-130-54 (其結(jié)合 IL-1R1)、D0Mlh-131-511 (其結(jié) 合TNFR1)以及D0M 15-10、D0M15-26和D0M15-26-501 (這些結(jié)合VEGFA)的基因，并根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生展示這些dAb的噬菌體。通過PEG沉淀來純化噬菌體,重懸浮于PBS中并滴定。作為分離的蛋白測試時，以....匕的dAb展示了各種抵抗胰蛋白酶降解的能力。如下 測定對降解的抵抗性用40 11 g/ml的胰蛋白酶在30°C下孵育PBS中的dAb (lmg/ml),獲得 了 25 IdAb 胰蛋白酶的分子比例。在即將加入胰蛋白酶之前,然后在T= 1小時、3小 時和24小時時,取樣(30 y 1)。通過加入Roche Complete蛋白酶抑制劑(2x)來中和蛋白 酶活性，接著浸入液氮中，并儲存在千冰....匕隨后通過在Novex 10-20% Tricine凝膠....丨二的 電泳來分析15 y g的各種dAb樣品，并用SureBluedx)將蛋白質(zhì)染色。在頭三個小時的過程中，D0M1.5-10和D0M 15-26-501得到了明顯消化。D0M 15-26、D0M 4-130-54和DOM lh-131-511更穩(wěn)定，dAb的消化只在24小時后變得明顯(圖還在胰蛋白酶存在下孵育了噬菌體展示的dAb,以評價噬菌體展示的dAb的胰蛋 白酶抗性是否與使用分離的可溶性dAb獲得的結(jié)果相關(guān)聯(lián)。測試了各種濃度的胰蛋白酶和 孵育時間。在所有情況中，用RocheComplete蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶后,測試了噬菌體 結(jié)合通用配體的能力，通用配體為蛋白A(其結(jié)合所有VH結(jié)構(gòu)域抗體(例如，DOM lh-131、 D0M 15-26、D0M 15-26-501))或蛋白L(其結(jié)合所有Vk結(jié)構(gòu)域抗體(例如，D0M 4-130-54、 D0M15-10))。還測試了噬菌體結(jié)合目標(biāo)抗原。在兩種情況中，設(shè)想結(jié)合與dAb通過抵抗蛋 白水解保持結(jié)構(gòu)完整性相關(guān)。通過ELISA (使用對抗噬菌體的綴合抗體)或通過結(jié)合的噬 菌體的洗脫和指數(shù)生長的大腸桿菌TG1細胞感染后的滴定度分析來測量結(jié)合活性。用噬菌體上的D0M15-10、D0M15-26 和 D0M 15-26-501 進行測試在室溫下用各種胰蛋白酶濃度(100 u g/ral ,10 u g/ml和0 u g/ral)處理每種dAb --小時。用Roche Complete蛋白酶抑制劑(IX)阻斷胰蛋白酶活性,然后將噬菌體稀釋于 PBS中的2% Marvel 1中，在室溫下用50nM生物素化的抗原(重組人VEGF(R&D systems)) 孵育一小時。加入在室溫下用PBS中的2% Marvel 1預(yù)封閉一小時的鏈霉抗生物素覆蓋的
59珠子(Dynabeads M-280 (Invitrogen),然后將混合物在室溫下孵育五分鐘。使用Dynabeads 的所有孵育步驟在轉(zhuǎn)輪—t進行。通過用Iml PBS中的0.1%吐溫-20將珠子洗滌八次來 洗掉未結(jié)合的噬菌體。用0. 5ml的0. IM甘氨酸pH2. 2洗脫結(jié)合的噬菌體，并用100 μ IlM Tris-HCl pH8. 0中和。使用洗脫的噬菌體來感染指數(shù)生長的TGl細胞(在37°C下一小時)， 并涂布于四環(huán)素平板上。將平板在37°C下孵育過夜,并進行菌落計數(shù)(參見表4)。從用 100 μ g/ml胰蛋白酶孵育的選擇觀察到最好的結(jié)果。與DOM 15-10和DOM 15-26-501相比 較，DOM 15-26的產(chǎn)量提高約10倍。在更嚴(yán)格的孵育條件下進行第二個實驗來進一步證實這些結(jié)果。伴隨攪拌 (250rpm)將噬菌體 展示的dAb在37°C下處理1小時或2小時。從用100 μ g/ml胰蛋白酶孵 育2小時的選擇觀察到最好的結(jié)果。D0M15-26的產(chǎn)量是DOM 15-26-501的產(chǎn)量的200倍， 是DOM 15-10的產(chǎn)量的1000倍。在第三個實驗中，開始時將展示DOM 15-26和DOM 15-26-501的噬菌體以1 1 混合。然后伴隨攪拌(250rpm)用胰蛋白酶(1000 μ g/ml)或沒用胰蛋白酶在37°C下孵育2 小時，然后如上所述選擇抗原結(jié)合。來自每個選擇的十個克隆的測序揭示對于沒用胰蛋白 酶的預(yù)處理的克隆混合群(D0M 15-26 4/10 ；DOM 15-26-501 :6/10)，而來自用胰蛋白酶選 擇的所有克隆和預(yù)期一樣編碼DOM 15-26。這些實驗表明通過將蛋白酶加入展示dAb的噬菌體中可以獲得選擇壓力，使得 (在通用配體或抗原上淘選后)優(yōu)先選擇展示對蛋白水解最穩(wěn)定dAb的噬菌體。表 4 用噬菌體上的DOM 4-130-54進行測試用以上所述的相似實驗方案測試了 DOM 4-130-54。改變的參數(shù)如下胰蛋白酶的 濃度、孵育的溫度和長度。對抗PBS中InM濃度的IL-RI-Fc(IL-lRI和Fc的融合體)來進 行生物淘選。只在37°C下用100 μ g/ml胰蛋白酶孵育噬菌體后觀察到噬菌體滴定度的顯著降低(參見表5)。表5 用DOM lh-131噬菌體的測試在室溫下用0 μ g/ml、10 μ g/ml UOO μ g/ml 和 1000 μ g/ml 胰蛋白酶處理 DOM lh-131噬菌體(對于氨基酸序列，與DOM lh-131-511密切相關(guān))一小時。通過加入25x Complete蛋白酶抑制劑(Roche)來抑制消化。沿著用InM TNFRI覆蓋的ELISA平板進行噬 菌體的連續(xù)2-倍稀釋，并用抗M13-HRP檢測結(jié)合噬菌體。結(jié)果顯示于以下的表6中。表6 這些測試實驗清楚地表明了 ΙΟΟμ g/ml胰蛋白酶和37°C的溫度適于將選擇壓力 施加于展示對胰蛋白酶的蛋白水解有不同程度抵抗性的dAb的噬菌體。如果需要,對于每 種噬菌體展示的dAb，優(yōu)化蛋白酶的孵育時間。實施例3噬茼體展示的結(jié)構(gòu)域杭體集的蛋白酶詵擇使用以下dAb作為母體分子形成了四個集=DOM 4-130-54、D0Mlh_131_511、DOM 15-10 和 DOM 15-26-555。對于 50 μ 1 反應(yīng)，使用 StratageneMutazyme II 試劑盒、生物素化 的引物和5-50pg的模板，通過PCR在基因中引入隨機突變。用SalI和NotI消化后，用鏈霉 抗生物素-覆蓋的珠子從未消化的產(chǎn)品中純化出插入片段,并在相應(yīng)位點連接入PD0M13。 用純化的連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBl細胞,形成四環(huán)素抗性克隆的大集8.5X IO8(D0M 4-130-54) ,1. 5X IO9(DOM lh-131-511)、6X 108(D0M15_10)和 3X IO9(DOM 15-26-555)。通過用PEG雙重沉淀來制備噬菌體文庫，并重懸浮于PBS中。對于DOM lh-131-511和DOM 4-130-54集,氨基酸突變的比率各自為2. 3和4. 4。 通過使用蛋白A或蛋白L(以1 μ g/ml)覆蓋的孔在噬菌體ELISA中測試96個克隆來測定功 能性。在DOM lh-131-511和DOM 4-130-54集中，各自有62. 5%和27%的克隆呈現(xiàn)出dAb 的功能性展示。對于DOM 15-10和DOM 15-26-555集,氨基酸突變的比率各自為2. 5和4. 6。通過 使用蛋白A或蛋白L(以1 μ g/ml)覆蓋的孔在噬菌體ELISA中測試96個克隆來測定功能 性。在DOM 15-10和DOM 15-26-555集中，各自有31. 3%和10. 4%的克隆呈現(xiàn)出dAb的功 能性展示。DOM 4-1.30-54 和 DOM lh-1.31-511 集用這些文庫進行了四輪選擇,來選擇具有提高的蛋白酶抗性的dAb。第一輪選擇是通過抗原結(jié)合(InM或IOnM抗原)，沒有使用蛋白酶處理來清理文 庫，以除去任何不再以高親和性結(jié)合抗原的克隆。第1輪的輸出為108-IOw范圍(與IO11 噬菌體的輸入相比)，表明大部分文庫以高親和性結(jié)合抗原。在第2輪中，引入了使用100 μ g/ml胰蛋白酶的蛋白酶處理,并且輸出如以下表7中所示。表7 用胰蛋白酶在37°C下處理dAb過夜時，存在顯著的選擇。將該輸出帶至第3輪， 其中用Img/ral或100 μ g/ml胰蛋白酶在37°C下將噬菌體處理24小時。第3輪的胰蛋白 酶處理過的噬菌體的滴定度對于DOMlh-131-511集為IO5-IO6,對于DOM 4-130-154集為 IO7-IO80來自第3輪的所有輸出(用Img/ml和100 μ g/ml的DOM lh-131-511和DOM 4-130-154)經(jīng)歷了對抗InM抗原的第四輪選擇，使用100 μ g/ral胰蛋白酶。滴定度在 IO6-IO8的范圍內(nèi)，與第3輪中看到的相似。對于DOMlh-131-511集,看到--些富集,但對于 DOM 4-130-54集，沒有看到富集。DQM 15-10 和 DOM 15-26-555 集用2nM生物素化的hVEGF(人血管內(nèi)皮生長因子)濃度進行第一輪選擇,并且沒有 使用蛋白酶處理來清理文庫以除去任何不再以高親和性結(jié)合抗原的克隆。第1輪的輸出為 約IO8 (與對于DOM 15-10的101。噬菌體的輸入和對于DOM 15-26-555的IO11噬菌體輸入 相比)，表明大部分文庫以高親和性結(jié)合抗原。用2nM生物素化的hVEGF進行第二輪和第三輪選擇。在hVEGF淘選之前,在胰蛋 白酶(100 μ g/ml)存在下,在搖床(250rpm)中37°C下孵育噬菌體。對于D0M15-10集,孵育 時間為一小時，對于DOM 15-26-555集，為兩小時。輸出如下對于使用DOM 15-10集的第二輪和第三輪選擇,為1. 5X106和9X105 ； 對于使用DOM 15-26-555的第二輪和第三輪選擇，為2. 2 X IO8和3. 9 X IO90實施例4詵擇輸出的分析DOM4-130-54 和 DOM lh-131-511 的集將來自第3輪和第4輪的所有輸出亞克隆至PD0M5載體中，并轉(zhuǎn)化至JM83細胞 中。pl)()M5載體是基于pUC119的載體。通過Plac啟動子驅(qū)動蛋白質(zhì)的表達。GASl前導(dǎo)序 列(參見W02005/093074)確保了分離的可溶性dAb分泌至大腸桿菌JM83的周質(zhì)和培養(yǎng)物上清液中。隨機挑選來自第3輪和第4輪的96和72個單獨的克隆,用于表達。將各自來自第3輪和第4輪輸出的12-24個克隆測序。在兩個選擇中都觀察到了 共有突變，并且選擇大約25個帶有共有基序的克隆用于進一步的表征。這些克隆的氨基酸 序列顯示于圖3(D0:M: lh-131-511選擇的變體)和圖4(D0:M: 4-1.30-54選擇的變體)中，并 作為DNA序列列于圖19A-19L中。將不同于選定克隆中親本序列的氨基酸高亮顯示(相同 的那些用圓點來標(biāo)記)。用框顯示對應(yīng)于CDRU CDR2和CDR3的環(huán)。這些克隆以較大的量表達，并在蛋白L (對于DOM 4-130-54變體)和蛋白A (對于 DOM lh-131-511變體)上純化,在胰蛋白酶(100 μ g/ml或1000 μ g/ral終濃度)存在或不 存在下在37°C下孵育一小時或過夜后,在BIAcore上測試抗原結(jié)合。通常，來自DOM 4-130-54選擇的輸出更穩(wěn)定，對于一小時，大部分 克隆保持對胰 蛋白酶的抗性，對于過夜，最佳克隆保持抗性。相反，對于一小時，來自DOM lh 131 511選 擇的少量克隆能抵抗胰蛋白酶，對于過夜,沒有一個克隆有抵抗力。實施例5選擇輸出的分析D0M15_10和Ρ0Μ15~26~555的集首先在使用或沒有使用胰蛋白酶消化的單克隆噬菌體ELISA上測試了用胰蛋白 酶預(yù)處理的選擇的有效性。挑選了每個文庫第二輪選擇的十八個克隆和第三輪選擇的24 個克隆。將克隆DOM 15-10,DOM 15-26-501和DOM 15-26用作對照。另外的對照包括第二 輪和第三輪胰蛋白酶選擇后來自每個文庫的擴增并純化的噬菌體溶液。將每個噬菌體樣品分成兩個部分，第一部分用100 μ g/ml胰蛋白酶處理，第二部 分沒有用胰蛋白酶處理。兩個部分的孵育在37°C下進行一小時，伴隨攪拌(25()rpra),并通 過加入Roche Complete蛋白酶抑制劑(Ix)阻斷。使用胰蛋白酶消化的和未消化的樣品進行噬菌體ELISA0用0. IM碳酸氫鹽緩沖 液中濃度為ι μ g/ml的neutravidin覆蓋ELISA孔。用PBS的洗滌步驟和在室溫下用PBS 中的1 %吐溫-20封閉抗原覆蓋的孔一小時之后，用稀釋于PBS中1 %吐溫-20中的濃度為 lOOng/ml的生物素化hVEGF覆蓋孔。接著,用PBS洗滌孔,并加入用吐溫-20/PBS 1 1 稀釋的處理過的或未處理過的噬菌體上清液。在37°C孵育30分鐘后，用吐溫-20/PBS 洗滌孔，接著在37°C下用抗-M13噬菌體-HRP綴合物(在1 %吐溫-20/PBS中1/5000稀 釋)孵育30分鐘。然后用PBS和過氧化物酶洗滌孔。通過加入SureBlue試劑啟動反應(yīng)。 約十分鐘后，用等體積的IM HCl停止反應(yīng),并在OD45cm閱讀孔。用胰蛋白酶處理的不穩(wěn)定對照DOM 15-10和DOM 15-26-501的ELISA讀數(shù)獲得低 于0. 404的OD45。，并且認(rèn)為該值為不穩(wěn)定克隆的邊緣值。認(rèn)為產(chǎn)生低于0. 4040D的所有樣 品是不穩(wěn)定的。認(rèn)為所有超過該值的樣品是穩(wěn)定的。表8 表8顯示了每個文庫第二輪和第三輪胰蛋白酶選擇后穩(wěn)定克隆的百分比。在第三 輪選擇后,可以看到兩個文庫中胰蛋白酶抗性克隆的富集。在胰蛋白酶消化后的每種情況 中，含有擴增的純化噬菌體混合物的對照ELISA孔的值在每次選擇后都遠高于0. 404。此 夕卜，將來自第三輪選擇的胰蛋白酶處理過的噬菌體與來自第二輪選擇的胰蛋白酶處理過的 噬菌體相比較時，觀察到信號略有升高。DOM 15-10噬菌體文庫顯示出約14%起始值的升 高。DOM 15-26-555噬菌體文庫顯示出表示約2%起始值的升高。所有這些結(jié)果表明用胰蛋白酶預(yù)處理的選擇能有效地從D0M15-10和 D0M15-26-555的集中選擇胰蛋白酶抗性噬菌體克隆。將來自第二和第三輪選擇(D0M 15-26-555)以及只來自第三輪選擇(D0M 15-10) 的所有輸出亞克隆至PD0M5載體中，并轉(zhuǎn)化至HB2151電感受態(tài)細胞中。pD0M5載體是基于 pUCll.9的載體。通過Plac啟動子來驅(qū)動蛋白質(zhì)的表達。GASl前導(dǎo)序列確保分離的可溶性 dAb分泌至大腸桿菌HB2151的周質(zhì)和培養(yǎng)物上清液中。從每輪選擇(3和4)隨機挑選184 個單獨的克隆，用于在Iml培養(yǎng)物體積中表達。將細菌上清液稀釋于HBS-EP BIAcore緩沖液中(1 1體積比)并分成一式兩 份。將2()μ8·/πα終濃度的胰蛋白酶只加入一個瓶中。伴隨攪拌(250rpm)在37°C下進行孵 育40分鐘。用Roche Complete蛋白酶抑制劑(IX)阻斷反應(yīng)后，在BIAcore 3000上測試 胰蛋白酶處理過的或未處理的噬菌體上清液的抗原結(jié)合(SA傳感器芯片上2，000RU生物素 化的 hVEGF)。挑選克隆的標(biāo)準(zhǔn)是相對于未處理的dAb，< 15%用胰蛋白酶處理過的dAb的抗原 結(jié)合降低(基于選定時間點達到的最大RU),這通常將反映出dAb對蛋白酶處理的穩(wěn)定性； dAb從抗原分離的過程中，兩個時間點之間< 40%的解離速率降低?；谶@些值，將來自 DOM 15-26-555文庫的第二和第三輪選擇的60個克隆以及來自DOM 15-10文庫的第三輪選 擇的17個克隆測序。在兩個文庫的輸出中觀察到共有突變,從每個帶有共有基序的文庫中 選擇17個克隆,用于進一步的表征。這些克隆的氨基酸序列顯示于圖5 (D0M 15-26-555選 擇的變體)和圖6 (D0M 15-10選擇的變體)中，并且作為DNA序列列于圖20A-20E中。將 不同于選定克隆中親本序列的氨基酸高亮顯示(相同的那些用圓點來標(biāo)記)。用框顯示對 應(yīng)于CDRl、CDR2和CDR3的環(huán)。在50ml表達培養(yǎng)物中表達這些克隆，在HBS-EP緩沖液中稀釋至IOOnM濃度的 蛋白A (對于DOM 15-26-555變體)或蛋白L (對于D0M15-10變體)上純化，并在胰蛋白 酶(20μ g/ml終濃度)存在或不存在下伴隨攪拌(250rpm)在37°C下孵育1. 5小時后，在 BIAcore上測試抗原結(jié)合。還使用實施例2中所述的方法測試了這些克隆的胰蛋白酶抗性。將蛋白質(zhì)緩沖交 換至PBS中，并濃縮至lmg/ml。將25 μ g蛋白質(zhì)與1 μ g胰蛋白酶(Promega)混合并在30°C下孵育O小時和24小時。該時間后，用RocheComplete蛋白酶抑制劑(IX)和DTT阻斷反 應(yīng)，并加入裝載劑。將樣品在IOCTC下變性五分鐘。然后，通過在Novex 10-20% Tricine 凝膠上電泳來分析15 μ g每種樣品，并且用SureBlue (Ix)將蛋白質(zhì)染色。通常,來自DOM 15-26-555選擇的輸出更穩(wěn)定,在BIAcore上測試時,大部分克隆 保持對胰蛋白酶的抗性持續(xù)1. 5小時,在SDS-PAGE上運行時,持續(xù)過夜。相反,在SDS-PAGE 上運行時，只有少量來自DOM 15-10選擇的克隆對胰蛋白酶的抗性持續(xù)過夜。實施例6
DM lh-131-511 變體的鑒定更詳細地分析DOM lh-131-203、D0M lh-131-204 和 D0Mlh-131-206。用不同濃度 的胰蛋白酶(0至100μ g/ml)在37°C F孵育過夜后，在BIAcore....匕在500nM的dAb濃度F比 較。BIAcore痕跡顯示于圖7中。結(jié)果清楚地顯示了兩種變體對高濃度胰蛋白酶(100 μ g/ ml)的蛋白水解的抗性比它們的親本更高。還在上述條件下,與它們的親本一起，比較了兩 種dAb,DOM lh-131-202和DOM lh-131_206,對抗各種其他蛋白酶,包括leucozyme、彈性蛋 白酶和胰酶，使用lOOwg/ml的蛋白酶濃度。與親本相比較，dAb顯示了提高的對抗所有測 試的蛋白酶的蛋白水解的抗性。對于彈性蛋白酶和leucozyme的BIAcore痕跡顯示于圖8 中。用100 μ g/ml測序級別的胰蛋白酶處理5μ M的每種dAb 0、1、3和24小時。用 25X Roche Complete蛋白酶抑制劑抑制反應(yīng)，并將反應(yīng)在4_12% Novex Bis-Tris凝膠....I:: 運行。凝膠顯示于圖9中。實施例7DOM 4-130-54 變體的鑒定更詳細地分析DOM 4-130-201和DOM 4_130_202。用不同濃度的胰蛋白酶(O至 100 μ g/ml)在37°C下孵育過夜后，在BIAcore上在SOOnM的dAb濃度下比較。BIAcore痕 跡顯示于圖10中。結(jié)果清楚地顯示了所有三種變體對高濃度胰蛋白酶(100 μ g/ml)的蛋白 水解的抗性比它們的親本更高。還在上述條件下，比較了 DOM 4-130-201和DOM 4-130-202 與它們的親本對抗各種其他蛋白酶，包括leucozyme、彈性蛋白酶和胰酶，使用100 μ g/ml 的蛋白酶濃度。盡管結(jié)果沒有使用胰蛋白酶那么明顯，但與親本相比較，前導(dǎo)dAb顯示了提 高的對抗所有測試的蛋白酶的蛋白水解的抗性。對于彈性蛋白酶和leucozyme的BIAcore 痕跡顯示于圖11中。用100 μ g/ml測序級別的胰蛋白酶處理5 μ M的每種dAb 0、1、3和24小時。用 25X Roche Complete蛋白酶抑制劑抑制反應(yīng)，并將反應(yīng)在4-12% Novex Bis-Tris凝膠上 運行。凝膠顯示于圖9中。實施例8DOMlh-131-511 和 DOM 4-130-54 變體的進一步表征首先使用差示掃描量熱法(DSC)分析dAb,以確定胰蛋白酶抗性提高是否與解鏈 溫度(Tm)提高相關(guān)。胰蛋白酶穩(wěn)定性的提高與Tm的提高相關(guān)(參見表9)。表9 還在基于MRC-5細胞的測試中比較了 DOM lh 131 511來源的dAb (參見表10)。 在該測試中，測量了 dAb中和TNFa剌激的IL-8釋放的能力，以確定胰蛋白酶穩(wěn)定性的提 高是否導(dǎo)致功效的降低。然而,該測試中胰蛋白酶抗性dAb的活性沒有受到明顯影響。表 10 在受體結(jié)合測試中測試DOM 4-130-54來源的dAb,以觀察它們是否具有相同的抑 制IL-I與IL-RI結(jié)合的能力(參見表11)。在該測試中，胰蛋白酶抗性dAb的活性沒有受 到影響。
表11 實施例9DOM 15-26-555 變體的鑒定與它們的親本和兩種另外的dAb, DOM 15-26-594和DOM 15-26-595 —起，更詳細 地分析了 DOM 15-26-588、DOM 15-26-589、DOM 15-26-591 和 DOM 15-26-593,這另外兩種 dAb是通過突變形成的，以組合對功效和穩(wěn)定性具有最大影響的突變(E6V和F100S/I)。序 列顯示于圖12中。在用200 μ g/ml濃度的胰蛋白酶孵育后，以IOOnM的dAb濃度,在BIAcore 上比較克隆對hVEGF的結(jié)合。伴隨攪拌(250rpm),將反應(yīng)在37°C下進行三小時和24小時。 最佳克隆DOM 15-26-593和親本的BIAcore痕跡顯示于圖13中。其他結(jié)果作為圖14中的 圖表來表示。結(jié)果清楚地表明了所有變體在24小時的胰蛋白酶處理后，對蛋白水解的抵抗 性高于親本。還通過將處理過的和未處理過的樣品在SDS-PAGE上跑膠檢測了 DOM 15-26-593 和親本的胰蛋白酶抗性。簡而言之,將蛋白質(zhì)緩沖交換至PBS中，并濃縮至lmg/ml。將25 μ g 蛋白質(zhì)與1 U g測序級別的胰蛋白酶(Promega)混合，并在30tTF孵育O小時、1小時、3小 時和24小時。該時間后，用Roche Complete蛋白酶抑制劑(Ix)和DTT阻斷反應(yīng)，并加入裝 載劑。將樣品在IOiTC下變性五分鐘。在Novex 10-20% Tricine凝膠上裝載15 μ g每種樣 品，并且用SureBlue(Ix)將蛋白質(zhì)染色。結(jié)果顯示于圖15中。該實驗中，DOM 15-26-593 的胰蛋白酶抗性特征不同于BIAcore實驗顯示的特征，表明反應(yīng)條件的差異可能影響胰蛋 白酶裂解的最終結(jié)果。盡管如此，DOM 15-26-593比其他選定的克隆具有更好的生物物理 特性，以及親和性,如下所示。還在以下的表12中顯示了 D0M15-26-555變體的特性概述。表12 實施例10DOM 15-10變體的鑒定與其親本DOM 15-10 —起，更詳細地分析了 DOM 15-10-11。序列顯示于圖16中。 在用200 μ g/ml濃度的胰蛋白酶孵育后，以IOOnM的dAb濃度,在BIAcore上比較dAb對 hVEGF的結(jié)合。伴隨攪拌(250rpm),將反應(yīng)在37°C下進行1小時、3小時和24小時。這些 dAb的BIAcore痕跡顯示于圖17中。結(jié)果清楚地表明了選定的變體在24小時的胰蛋白酶 處理后，對蛋白水解的抵抗性高于親本。還通過將處理過的和未處理過的樣品進行SDS-PAGE檢查了前導(dǎo)和親本的胰蛋 白酶抗性。簡而言之,將蛋白質(zhì)緩沖交換至PBS中，并濃縮至lmg/ml。將25yg蛋白質(zhì)與 1 μ g測序級別的胰蛋白酶(Promega)混合，并在30°CTF孵育0小時、1小時、3小時和24小 時。該時間后,用RocheComplete蛋白酶抑制劑(Ix)和DTT阻斷反應(yīng)，并加入裝載劑。將 樣品在IOiTC下變性五分鐘。在Novex 10-20% Tricine凝膠上裝載1.5 μ g每種樣品，并且 用SureBlue(Ix)將蛋白質(zhì)染色。結(jié)果顯示于圖18中。在該情況中，胰蛋白酶抗性特征與 BIAcore胰蛋白酶測試非常相關(guān)，顯示了結(jié)合活性直接反映出蛋白質(zhì)的完整性。實施例11DOM 15-26-555 和 DOM 15-10 變體的進一步表征使用差示掃描量熱法(DSC)分析dAb,以確定胰蛋白酶抗性提高是否與Tm提高相 關(guān)。結(jié)果顯示于表13中。DOM 15-26-555變體的胰蛋白酶抗性和解鏈溫度之間存在關(guān)聯(lián)。 前導(dǎo)DOM 15-26-588和D0M15-26-593顯示出提高的Tm，但其他克隆沒有。值得注意的是 D0M15-26-555 和 DOM 15-10 親本分子在開始時(63. 3-63. 7°C )具有比 D0M4-130-54 和 DOM lh-131-511親本分子(開始時的Tm:57.9-54. 1°C)高得多的Tm,但整體上,蛋白酶抗性克 隆達到了相似范圍的Tm(對于D0Mlh-131-511/D0M 4-130-54變體，平均Tm為65. 1°C，而對 于 D0M15-26-55/D0M 15-10 變體，平均 Tm 為 64. 9 °C )。表13
還在受體結(jié)合測試中比較了 dAb，測量BIAcore動力學(xué)來測定胰蛋白酶穩(wěn)定性提 高是否導(dǎo)致功效降低。然而，測試中dAb的活性基本上沒受影響，或甚至提高了。表14中 呈現(xiàn)了該結(jié)果。表14 提高的Tm的優(yōu)勢大部分蛋白_包括結(jié)構(gòu)域抗體_以兩種狀態(tài)存在折疊狀態(tài)(這導(dǎo)致生物活性分 子)和去折疊狀態(tài)(其不帶有功能性活性)。在所有溫度下,這兩種狀態(tài)共存，并且每種狀 態(tài)的相對比例通常由常數(shù)K來決定，常數(shù)K是折疊和去折疊的動力學(xué)常數(shù)的函數(shù)。通常將 解鏈溫度限定為K = 1時的溫度，即’在該溫度下,折疊蛋白的部分等于去折疊蛋白的部分。 通過使蛋白的分子內(nèi)相互作用穩(wěn)定和失去穩(wěn)定來確定常數(shù)K，并且因此主要是通過蛋白質(zhì) 的氨基酸序列來決定。外部參數(shù)，如溫度、pli、緩沖液組成、壓力，影響著K，并因此影響解鏈 溫度。 對于降解機制，去折疊的蛋白是容易的目標(biāo)(i) 二硫鍵的暴露提高了取決于環(huán) 境的氧化或還原的風(fēng)險，(ii)提高的主鏈靈活性有利于自體蛋白水解反應(yīng)，(iii)肽片段 的暴露將目標(biāo)提供給體內(nèi)的蛋白酶、生產(chǎn)過程中的蛋白酶以及下游加工和長期儲存過程中 的遺留(carry-over)蛋白酶,和(iv)易聚集片段的暴露導(dǎo)致分子間聚集和蛋白沉淀。在 所有情況中，發(fā)生了蛋白完整性、蛋白含量和蛋白活性的丟失，因此妥協(xié)了努力來(i)確保 批次可再現(xiàn)性，(ii)確保架存的長期穩(wěn)定性和(iii)體內(nèi)功效。在自然界中，蛋白質(zhì)通過進化得到了設(shè)計，以在體溫下足以進行任務(wù),并且通過體 內(nèi)平衡機制容易地替換。通過生物技術(shù)方法制造的治療蛋白面對不同的環(huán)境它們通常在 外源宿主中通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn),在大的容器中以較高的含量表達,在整個下游加工 過程中經(jīng)歷非常重要的PH或緩沖液組成的變化，并且最終以高濃度存儲在非生理學(xué)緩沖 液中延長的時間段。新的遞送技術(shù)(例如,吸入、sc貼劑、緩慢遞送的納米顆粒)還增加治 療蛋白經(jīng)受的應(yīng)力。最終,蛋白質(zhì)工程化技術(shù)的出現(xiàn)將導(dǎo)致提高的或完全新的治療蛋白的 產(chǎn)生。因為大部分工程化技術(shù)是基于體外技術(shù)的，目的在于改變或形成新的氨基酸序列,沒 有產(chǎn)生逐漸改善生物蛋白的進化方法，因此導(dǎo)致對于應(yīng)激抵抗力次佳性能的蛋白。本發(fā)明的技術(shù)目的在于再現(xiàn)達爾文進化過程中蛋白質(zhì)面對的條件之一。用在組織 重塑和蛋白質(zhì)體內(nèi)平衡中起主要作用的蛋白酶浸漬(infuse)肽或多肽,例如免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域。還測試了任何可以形成對其功能具有提高適合度的蛋白質(zhì)的特定突變在其 執(zhí)行功能的環(huán)境中適合的能力。在本發(fā)明的一個實施方式中，再現(xiàn)了該方法形成肽或多肽 變體的集，并暴露于蛋白酶。在第二個步驟中，將該變體集接觸特定的目標(biāo)。只有那些通過 蛋白酶持續(xù)降解的蛋白質(zhì)變體能夠嚙合(engage)目標(biāo)，并因此例如通過稱為“生物淘選” 的簡單親和性純化方法來回收。與體內(nèi)方法相比,該系統(tǒng)給予了各種優(yōu)勢蛋白質(zhì)集可以面 對多種條件，例如，各種蛋白酶、濃度較高、持續(xù)較長時間、在不同的緩沖液和PH中以及在 不同的溫度下。因此，這種體外技術(shù)提供了一種設(shè)計蛋白質(zhì)的方式,與產(chǎn)生它們的那些原始 蛋白質(zhì)相比,這些蛋白質(zhì)可以在更多的環(huán)境中執(zhí)行功能和保持穩(wěn)定。顯然,這對于生物技術(shù) 工業(yè),并且特別是治療蛋白領(lǐng)域,提供了多個優(yōu)勢。實施例12 對于蛋白酶抗性前導(dǎo)的相關(guān)性數(shù)據(jù)在體內(nèi)進一步評價了四個dAb譜系中每個的親本dAb和蛋白酶抗性dAb (對于列 表和詳細內(nèi)容,參見以下的表15)表15 * :通過MRC5/IL-a生物測試測定的；1* 通過RBA測試測定的標(biāo)注DOM 15-26-501是本專利申請中以上舉例的DOM 15_26_555的親本形式。 DOM 15-26-555在CDRl中具有一個種系氨基酸突變(134M)。DOM 15-26-501具有比DOM 15-26-555更低的解鏈溫度(52°C v68. 3°C )，和提高的對胰蛋白酶消化的敏感性。對于PK 研究,優(yōu)于DOM 15-26-555,選擇了 DOM 15-26-501,因為其與DOM 15-26-593相比，對于差 的穩(wěn)定性，是更好的代表。我們將抵抗性翻譯如下1 為低2為中等3為良好4 為高5為非常高然后這表示親本分子的胰蛋白酶抗性為DOM 4-130-54 良好DOM lh-131-511 良好DOM 1.5-10 低DOM 15-26-501 低對于選定的前導(dǎo)DOM 4-130-202 非常高DOM lh-131-206 非常高DOM 15-10-11 高DOM 15-26-593 高因為結(jié)構(gòu)域抗體的大小小(12-15kDa) , iv或sc注射時，它們從循環(huán)中快速清除。 實際上，腎小球過濾的截留為高于50kDa,并且因此小蛋白如dAb不能保持在循環(huán)中，因為 它們能通過腎臟。因此,為了評價在體內(nèi)對蛋白酶抗性的長期效果,我們用提高全身停留的部分標(biāo)記了結(jié)構(gòu)域抗體。文獻中已經(jīng)報道了幾種目標(biāo)為延長半衰期的方法(例如，PEG、Fc 融合體、白蛋白融合體等)。在本申請中，已經(jīng)用人IgGl抗體的Fc部分標(biāo)記(或格式化) 結(jié)構(gòu)域抗體。這種形式提供了兩個優(yōu)點⑴所得到dAb-Fc的分子大小為 75kDa,這已足 夠大來確保保持在循環(huán)中，(ii)抗體Fc部分結(jié)合FcRn受體(也稱為“Brarabell”受體)。 該受體位于上皮細胞、內(nèi)皮細胞和肝細胞中，并且涉及延長抗體和白蛋白的壽命實際上， 在抗體和其他血清蛋白胞飲作用時，將蛋白質(zhì)定向于酸化內(nèi)體，其中FcRn受體在運輸?shù)絻?nèi) 體之前攔截抗體(通過結(jié)合Fc部分)并將它們返回循環(huán)中。因此，通過將Fc部分標(biāo)記在 dAb上,確保dAb將長期暴露于至少兩個區(qū)室-血清和前—內(nèi)體區(qū)室,其中每種含有特定組 的蛋白水解酶。此外，F(xiàn)cRn受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)胞吞作用，由此將帶有Fc的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至血管外空 間或從血管外空間轉(zhuǎn)移出來。通過將編碼VII和VK dAb的基因融合至編碼人IgGl Fc的基因來完成用Fc的格 式化,通過短的插入肽連接物(粗體)對于VH dAb (下劃線的) EVQ......GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP. . . (hgGlFc). . . PGK* 對于 VK dAb ( F
劃線的)DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP. . . (hlgGlFc). . . PGK*根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實驗方案使用293-fectin (Invitrogen)通過HEK293/6E細胞的瞬時轉(zhuǎn) 染來產(chǎn)生材料。設(shè)計這些細胞用于聯(lián)合PTT系列載體使用時的高水平瞬時表達(Durocher 等，2002)。因此，將dAb基因克隆至改良的pTT5載體(pD0M38)中，以產(chǎn)生Fc融合體表達載 體(參見圖21)。在轉(zhuǎn)染后5天收集來自轉(zhuǎn)染細胞的上清液,通過離心澄清和通過0. 2 μ m 濾器過濾。通過在蛋白A流線型樹脂(GE Healthcare)上捕獲來純化dAb_Fc融合蛋白。在 IOmM檸檬酸鈉pH3中從柱洗脫蛋白質(zhì)，接著加入IM檸檬酸鈉pH6，來獲得IOOmM檸檬酸鈉 PH6的終濃度。在大鼠中測試dAb-Fc分子的體內(nèi)半衰期，將5mg/:kg的目標(biāo)劑量給予雌性 Sprague-Dawley大鼠中(η = 3/組)。應(yīng)當(dāng)注意到目標(biāo)劑量大大超過大鼠中的目標(biāo)濃度， 因此預(yù)期親本dAb和胰蛋白酶抗性dAb之間的親和性差異(參見實施例11)將不會影響分 子在體內(nèi)的命運。因此，預(yù)期在與抗原無關(guān)的消除過程中反映出dAb之間的pK特征差異。在給藥后0. 03、1、4、8、24、48、72、96、120和168小時采取血樣。血塊形成后,取出 血清，然后在hIL-lRl、TNFRl或VEGF抗原捕獲測試中測試hIL-lRl抗原捕獲測試用4ug/mL 抗-hIL-IRl 覆蓋封-閉加入500ng/mL shlL-lRl加入樣品用抗人Fc HRP@1 10，000 檢測TKFRl抗原捕獲測試用0. lug/mL sTNFRl 覆蓋封閉加入樣品
用抗人Fc HRPil 10，000 檢測VEGF抗原捕獲用0. 25ug/mL VEGF 覆蓋封·閉加入樣品用抗人Fc HRP@1 10，000 檢測將來自這些測試的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成每種血清樣品中的藥物濃度。然后使用非區(qū)室 分析(NCA)在WinNonLin中分析每個時間點的平均μ g/in:L。每種dAb-Fc對的PK特征顯示 于表16中，該表概括了測定的PK參數(shù)。表16 結(jié)果清楚地表明-盡管dAb-Fc對4-130-54和lh-1.31-206的PK特征幾乎是可 重疊的(superimposable)-特征與其他對變化很大?？紤]AUC/D時，作用大部分是可見 的15-10 的 AUC/D 只是 15-10-11 的 42%. 15-26-501 的 AUC/D 只是 15-26-593 的 11%。 這些重要的差異還影響了(程度較低)半衰期對于15-10和15-10-11，各自為43. 2h vs. 56. 6h。使用DOM 15-26譜系時，看到了更大的差異對于15-26-501和15-26-593，各 自為12. 9hvs. 86. 2h。實際上,對于使用非區(qū)室分析的良好 >Κ分析,應(yīng)當(dāng)存在至少4個用于 擬合線性回歸斜率的數(shù)據(jù)點，并且估算半衰期的時間段應(yīng)當(dāng)為計算的半衰期的至少3倍。根據(jù)在此實施例中所述的生物物理特征，顯示出任何給定的dAb抵抗胰蛋白酶降 解的能力與dAb-Fc融合體在大鼠血清中循環(huán)較長的時間段的能力相關(guān)。實際上,如實施例 中所示的,如實施例10, DOM 15-10和DOM 15-26-501是最可能降解的dAb 在Iug胰蛋白 酶存在下將25ugdAb在3(TCTF孵育 3h導(dǎo)致完全降解。在該研究中，所有其他dAb (不管 它們是否已經(jīng)用胰蛋白酶選擇(即，DOM 15-10-11、D0M 15-26-593、DOM 4-130-202和DOMlh-131-206)或和親本分子一樣(DOM 4-130-54和DOM lh-131-511)已經(jīng)具有一定的胰蛋 白酶抗性)再次格式化成dAb-Fc分子時，在大鼠中具有相當(dāng)?shù)?>Κ特征。因此，本發(fā)明的PK 研究表明那些dAb具有非常低的蛋白水解抵抗性時，對蛋白水解的敏感性對dAb的體內(nèi)穩(wěn) 定性具有最大的影響。還表明了-超過一定的水平-對胰蛋白酶降解的抵抗性進一步增加 (例如，DOM 4-130-206v D0M4-130-54)沒有顯著增加dAb_Fc分子進--步減緩體內(nèi)消除的 能力。 在三種情況中，在胰蛋白酶存在下的選擇形成了具有提高的熱穩(wěn)定性的新分子 (通過解鏈溫度來限定):D0M 4-130-202、DOM lh-131-206 和 DOM 15-26-593。PK 研究表 明_在本發(fā)明的數(shù)據(jù)集中_解鏈溫度不是適當(dāng)?shù)膮?shù)來合理化觀察到的PK特征實際上， DOM 15-10具有高于DOM 15-10-11的Tm，并且也比DOM 15-10-11更快地從循環(huán)中清除。在 別處，DOM 4-130譜系的兩種dAb具有明顯不同的Tm(差10°C ),并且在格式化成dAb Fc分 子時顯示出幾乎相同的體內(nèi)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)注意到?jīng)]有排除解鏈溫度本身作為關(guān)鍵參數(shù)來預(yù) 測體內(nèi)穩(wěn)定性。它只在使用本發(fā)明的數(shù)據(jù)集時發(fā)生，大的Tm差異(從54V及以上)對dAb 的體內(nèi)命運不具有顯著的影響。這沒有排除在低于54°C的解鏈溫度下，dAb的體內(nèi)穩(wěn)定性 與熱穩(wěn)定性相關(guān)的可能，或甚至可能與熱穩(wěn)定性和對蛋白酶抗性都相關(guān)。實施例13對DOM 10-53-474的胰蛋白酶選擇純化的DOM 10-53-474的胰蛋白酶穩(wěn)定性DOM 10-53-474是結(jié)合IL-13的結(jié)構(gòu)域抗體，具有高的功效。為了測定該dAb在胰 蛋白酶存在下的穩(wěn)定性，用胰蛋白酶消化純化的dAb持續(xù)提高的時間點，并在凝膠上跑膠 來檢查任何可能的蛋白質(zhì)降解。用lullmg/ml測序級別的胰蛋白酶在30°C下孵育25μ1 lmg/ml純化的D0M10-53-474，形成25 1 dAb 胰蛋白酶的分子比例。用胰蛋白酶孵育 dAb lh、4h和24h，并通過加入4μ 1 Roche complete蛋白酶抑制劑接著在冰上孵育來中和 蛋白酶活性。通過將蛋白酶抑制劑加入沒有添加胰蛋白酶的dAb中來制備時間0樣品。隨 后根據(jù)制造商的說明使用Labchip通過電泳分析2μ 1的樣品。圖22顯示了用胰蛋白酶孵育提高時間點的DOM 10-53-474的凝膠電泳。為了比 較，還如上所述用胰蛋白酶處理了一種胰蛋白酶穩(wěn)定的dAb，D0M 15-26-593，并且在旁側(cè)跑 膠。如圖中所示的，甚至在用胰蛋白酶孵育24h后，DOM 15-26-593顯示是穩(wěn)定的。然而， 在24h后，D0M10-53-474降解至一定的程度,但在Ih和4h時間點時顯示為穩(wěn)定的。這些 數(shù)據(jù)表明DOM 10-53-474能在一定程度上抵抗胰蛋白酶的降解，但是沒有最胰蛋白酶穩(wěn)定 dAb之一的DOM 15-26-593那樣穩(wěn)定。噬菌體展示的DOM 10-53-474的胰蛋白酶穩(wěn)定性為了測定噬菌體展示的DOM 10-53-474的胰蛋白酶穩(wěn)定性，將編碼DOM 10-53-474的基因克隆至pD0M33的Sal/Not位點中(圖50)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生噬菌體。 通過PEG沉淀純化噬菌體，重懸浮于PBS中并滴定。用胰蛋白酶孵育噬菌體展示的dAb不同的時間點，以評價胰蛋白酶抗性。用胰蛋 白酶孵育后，感染指數(shù)生長的大腸桿菌TGl細胞后通過滴定分析來測量穩(wěn)定性。在振蕩培養(yǎng)器中，在37°CTF用100 μ g/ml胰蛋白酶孵育100 μ 1噬菌體lh、2h、 4h和過夜。用Roche complete蛋白酶抑制劑(x2)阻斷胰蛋白酶活性，然后將噬菌體稀釋于PBS中的2% marvel中，在室溫下用IOnM生物素化的IL-13孵育--小時。加入在 室溫下用PBS中的2% marvel 1預(yù)封閉一小時的鏈霉抗生物素覆蓋的珠子(Dynabeads M-280 (Invitrogen)，然后將混合物在室溫下孵育5分鐘。使用Dynabeads的所有孵育步驟 在轉(zhuǎn)輪上進行。通過用Iml PBS中的0. 吐溫-20將珠子洗滌八次來洗掉未結(jié)合的噬菌 體。用0. 5ml的0. IM甘氨酸pH2. 2洗脫結(jié)合的噬菌體,并用100 μ 1 IM Tris-HCl ρΗ8. 0 中和。使用洗脫的噬菌體來感染指數(shù)生長的TGl (在37tTF lh)，并涂布于四環(huán)素平板上。 將平板在37°C下孵育過夜，并進 行菌落計數(shù)。用胰蛋白酶消化后的噬菌體輸出滴定度概括 于表17中。用胰蛋白酶孵育提高的時間點時,噬菌體滴定度降低。24h孵育后,所有噬菌體 得到消化。表17.對噬菌體展示的DOM 10-53-474親本進行的胰蛋白酶選擇的輸出滴定度 對胰蛋白酶抗性更大的dAb的選擇為了選擇對胰蛋白酶降解抗性更大的dAb,對于50μ1反應(yīng)，使用Stratergene Mutazyme 11試劑盒、生物素化的引物和5_50pg模板，通過PCR將隨機突變引入編碼DOM 10-53-474的基因中。用SalI和NotI消化后，用鏈霉抗生物素覆蓋的珠子從未消化的產(chǎn)物 中純化插入片段，并在相應(yīng)位點連接入PD0M33。用純化的連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBl細 胞，形成DOM 10-53-474的易錯文庫。文庫的大小為1. 9 X IO9,并且氨基酸的突變率為1. 3。使用該文庫來進行三輪選擇來選擇具有提高的蛋白酶抗性的dAb。只使用抗原沒 有用胰蛋白酶處理進行第一輪選擇，以清除文庫,來除去任何不再以高親和性結(jié)合抗原的 克隆。以IOnM IL-13進行選擇。與6X IOiq的輸入噬菌體相比,第一輪的輸出為2X IO9,表 明大部分文庫以高親和性結(jié)合抗原。用InM生物素化的IL-13進行第二輪和第三輪選擇。在對IL-13淘選之前，用 100 μ g/ml胰蛋白酶在搖床(250rpm)中在37°C下孵育噬菌體。對于第二輪選擇，在室溫下 或在37°C下進行胰蛋白酶孵育lh。第2輪選擇的輸出顯示于表18中。表18.第二輪選擇后的輸出噬菌體滴定度 將來自37°C下Ih胰蛋白酶處理的第2輪選擇的噬菌體輸出用作第3輪選擇的輸 入。對于第3輪選擇，用100 μ g/ml胰蛋白酶處理噬菌體，但持續(xù)了更長的時間點37°C 2h, 37V 4h，室溫下過夜或37°C下過夜。第3輪選擇的輸出滴定度概括于表19中。表19 第三輪選擇后的輸出噬菌體滴定度 將第1、2和3輪的每個選擇輸出的幾個克隆測序，以測定序列多樣性。沒有使用 胰蛋白酶處理的第一輪后,50%的選擇輸出具有親本D0M10-53-474序列。第2輪選擇后， 親本的百分比提高至75%。第3輪選擇后，親本的百分比提高至80%。該數(shù)據(jù)表明DOM 10-53-474已經(jīng)能抵抗胰蛋白酶的降解，并且從這些胰蛋白酶選 擇中沒有選擇出很多新的克隆。圖22顯示了用胰蛋白酶消化純化的蛋白時，即使在胰蛋白 酶處理過夜后，DOM 10-53-474也沒有完全消化。然而,為了觀察選擇輸出中是否存在胰蛋 白酶抗性比D0M10-53-474更高的任何新克隆,將其中用胰蛋白酶在37°C下處理噬菌體過 夜的選擇3輸出亞克隆至pD0M5中。然后將一百個克隆測序，以尋找任何胰蛋白酶抗性克 隆。在分析的一百個克隆中，只有26個克隆具有新的序列，然而，這些克隆中沒有一個在胰 蛋白酶裂解位點(賴氨酸或精氨酸)具有突變,表明這些克隆對胰蛋白酶的抗性沒有比DOM 10-53-474 更高。實施例14通過在胰蛋白酶存在下噬菌體選擇將存儲和生物物理改進引入前導(dǎo)DOM 0101 (抗 TNFR1) dAb 中為了提高前導(dǎo)分子DOM lh-131-511的蛋白酶抗性,如之前所述的,在胰蛋白酶存 在下進行噬菌體選擇。該方法產(chǎn)生了多個與親本DOMlh-131-511分子相比具有提高的胰蛋 白酶穩(wěn)定性的克隆。選擇了兩個克隆，DOM lh 131 202和DOM lh-131-206用于進一步的 表征，因為它們顯示出對胰蛋白酶的作用最顯著的提高。以下所述的更多工作表明伴隨著 對胰蛋白酶的作用提高的抵抗力，存在其他有益的作用，主要在于分子對剪切力和熱應(yīng)力的穩(wěn)定性。這兩個參數(shù)對提高生物藥物產(chǎn)品的存儲和架存期穩(wěn)定性是關(guān)鍵的。在巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)前導(dǎo)DOM 0101 dAb 將編碼三個前導(dǎo)分子的一級氨基酸序列的基因用于在巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)分泌的蛋白質(zhì)。將三個合成基因(DOM lh-1.31-511、D0Mlh-131-202和DOM lh-1.31-206)克隆 至表達載體pPIC-Ζα中，然后轉(zhuǎn)化至兩個畢赤酵母株中,X33和KM71H。將轉(zhuǎn)化的細胞涂布 于遞增濃度的Zeocin上(100、300、600和900 μ g/ml)，以選擇具有多個組分的克隆。然后 在2L燒瓶中篩選幾個克隆，以鑒定高表達細胞系。然后將最佳表達的克隆用于在發(fā)酵罐中 在5L規(guī)模下生產(chǎn)材料。蛋白質(zhì)純化和材料表征為了生產(chǎn)用于表征和進一步穩(wěn)定性研究的高質(zhì)量材料，使用混合模式電荷誘導(dǎo)樹 脂(Capto MC)作為最初的捕獲步驟接著陰離子交換(QS^harose)來設(shè)計下游純化過程。 沒有明顯優(yōu)化,這使得可以回收 70%純度為 95%的表達的dAb。對于同一性,使用電噴 霧質(zhì)譜、氨基端測序和等電聚焦來表征材料,對于純度，使用SDS-PAGE和SEC(大小排阻色 譜)來表征材料。蛋白質(zhì)同一性每種蛋白質(zhì)的頭五個殘基的氨基端序列分析與預(yù)期一樣(EVQL1..)。對蛋白質(zhì)樣 品進行了質(zhì)譜分析，該樣品已經(jīng)使用C4Zip-tips(Millip0re)緩沖交換至50 50 H2O 含 有0. 冰醋酸的乙腈中。允許與內(nèi)部二硫化物鍵的形成為_2的質(zhì)量差異時，對于三個蛋 白各自測量的質(zhì)量在基于一級氨基酸序列的理論質(zhì)量的0. 5Da內(nèi)(使用平均質(zhì)量來計算)。 IEF用來鑒定蛋白質(zhì),基于每種蛋白質(zhì)各不相同的ρ]:。蛋白質(zhì)純度將三種蛋白質(zhì)以1 Ii g和10 μ g的量裝載于非還原SDS-PAGE凝膠....I::, 一式兩份。在 所有情況中觀察到單個條帶。還進行了大小排阻色譜來證明了純度的水平。對于大小排阻色譜(SEC)Jf 100 μ g的各種蛋白裝載于TOSOH G2000 SWXL柱上，以0. 5ml/min流動。移動相為PBS/10% 乙醇?；谇€F的面積來計算單體的百分比(參見圖23)。DOM lh-131-511、-202 和-206 的穩(wěn)定性比較蛋白酶穩(wěn)定性的測定通過在過量蛋白酶下預(yù)孵育限定的時間點后殘余結(jié)合活性的BIAcore 分析來測 定 DOM lh-131-511、D0M lh-131-202 和 D0Mlh-131-206 的蛋白酶穩(wěn)定性。將大約 1400RU 的 生物素化TNFRl覆蓋鏈霉抗生物素(SA)芯片。只用PBS或用100 μ g/ml胰蛋白酶、彈性蛋 白酶或 Ieucozyme 來孵育 250nM 的 DOM lh-131-511、D0M lh-131-202 和 DOMlh-131-206,在 30°C下持續(xù)1、3和24小時。通過加入蛋白酶抑制劑的混合物來停止反應(yīng)。然后使用參考 細胞減去將dAb/蛋白酶混合物在TNFRl覆蓋的芯片上通過。在每個注射循環(huán)之間用10 μ 1 0. IM甘氨酸 >Η2. 2使芯片表面再生。相對于沒有蛋白酶的dAb結(jié)合，測定用蛋白酶預(yù)孵育 的結(jié)合人 TNFRl (在 10 秒時)的 DOM lh-131-511、D0M lh-131-202 和 DOMlh-131-206 的部 分。在25°C下進行BIAcore 運行。從三個獨立的實驗產(chǎn)生以下的數(shù)據(jù)。條形圖表示平均 值，而誤差棒表示結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(圖24)。發(fā)現(xiàn)與DOM lh-131-511 相比 DOM lh-131-202 和 DOM lh-131-206 顯示出對胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme的蛋白水解降解具有更高的抵抗力。用胰蛋白酶 Ihr 后和用彈性蛋白酶或 leucozyme 3hr 后，與 DOMlh-131-511 相比 DOM lh-131-202 禾口 DOM lhIF131 206之間的差異最明顯。存在這樣一種傾向在大部分測試的條件中，DOM Ih-131-206 比 DOM lh-131-202 略微更穩(wěn)定些。使用DSC測定的dAb熱穩(wěn)定性
為了測定前導(dǎo)分子具有最大穩(wěn)定性的pH，使用差示掃描量熱法(DSC)來測量 Bri tton-Robinson緩沖液中各種dAb的解鏈溫度(Tm)。因為Britton-Robinson是由三種 成分的緩沖體系(各自40m:M:的醋酸、磷酸和硼酸)制成的，因此可能在相同的溶液中產(chǎn)生 3-10的pH范圍。從蛋白質(zhì)--級氨基酸序列測定理論pi。從DSC,發(fā)現(xiàn)dAb具有最高內(nèi)在 熱穩(wěn)定性的 PH，對于 DOM lh-131-202 為 pH7,對于 DOM lh-131-206 為 pH7_7. 5，和對于 DOM lh-131 511，為pH7. 5。對于所有隨后的應(yīng)力和穩(wěn)定性工作，對于各種dAb,使用以下的pH ； 在 Britton-Robinson 緩沖液中，對于 DOM lh-131-202 和 GSK 1995057A DOM lh-131-206 為pH 7. 0,而對于DOM lh-131-511為pH 7. 5。結(jié)果概括于以下的表20中表20 在Britton-Robinson 緩沖液中，以 lmg/ml 通過DSC測定的 D0Mlh-131-202、 DOM lh-131-206和DOM lh-131-511的pH禾口 Tffl的概括。溫度變化為180°C /小時。 蛋白質(zhì)在升高的溫度下能持續(xù)延長時間段的能力通常是穩(wěn)定性的良好指示。 在這些條件下，蛋白質(zhì)可能經(jīng)歷幾個物理過程，如聚集或化學(xué)修飾。將dAb(lmg/ml)在 Britton-Robinson緩沖液中在37和50°C下孵育14天。使用SEC來測定14天的時間段中 溶液中剩下多少單體(圖25)。從圖25，可以看出DOM lh-131-202和DOM lh-131-206對熱應(yīng)力的穩(wěn)定性顯著高 于DOM lh 131 511。將蛋白質(zhì)暴露于升高的溫度下，如37和50°C，通常用于獲得藥物長期 架存期的指示。將這些較高的溫度用于加速與室溫下長期存儲相關(guān)的正常過程,如脫酰胺、 氧化或聚集。還可以使用SEC監(jiān)控溶液中聚集形成的水平(圖26A至I)。在37°C下14天 后，溶液中DOM lh-131-511的丟失歸因于更高級別的聚集物沉淀和形成，如通過SEC所測 定的(圖 26B)。在 370CT 14 天后，還看到了 DOM lh-131-202 和 DOM lh-131-206 顯著減 少的蛋白質(zhì)丟失,并且聚集物形成非常少或基本沒有增加,尤其是在DOM lh-1.31-206的情 況中(圖26H)。在50°C下,分子間的差異甚至更明顯,DOM lh-131-206在較高溫度下14天 后顯示出高于DOM lh-131-202的穩(wěn)定性，表明較高分子量聚集物的形成明顯減少(圖26)。 相對于t = 0’D0M lh 131 206在14天后只顯示了聚集物形成的少量增加(圖261)，而DOMlh-131-511幾乎全部從溶液中沉淀出來(圖26C)。這表明通過胰蛋白酶選擇引入dAb中的變化，例如，提高的熱穩(wěn)定性，顯著提高了在37和50°C下的蛋白質(zhì)存儲穩(wěn)定性。DOM lh-131-202和更明顯地DOM lh-131-206，清楚 地在升高的溫度下具有提高的溶液穩(wěn)定性和較低的形成聚集物的趨勢,這可以直接翻譯成 在更相關(guān)的溫度下如+4°C和室溫下提高的長期存儲穩(wěn)定性。然后通過IEF分析從熱應(yīng)激實驗的24hr、48hr、7天和14天時間點取樣，以觀察蛋 白質(zhì)是否經(jīng)歷了將影響蛋白質(zhì)整體電荷的任何生物物理變化(圖27)。再次，與DOM lh-131-511 相比，DOM lh-131-202 和 DOM lh-131-206 在 37°C下顯 示出沒有明顯變化。使用DOM lh-131-511,在37°C下24hr后出現(xiàn)了微弱的第二條條帶。認(rèn) 為這條額外的條帶是由于蛋白質(zhì)的二聚化引起的，因此遮掩了電荷并產(chǎn)生了兩個分子群。 在50°C下，分子間的差異更明顯，DOM lh-131-206清楚地顯示出在升高的溫度下沒有明顯 變化,而DOM lh-131-202在24hr后顯示出一些變化的征兆。Britton-Robinson中的大部 分的DOM lh-131-511在48hr后由于沉淀而丟失。通過TNFR-1RBA分析50tTF T = 0、7和14天時間點，以確定蛋白質(zhì)在暴露于高溫 后的功能性(圖28)。該測試在檢測由于應(yīng)力引起的分子細微變化中通常沒有SEC或IEF 那樣靈敏,但可以使用來顯示dAb仍然可結(jié)合抗原。對于DOM lh-131-511,曲線轉(zhuǎn)移至左邊，反映出大部分的dAb由于沉淀而丟失 的事實。溶液中留下的材料仍然能夠結(jié)合抗原。如圖25中所示的，即使在14天后，DOM lh-131-202和DOM lh-131-206中的大部分能夠維持在溶液中。RBA顯示所有可溶性蛋白 質(zhì)仍然是功能性的并能夠結(jié)合TNFRl。在高蛋白濃度下的存儲穩(wěn)定性測試進行實驗來研究在非常高蛋白濃度下在+4tTF的存儲穩(wěn)定性，以觀察每種分子在 這些條件下怎樣實施作用。將所有前導(dǎo)dAb在Britton-Robinson緩沖液中在其最穩(wěn)定的 pH下在離心Vivaspin濃縮器中(5K截留)濃縮至 lOOmg/m! 0然后將 lOOrag/ml的樣 品在+4°C下保持7天,然后通過SEC分析來觀察樣品在高濃度存儲過程中是否已經(jīng)發(fā)生了 任何其他物理變化(圖29)。在IxPBS 10%乙醇(ν/ν)中的SEC柱上運行之前，將樣品稀 釋至 lmg/ml。從SEC痕跡，可以看出DOM lh-131-202和DOM lh-131-206在7天后都沒有顯示 出聚集物形成的任何顯著增加，其中對于DOM lh-131-511,存在單體濃度 2%的降低。前導(dǎo)dAb的噴霧器遞送對于早期毒理學(xué)和臨床工作，將dAb配制成液體,并通過噴霧裝置來遞送。根據(jù)裝 置(例如，超聲波、噴射或振動篩)，dAb將經(jīng)歷一定程度的剪切力和熱應(yīng)力，因為將其噴霧 來形成限定粒徑的氣溶膠。因為與DOM lh-131-511相比,DOM lh_131_202和-206都具有 較高的Tm，并顯示出顯著提高的對熱應(yīng)力的穩(wěn)定性，在兩個噴霧器裝置中測試了所有dAb， 以觀察它們怎樣應(yīng)答噴霧過程中誘導(dǎo)的剪切力/熱應(yīng)力。然后通過SEC分析來自噴霧氣溶 膠的蛋白質(zhì)和裝置中(即，杯中)剩余的dAb,以確定該過程中產(chǎn)生的聚集量。在其最穩(wěn)定的pH下在Britton-Robinson緩沖液中測試所有分子。在E-flow Rapid(振動篩)和Pari LC+(噴射噴霧器)中測試了 dAb，在5mg/ml的蛋白質(zhì)濃度F使用 3. 5分鐘的運行時間，并使用Malvern Sparytek測定粒徑分布。結(jié)果顯示于圖30中。對于良好遞送和分布至深肺中，理想的粒徑為< 5 μ m。在Britton-Robinson緩沖液中，所有dAb獲得了低于5 μ m的類似的粒徑水平。在噴霧之前和之后通過A28t5測量來測定裝置杯中 的dAb濃度(數(shù)據(jù)未顯示)。發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)濃度沒有顯著變化，表明在遞送過程中沒有優(yōu)先 將蛋白質(zhì)或載體噴霧。將Britton-Robinson緩沖液中噴霧的dAb樣品在SEC上運行，以確定在遞送的過 程中蛋白質(zhì)是否經(jīng)歷了任何物理變化。圖31顯示了通過SEC測定的杯中或氣溶膠中的相 對百分比變化?？梢钥吹较鄬τ贒OMlh-131-511，D0M lh-131-202和DOM lh-131-206經(jīng)歷 了相對小的單體濃度變化。這證明了具有提高Tm的DOM lh-131-202和DOM lh-131-206 對噴霧過程中的聚集具有較低的傾向。圖 32 顯示了 Britton-Robinson 緩沖液中的 DOM lh-131-206 和DOMlh-131-511 在 噴霧后的實際SEC痕跡，并證明了單體的相對損耗(圖31)是由于二聚體形成引起的。這 再次給以下的理論提供了更多的支持證據(jù)由DOM lh-131-202和DOM lh-131-206顯示的 更高熱穩(wěn)定性可以防止明顯的聚集，即使是在未優(yōu)化的配制緩沖液中。對于毒理學(xué)和安全性測定工作，需要將明顯高于給予患者的治療劑量的水平的 dAb遞送至動物。這只能通過使用明顯較高的蛋白質(zhì)濃度和/或在延長的時間段內(nèi)遞送dAb 來實現(xiàn)。因為已經(jīng)表明DOM lh-1.31-511以5mg/ral在3. 5min噴霧過程中形成聚集物,在 PBS中測試了 40mg/ml的DOM lh-131-206,并使用Pari LC+噴霧最高達1小時。在整個運 行過程中的不同時間點從杯子和氣溶膠中取樣，以觀察延長的噴霧是否導(dǎo)致dAb由于剪切 力或熱應(yīng)力(通過SEC所測定)以及蛋白質(zhì)濃度(A280nm測量)而聚集。表21顯示了通 過A280測定的杯子和氣溶膠中的dAb蛋白質(zhì)濃度。表21 測量的使用Pari LC+的 40mg/ml的dAb噴霧過程中杯子和氣溶膠中的 DOM lh-131-206的蛋白質(zhì)濃度，通過A280吸光值讀數(shù)測定的?？紤]到稀釋誤差和儀器誤 差，在dAb噴霧Ihr后，樣品濃度沒有變化。 從表21可以看出蛋白質(zhì)濃度在運行過程中沒有明顯變化，證明不存在由于聚集 引起的蛋白質(zhì)明顯損耗。圖33顯示了在噴霧的1小時時間段中，DOM lh-131-206沒有形成 任何更高級別的聚集物,如二聚物，如通過SEC測定的。這清楚地證明了改善的生物物理特 性,如通過胰蛋白酶選擇引入分子中的,顯著提高了 dAb對剪切力和熱應(yīng)力的抗性,并且這 與提高的存儲架存期以及將蛋白質(zhì)噴霧的能力直接相關(guān)，使得不形成較高級別的聚集物。前導(dǎo)dAb的溶液狀態(tài)因為對于所有三種前導(dǎo)dAb的主要降解途徑,看起來是自締合最初導(dǎo)致二聚化， 接著更多的聚集，并且最終沉淀,通過分析性超速離心(AUC)研究這三種前導(dǎo)分子，以測定自締合的程度。通過兩種方法,沉降平衡和沉降速度,來研究蛋白質(zhì)。對于沉降平衡方法，在0. 5mg/ml至5mg/ml范圍的三種不同濃度下運行三種樣 品，使用三種不同的轉(zhuǎn)子速度而具有離心作用。通過該方法，測定了 DOM lh 131 511是 穩(wěn)定的二聚體(26. 1-34. 4kDa), DOMlh-131-202 是單體 / 二聚體平衡(22. 7-27. SkDa)，在 測量的濃度下具有相對穩(wěn)定的二聚體狀態(tài)，Kd = 1. 3 μ M, DOM lh-131-206主要是單體的 (15. 4-17. 9kDa)，具有360 μ M從單體至二聚體締合的Kd。通過沉降速度方法，所有樣品顯示出稀釋時一定程度的解離。從所獲得的結(jié)果，顯 示于圖34中，對于DOM lh-131-511觀察到的沉降系數(shù)表示了較高級別的聚集物，并且稀釋 時的峰值位移表示了這些聚集物的解離。蛋白質(zhì)聚集和解離相互抵償,這產(chǎn)生了形成穩(wěn)定 的二聚體的印象，如通過沉降平衡所觀察到的。對于DOM lh-131-202觀察到的沉降系數(shù)， 表示了快速動態(tài)平衡，因此單體和二聚體峰沒有相互分開，產(chǎn)生了單峰,具有高于適于樣品 質(zhì)量的沉降系數(shù)。該結(jié)果與通過沉降平衡方法獲得的結(jié)果相一致,并且測量解離常數(shù)為 ΙμΜ。測定DOM lh-131-206比其他兩種樣品單體更多，具有1. 9s的沉降系數(shù),與其他兩種 樣品的2. 5s相比較。該數(shù)據(jù)與沉降平衡數(shù)據(jù)非常一致。在測量的濃度下，低于360 μ M的 Kd 10倍，樣品主要是單體。實施例15DOM 15-26-593dAb 的功效增強圖40中顯示了 DOM 15_26_593dAb超過DOM 15-26親本的VEGFR2受體結(jié)合測試 中功效增強的實例。在該測試中，在基于平板的測試中測量了潛在抑制劑防止VEGF結(jié)合 VEGFR2的能力。在該測試中，將VEGFR2-Fc嵌合體覆蓋在96-孔ELISA平板上，并且向其加 入預(yù)定量的已經(jīng)用連續(xù)稀釋的測試dAb預(yù)孵育的VEGF。洗掉未結(jié)合的蛋白質(zhì)后,用抗-VEGF 抗體檢測結(jié)合受體的VEGF的量，按比色法來測定其水平。按作為測試底物濃度函數(shù)的VEGF 結(jié)合的抑制百分比將劑量應(yīng)答效果作圖。因此，有效的抑制劑是證明了在低濃度下基本上 阻斷了配體結(jié)合的那種。FC融合體功效和半衰期VEGF阻斷在腫瘤治療中的治療潛能已經(jīng)被認(rèn)識了超過30年。癌癥的慢性性質(zhì)決 定了生物藥物需要長的血清半衰期來介導(dǎo)它們的作用，但這與通過腎過濾從循環(huán)中快速清 除游離的dAb不相一致。為了測定VEGFdAb作為抗血管生成藥用于癌癥治療的實用性,通 過雜交連接物將前導(dǎo)結(jié)構(gòu)域抗體與野生型人IgGlFc格式化成融合體,使得形成二價分子， 其通過使用FcRn介導(dǎo)的抗體補救途徑延長了血清半衰期。在該Fc融合體形式中，使用之前所述的測試將前導(dǎo)胰蛋白酶選定dAb, DOM 15-26-593的功效與最初的親本dAb (D0M 15-26)&胰蛋白酶不穩(wěn)定dAb (D0M 15-26-501)相 比較。結(jié)果顯示于以下的表22中表22. Fc融合體形式的DOM 15-26前導(dǎo)的功效(RBA) &半衰期特征 從這些結(jié)果可以看出，二聚Fc融合體形式，由于抗體親抗原性(avidity)的作用， 相對于游離dAb,提高了親和性&功效。清楚的是通過胰蛋白酶選擇獲得的DOM 15-26-593 功效增強在該Fc形式中得到維持，甚至更明顯。此外，熱和蛋白酶穩(wěn)定性的增強翻譯成分 子在體內(nèi)的藥物動力學(xué)行為的深刻變化。DOM 15-26-593與DOM 15-26-501相比較的消除 半衰期的改善(參見圖41)很可能是dAb提高穩(wěn)定性的直接后果，使其對內(nèi)體區(qū)室內(nèi)發(fā)生 的降解過程的抵抗性更大。因此,還預(yù)期了具有提高蛋白酶穩(wěn)定性的dAb能夠在其他生物 區(qū)室中持續(xù)更長的時間，其他區(qū)室如血清、粘膜表面和各種組織區(qū)室，其中蛋白水解是涉及 生物分子周轉(zhuǎn)的活性過程。藥物動力學(xué)清除特征以 5mg/kg 的濃度將 DOM 15-26-593 和 DOM 15-26-501 i. v.給藥于 3 只大鼠后， 測量DOM 15-26-593和DOM 15-26-501的藥物動力學(xué)清除特征。然后使用直接VEGF結(jié)合 標(biāo)準(zhǔn)ELISA測試和抗人Fc抗體測量了血清中DOM 15-26-593和DOM 15-26-501的水平，因 此只檢測了血清樣品中的完整藥物。以下的表23中顯示了完整的藥物動力學(xué)特征表23.大鼠中DOM 15-26&D0M 15_26_593Fc融合體的藥物動力學(xué)參數(shù)概述 從這些結(jié)果可以看出DOM 15-26-593具有顯著提高的藥物動力學(xué)特征,具有,例 如,延長的半衰期和降低清除速率。DOM 15-26-593顯著提高的功效和藥物動力學(xué)特征產(chǎn)生了化合物用于各種其他生 物物理特性的分析。溶液狀態(tài)特征通過SEC-MALLs&AUC的分析使用D0M15-26-593進行的實驗如下 D0M15-26-593在高達2. 5mg/ml的濃度下在溶液中為單體，計算的分子量為 78-81KDa，與大約76kDa的計算的完整分子量相符(附圖42a&42b)。熱熔解性質(zhì)DSC的分析使用DOM 15-26-593進行的實驗如下胰蛋白酶選擇的dAb的提高的熱穩(wěn)定性(65°C，附圖43中間畫面)被維持在Fc融 合物中(64. 50C，附圖43上部畫面)。顯示了 D0M15-26-501dAb (52°C，附圖43下部畫面) 的Tm曲線用于比較。
對凍融的穩(wěn)定性、溫度應(yīng)力和血清成分使用D0M15-26-593進行的實驗如F D0M15-26-593dAb的穩(wěn)定性質(zhì)意味著，D0M15-26-593dAb可以經(jīng)歷物理的和生物 的壓力，而對它結(jié)合VEGF的能力僅有最小的影響(附圖44-47 (a和b))。舉例來說,所述分 子可以從液氮(_196°C )到體溫(37°C )重復(fù)地凍融10個循環(huán)而不損失結(jié)合活性,如ELISA 所測定的(附圖44)。這種處理也不引起分子的聚集狀態(tài)的明顯改變，如通過常規(guī)的大小排 阻色譜所評估的(附圖45)。進一步測試展現(xiàn) 了，該分子可以置于-80°C到55°C的大范圍 的不同溫度下在僅在最高的孵育溫度下168小時之后,僅有較小的抗原結(jié)合活性降低(附 圖46)。此外,與來自人類或短尾猴的血清在37°C孵育14天沒有引起抗原結(jié)合能力的損失 (附圖47a和47b)，如通過VEGF結(jié)合ELISA所測定的。VEGFR2受體結(jié)合分析&HUVEC細胞分析中的功效如上所述的受體結(jié)合分析如下進行如上所述的受體結(jié)合分析被用于評定Fc融合體的功效(附圖48)。發(fā)現(xiàn)的是， D0M15-26-593dAb在這項分析中具有提高的功效，其確立了 dAb在體外阻斷VEGF與VEGFR2 的結(jié)合的能力。還在IIUVEC(人類臍靜脈內(nèi)皮細胞)分析中展現(xiàn)了 DMS 1529的功效，其中 測量了 VEGF拮抗劑阻斷HUVE細胞的VEGF剌激的增殖的能力。在與預(yù)定數(shù)量的VEGF和改 變數(shù)量的測試物質(zhì)固定的孵育時間的結(jié)束時，測定了細胞數(shù)量。拮抗劑的功效更強,觀察到 更少的細胞增殖(附圖49)。實施例16研究的目的研究的目標(biāo)是通過進行噬菌體的蛋白酶處理之后的噬菌體選擇來獲得 GLP-lAlbudAb 融合物的蛋白酶抗性變體。AlbudAb 是特異性結(jié)合血清白蛋白的免疫球蛋 白單可變結(jié)構(gòu)域。GLP-1 受體高血糖素樣肽-1受體(GLP-IR)屬于七種跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體的Bl家族。受 體和它的天然激動劑配體GLP-I之間的結(jié)合相互作用起始于配體與受體的細胞外N-末端 結(jié)構(gòu)域(ECD GLP-1R)的結(jié)合,隨后是與跨膜分子的核心的相互作用(Al-Sabah等，2003)。 已經(jīng)顯示的是,如果移除了跨膜核心,結(jié)合分離的N 末端結(jié)構(gòu)域的GLP-1被保持，而親和力 被降低(Lopez de Matimma等,2003)。由于對于在溶液中的噬菌體選擇使用完整的受體 不是期望的，分離的細胞外結(jié)構(gòu)域被用于噬菌體捕獲。盡管肽與它的受體的親和力不與它 的活性直接相關(guān)，它容許我們簡化實驗并利用與ECD GLP-IR的親和力來富集噬菌體展示分 子。測試噬菌體選擇進行測試來證實GLP-I受體的細胞外結(jié)構(gòu)域可以用于噬菌體展示庫選擇。噬菌體載體使用絲狀噬菌體(fd)展示載體(PD0M4)，其基于具有myc標(biāo)簽的fd載體，其中蛋 白質(zhì)序列可以克隆到限制性位點之間來提供蛋白質(zhì)-基因III融合物。編碼文庫集的基因 作為NcoI/NotI片段來克隆。載體在MachI細胞中增殖并使用Mega Preps, Qiagen來分離，超螺旋的級分在氯化銫梯度上分離。載體用Ncol和Notr酶隨后PstI切割,來降低自身連接概率。在苯酚/ 氯仿萃取之后，DNA被乙醇沉淀，從Chromaspin TE-1000柱(Clontech)上的填充物中純化。 在純化之后，載體DNA被用于測試與多種DAT-X DNA片段的連接。DAT-X文庠構(gòu)建
基于包含GLP-1的DAT-X親本分子構(gòu)建十八個集。為了覆蓋GLP-1的完整的序列 (排除對受體結(jié)合重要的位點)，17個集是基于利用50微升反應(yīng)體積中的Phusion高保真 聚合酶的組裝PCR。每個文庫通過引物在初次PCR中引入四個隨機核苷酸，然后用生物素 化的引物進行組裝。對于5()11丨的反應(yīng)，利用8計對呢6加Mutazyme II試劑盒、生物素化 的引物和5-50pg模板的易錯PCR,引入了 GLP-1內(nèi)的隨機突變。使用螺旋接頭序列。由于 GLP-1核苷酸序列的短的長度，易錯PCR進行兩次，來提高突變率。在用Ncol和NotI消化之后，利用鏈霉抗生物素蛋白覆蓋的珠子從未消化的產(chǎn)物 中純化插入物,并在相應(yīng)的位點連接到修飾的PD0M4中。測試連接克隆的測序確認(rèn)了所有文庫中適當(dāng)?shù)亩鄻有?，因而遵循了文庫的全?度連接和轉(zhuǎn)化。在500微升的總體積中進行連接，1000微克的消化的載體和插入物以 1 2(v i)的比例，使用T4DNA連接酶。在兩次注射，每100微升的電感受態(tài)大腸桿菌 TBI細胞1.0微升,轉(zhuǎn)化每個文庫,得到文庫大小1()7 1()8。噬菌體庫通過使用PEG的兩次沉來自未選擇的文庫的克隆被隨機選擇。在噬菌體文庫制備之后的第一輪選擇GLP-1受體的細胞外結(jié)構(gòu)域被用于淘選。100微升的噬菌體文庫與含有l(wèi)OOnM:受體 的2% Marvell PBS孵育。孵育在RT進行1小時,然后噬菌體與預(yù)先阻斷的(2% Marvell PBS，lh，RT)蛋白A dynabeads組合。在RT下在轉(zhuǎn)輪....t一小時孵育之后，珠子在King Fisher 中用0. 1 % Tween PBS洗滌8次，通過在500微升0. 1M甘氨酸pi! 2. 0中洗脫來回收特定噬 菌體。在用100微升1M Tris-CI pH 8. 0中和之后，噬菌體用于對數(shù)期大腸桿菌TG1細胞的 感染,37°C 45分鐘。在與胰蛋白酶的孵育(100ii g/mll小時4°C;1和2小時37。C 250rpm) 后進行DAT-X的測試選擇。文庫輸入輸出的滴定度和文庫大小在下表中示出 第一輪選擇對于所有的文庫產(chǎn)生了合理的輸出，因而輸出被擴增，噬菌體被用于 第二輪選擇。使用蛋白酶的DAT-X噬菌體展示文庫詵擇對每個文庫單獨地進行沒有蛋白酶處理的第--輪文庫選擇,來富集結(jié)合物。GLP-1 受體的細胞外結(jié)構(gòu)域的濃度是lOOnM，在所有隨后的選擇中保持這個濃度。在第一輪選擇之 后拯救的噬菌體的滴定度在lxio5 - lxl07(p/mi之間。接下來的選擇對取出的噬菌體進行。通過含有來自第一輪選擇的輸出的大腸桿菌 甘油的聯(lián)合培養(yǎng)來獲得噬菌體。另外在用胰蛋白酶選擇之前，噬菌體進行亞克隆，在AlbudAb序列中具有R108W 突變，因為在過去的蛋白酶選擇期間證實的是，當(dāng)在噬菌體上展示時,這個突變使得Vkappa AlbudAb克隆對胰蛋白酶處理更有抗性。這得到了預(yù)備用于第二輪選擇的兩個批次的噬菌 體，有或者沒有AlbudAb中的R108W突變。
在與受體孵言之前，在室溫下噬菌體用蛋白酶處理lh。第二輪選擇滴定度(0／m1)在卜表中示出。
來自每次選擇的噬菌體輸出(0 u g／m1—10 u g／m1)被擴增，用于第三輪選擇，使用相同的孵育條件。
第三輪選擇滴定度((p／m!)在卜表中示出。
在第二輪期間用lo u g／m1胰凝乳蛋白酶濃度處理的噬菌體的滴定度仍然以比先前用較低濃度處理的噬菌體以較小的程度降低。在第二輪期間用lo u g／m1胰蛋白酶濃度處理的噬菌體的滴定度是非常穩(wěn)定的。
在使用。一胰凝乳蛋白酶的第三輪之后擴增的噬菌體也用大腸桿菌菌株[t]32151的細胞溶胞產(chǎn)物(CL)和周質(zhì)提取物(PE)處理，來得到對細菌蛋白酶的穩(wěn)定性的了解。噬菌體與蛋白酶ll混合，在與受體孵言之前在搖動器中37℃孵育2小時。
對于所有的選擇輸出，包括對照的未修飾分子，滴定度方面的降低是非常小的 (低于10倍)，這可以表明，細胞溶胞產(chǎn)物和周質(zhì)提取物中的蛋白酶與純化的胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶相比嚴(yán)格度是較低的。因為克隆中的多樣性在第三輪選擇的輸出亞克隆到表達 載體中之后已經(jīng)降低了。DAT-X噬菌體展示文庫選擇輸出來自用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的第三輪選擇、在選擇過程期間用10 ti g/ml蛋 白酶濃度處理兩次的DAT-X文庫輸出被亞克隆到表達載體中。噬菌體載體DNA從選擇輸出 中分離(Mini Prep, Qiagen)，并用Ncol和NotI位點消化。并行地,表達載體通過兩步裂 解來制備。首先，它用Kpnl限制性內(nèi)切酶來消化,KpnI限制內(nèi)切酶在AlbudAb序列的內(nèi)側(cè) 切割。進行這個步驟來降低載體自身連接的概率。然后進行Ncol NotI位點的消化來誘導(dǎo) 連接位點。在每個消化步驟之后，載體使用PCR純化試劑盒，Qiagen來純化。在第二次純 化后，載體DNA還加載在2%瓊脂糖凝膠上,相應(yīng)于4699bp的條帶進行凝膠純化(Gel純化 試劑盒，Qiagen) 50ng的DNA與從使用胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶第三輪選擇的輸出....匕切下的插入物 6ng/l. 5ng，使用200u的T4DNA連接酶(NEB)在RT來連接lh。5ul的連接混合物用于根據(jù)廠家方案的25ul MachI化學(xué)感受態(tài)細胞 (Invitrogen)的轉(zhuǎn)化,并平板接種。第二天,使用2XTY培養(yǎng)基中的15%甘油,菌落從平板上 刮下，100微升的儲備物用于DNA分離(MiniPrep, Qiagen)。約150ng的載體DNA用于40ul BL2KDE3)化學(xué)感受態(tài)的大腸桿菌細胞(Invitrogen)的轉(zhuǎn)化。來自兩種輸出的87個菌落 使用QPix2XT機器人挑出到具有carbenicilin和消泡劑20496的1ml的TBonex培養(yǎng)基中， 在900rpm在潮濕空氣中在96深孔平板中培養(yǎng)63h (首先20h 37°C,隨后的小時30°C )。培 養(yǎng)物4600rpm旋轉(zhuǎn)40min，通過0. 22濾板過濾，在蛋白L CIM圓盤HPLC上純化。因而表達 了幾種蛋白酶抗性GLP-1變體肽。DOMlh-1.31-511的核苷酸序列在這個段落中列出。DOMlh-131-511 的核苷酸序列GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTCTCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CATGAGACGA TGGTGTGGGT CCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACAT ATTCCCCCGG TTGGTCAGGA TCCCTTCTACGCAGACTCCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTATAT
CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACAGCGGTAT ATTACTGTGC GCTGCTTCCTAAGAGGGGGC CTTGGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC
權(quán)利要求
從肽或多肽的集中選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方法，包括提供肽或多肽的集；在適合蛋白酶活性的條件下組合所述集和蛋白酶；以及回收具有期望的生物學(xué)活性的肽或多肽，從而選擇蛋白酶抗性肽或多肽，其中所述蛋白酶選自在痰、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液)、支氣管肺泡灌洗液、肺勻漿、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液或淚液中存在的蛋白酶。
2.從肽或多肽的集中選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方法,包括提供肽或多肽的集；在適合蛋白酶活性的條件下組合所述集和蛋白酶；以及回收具有期望的生物學(xué)活性的肽或多肽，從而選擇蛋白酶抗性肽或多肽，其中所述條件是⑴約1-0 μ g/ral到約3mg/ml蛋白酶，(ii)約20°C到約40°C和(iii) 至少約30分鐘。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述條件⑴是約10到約100μ g/ml蛋白酶。
4.權(quán)利要求2或3的方法,其中所述條件(ii)是約30到約37V。
5.權(quán)利要求2到4的任一項的方法,其中所述條件(iii)是至少約一小時。
6.權(quán)利要求2到5的任一項的方法,其中所述蛋白酶選自在痰、粘液(例如，胃粘液、鼻 粘液、支氣管粘液)、支氣管肺泡灌洗液、肺勻漿、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液或淚液中 存在的蛋白酶。
7.前述任一項權(quán)利要求的方法,其中所述蛋白酶包含以下的一種或更多種絲氨酸 蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶(例 如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、 leucozyme、胰酶、凝血酶、纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶(例如,組織蛋白酶G)、蛋白水解酶 (例如,蛋白水解酶1、蛋白水解酶2、蛋白水解酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋 白酶(例如,胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天 蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶、梭菌蛋白酶、actinidain, 疲蘿蛋白酶禾口 separase。
8.前述任一項權(quán)利要求的方法,其中所述蛋白酶是胰蛋白酶或彈性蛋白酶。
9.前述任一項權(quán)利要求的方法,其中所述蛋白酶是由生物學(xué)提取物、生物學(xué)勻漿或生 物制品提供的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述生物學(xué)提取物、生物學(xué)勻漿或生物制品選自由痰、粘 液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液)、支氣管肺泡灌洗液、肺勻漿、肺提取物、胰提取物、 胃液、唾液和淚液構(gòu)成的組。
11.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述期望的生物學(xué)活性是結(jié)合活性。
12.權(quán)利要求11的方法,其中所述結(jié)合活性是結(jié)合通用配體。
13.權(quán)利要求12的方法,其中所述通用配體是蛋白A、蛋白G或蛋白L。
14.權(quán)利要求11的方法,其中所述結(jié)合活性是特異性結(jié)合目標(biāo)配體。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述目標(biāo)配體選自由以F構(gòu)成的組ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養(yǎng)蛋白-1、CEA、CD40、CD40 配體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF 受體、ENA-78、嗜 酸細胞活化趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子_2、Exodus-2、FAP α、FGF-酸性、FGF-堿性、 成纖維細胞生長因子 10、FLT3配體、CXXXC趨化因子(CX3C)、 GDNF, G-CSF, GM-CSF，GF-β 1,人血清白蛋白、胰島素、IFN-γ , IGF-I, IGF-II，IL-I α，IL-I β , IL-I 受體、IL-1I 型受 體、IL-2，IL-3, IL-4, IL-5，IL-6，IL~1, IL_8(72a. a.)，IL_8(77a. a.)，IL-9，IL-10, IL-11， IL-12，IL-13,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18(IGIF)，抑制素 α、抑制素 β、IP-10、角質(zhì)形成細 胞生長因子-2 (KGF-2)、KGF、瘦蛋白、LIF、淋巴細胞趨化因子、繆勒管抑制物質(zhì)、單核細胞集 落抑制因子、單核細胞引誘蛋白、 M-CSF，MDC (67a. a.)， MDC(69a. a.)，MCP-1 (MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4, MDC(67a. a.)，MDC(69a. a.)，MIG, MIP-I α , MIP-I β , ΜΙΡ—3 α , ΜΙΡ—3 β , ΜΙΡ—4,骨髓祖代抑制因子一1 (MPIF—1)、MAP—2、 Neurturin、神經(jīng)生長因子、β -NGF, ΝΤ-3、ΝΤ-4、制瘤素 Μ、 PDGF-AA, PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1 α , SDFl β，SCF，SCGF,干細胞因子(SCF)、TARC，TGF-α ,TGF-β， TGF- β 2, TGF- β 3,腫瘤壞死因子(TNF)、TNF- α、TNF- β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1， TPO，VEGF，VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β，GRO- γ，HCCl, 1-309，HERl, HER 2，HER 3，HER 4， 血清白蛋白、vWF、淀粉樣蛋白(例如，淀粉樣蛋白《)、MMP12, PDKl, IgE, IL 13R α 1,丨丄-13Ra2, IL-15，IL-15R, IL-16，IL-1.7R, IL-17，IL-1.8, IL-18R, IL-23IL-23R, II-25, CD2, CD4, CDlla, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcERl, TGFb，CCL2, CCL18, CEA，CR8, CTGF，CXCL12 (SDF-I)，糜蛋白酶、FGF、弗林蛋白酶、內(nèi)皮縮血管肽-1、嗜酸細胞活化趨化因子(例如,嗜酸細 胞活化趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子-2、嗜酸細胞活化趨化因子-3)、GM-CSF, ICAM-1, I COS, IgE, IFNa, 1-309,整聯(lián)蛋白、L-選擇蛋白、MIF, MIP4, MDC, MCP-1，MMPs，嗜中性白細胞彈性蛋白酶，骨橋蛋白、0X-40，PARC, PD-1，RANTES, SCF, SDF-I, siglec8, TARC’ TGFb，凝血酶、Tim-1，TNF, TRANCE，類胰蛋白酶、VEGF，VLA-4’ VCAM, α 4β 7， CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, a!phavbeta6, alphavbetaS, cMET, CD8, vWF, 淀粉樣蛋白(例如,淀粉樣蛋白α)、MMP12、PDKl和IgE。
16.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述具有期望的生物學(xué)活性的肽或多肽通過淘 選來回收。
17.前述權(quán)利要求的任一項的方法,其中所述集包含展示系統(tǒng)。
18.權(quán)利要求17的方法,其中所述展示系統(tǒng)選自由細菌噬菌體展示、核糖體展示、乳液 區(qū)室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、細菌展示、在質(zhì)粒上展示和共價展示構(gòu)成的組。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述展示系統(tǒng)與核酸的編碼功能和由核酸編碼的肽 或多肽的功能性特征相關(guān)。
20.權(quán)利要求17、18或19的方法,其中所述展示系統(tǒng)包含可復(fù)制的遺傳包。
21.權(quán)利要求17到20的任一項的方法，其中所述展示系統(tǒng)包含細菌噬菌體展示。
22.權(quán)利要求21的方法,其中所述細菌噬菌體展示系統(tǒng)是多價的。
23.權(quán)利要求21的方法,其中所述細菌噬菌體選自由fd、M13、λ、MS2和T7構(gòu)成的組。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述肽或多肽作為pill融合蛋白來展示。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述肽或多肽位于pill的結(jié)構(gòu)域1的氨基-末端。
26.權(quán)利要求19的方法,進一步包括擴增編碼具有期望的生物學(xué)活性的肽或多肽的核酸。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述核酸通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 來擴增。
28.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述集是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的集。
29.權(quán)利要求28的方法,其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域是人類或人源化的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
31.權(quán)利要求28的方法,其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
32.權(quán)利要求31的方法,其中所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域是人類或人源化的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
33.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，用于從所述肽或多肽的集選擇以高親和力結(jié)合 目標(biāo)配體的肽或多肽。
34.前述任一項權(quán)利要求的方法,其中所述蛋白酶在約IOiWml下使用，并且所述組 合的集和蛋白酶在約37°C孵育至少約一小時。
35.任一前述權(quán)利要求的方法，其中每種所述多肽是結(jié)合目標(biāo)的免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域(dAb)；所述集通過展示免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的集的噬菌體展示系統(tǒng)來提供,在 所述組合步驟中所述噬菌體展示系統(tǒng)與選自由彈性蛋白酶、Ieucozyme和胰蛋白酶構(gòu)成的組的蛋白酶 在適合于蛋白酶活性的條件下組合；以及在所述回收步驟中，展示了包含結(jié)合所述目標(biāo)配 體的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽的噬菌體被回收。
36.產(chǎn)生蛋白酶抗性肽或多肽的集的方法,包括進行前述任--項權(quán)利要求的方法,其中 在所述回收步驟中，具有期望的生物學(xué)活性的復(fù)數(shù)種肽或多肽被回收，從而產(chǎn)生蛋白酶抗 性肽或多肽的集。
37.權(quán)利要求36的方法,其中所述蛋白酶抗性肽或多肽的集是首次用于實驗的集。
38.權(quán)利要求36或37的方法,進一步包括在適合于第二蛋白酶的活性的條件下組合第 二蛋白酶與所述蛋白酶抗性肽或多肽的集；以及回收具有期望的生物學(xué)活性的至少一種肽 或多肽,從而選擇對所述第二蛋白酶有抗性的至少一種肽或多肽。
39.權(quán)利要求38的方法,其中所述第二蛋白酶是在權(quán)利要求6到10的任一項中所定義的。
40.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中在所述集中蛋白酶與肽或多肽的比例(摩爾/摩 爾)是8，000到80，000蛋白酶肽或多肽。
41.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中在所述集中蛋白酶與肽或多肽的比例(重量/重 量)是1，600到160，000蛋白酶肽或多肽。
42.通過前述權(quán)利要求的任一項的方法可選擇的或選擇的分離的蛋白酶抗性肽或多肽。
43.通過權(quán)利要求1到41的任一項的方法可選擇的或選擇的分離的蛋白酶抗性免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
44.分離的肺部目標(biāo)拮抗劑,包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，所述免疫球蛋白單可變結(jié) 構(gòu)域當(dāng)在(1)約K) μ g/ml到約8mg/m!蛋白酶，(ii)約20°C到約40°C和(iii)至少約80 分鐘的條件下(例如，在100 μ g/ml的蛋白酶在37°C至少一小時的條件下)，與所述蛋白酶 孵育時對選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶和Ieucozyme的一種或更多種蛋白酶有抗性，所述分 離的肺部目標(biāo)拮抗劑用于施用給患者來治療和/或預(yù)防肺部疾病或狀況。
45.權(quán)利要求44的拮抗劑,用于通過吸入或鼻內(nèi)地向患者施用。
46.分離的GI道目標(biāo)拮抗劑,包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域,所述免疫球蛋白單可變 結(jié)構(gòu)域當(dāng)在⑴約10 μ g/ml到約3mg/ml蛋白酶，(ii)約20°C到約40°C和(iii)至少約 30分鐘的條件下(例如，在100 μ g/ml的蛋白酶在37°C至少一小時的條件下)，與所述蛋白 酶孵育時對選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶和leucozyme的一種或更多種蛋白酶有抗性,所述 分離的GI道目標(biāo)拮抗劑用于施用 給患者來治療和/或預(yù)防GI道疾病或狀況。
47.權(quán)利要求46的拮抗劑，用于口服、舌下地或直腸地向患者施用。
48.權(quán)利要求44到47的任一項的拮抗劑，其中所述拮抗劑拮抗TNFα。
49.權(quán)利要求48的拮抗劑,其中所述可變結(jié)構(gòu)域包含TNFRl的結(jié)合位點。
50.權(quán)利要求44到47的任一項的拮抗劑,其中所述拮抗劑拮抗TNFRl、VEGF或IL-IRl。
51.權(quán)利要求50的拮抗劑，其中所述可變結(jié)構(gòu)域分別包含TNFR1、VEGF或IL-IRl的結(jié) 合位點
52.分離的肺部目標(biāo)拮抗劑在制造藥物中的用途,所述分離的肺部目標(biāo)拮抗劑包含免 疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域當(dāng)在(i)約10 μ g/ml到約3mg/ml 蛋白酶，( )約20°C到約40°C和(iii)至少約30分鐘的條件下(例如，在100 μ g/ml的 蛋白酶在370C至少一小時的條件下)，與所述蛋白酶孵育時對選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶 和leucozyme的一種或更多種蛋白酶有抗性,所述藥物用于施用給患者來治療和/或預(yù)防 肺部疾病或狀況。
53.權(quán)利要求52的用途，其中所述施用是吸入或鼻內(nèi)地施用給患者。
54.分離的GI道目標(biāo)拮抗劑在制造藥物中的用途，所述分離的GI道目標(biāo)拮抗劑包含 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域,所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域當(dāng)在⑴約10 μ g/ral到約3mg/ml 蛋白酶，(ii)約20°C到約40°C和(iii)至少約30分鐘的條件下(例如,在100 μ g/ml的 蛋白酶在37Γ至少一小時的條件下)，與所述蛋白酶孵育時對選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶 和leucozyme的一種或更多種蛋白酶有抗性,所述藥物用于施用給患者來治療和/或預(yù)防 GI道疾病或狀況。
55.權(quán)利要求54的用途,其中所述施用是口服、舌下地或直腸地施用給患者。
56.權(quán)利要求52到54的任一項的用途，其中所述拮抗劑拮抗TNFa。
57.權(quán)利要求56的用途，其中所述可變結(jié)構(gòu)域包含TNFRl的結(jié)合位點。
58.權(quán)利要求52到54的任一項的用途，其中所述拮抗劑拮抗TNFRl、VEGF或IL-1R1。
59.權(quán)利要求58的拮抗劑,其中所述可變結(jié)構(gòu)域分別包含TNFR1、VEGF或IL-IRl的結(jié) 合位點。
60.編碼權(quán)利要求42或43的蛋白酶抗性肽、多肽或可變結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求44到51的任--項的拮抗劑的分離的核酸。
61.編碼權(quán)利要求42或43的蛋白酶抗性肽、多肽或可變結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求44到51的 任一項的拮抗劑的重組核酸。
62.包含權(quán)利要求60或61的核酸的載體。
63.包含權(quán)利要求62的核酸的宿主細胞。
64.生產(chǎn)通過權(quán)利要求1到41的任一項的方法可選擇或選擇的蛋白酶抗性肽或多肽、 或權(quán)利要求44到51的任一項的拮抗劑的方法,包括將含有編碼所述蛋白酶抗性肽或多肽 或拮抗劑的重組核酸的宿主細胞維持在適合于表達的條件下,從而產(chǎn)生蛋白酶抗性肽或多 肽或拮抗劑。
65.用于藥物中的通過權(quán)利要求1到41的任一項的方法可選擇或選擇的蛋白酶抗性肽 或多肽或權(quán)利要求43的可變結(jié)構(gòu)域。
66.用于制造用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物的通過權(quán)利要求1到41的任一項的方法 可選擇或選擇的蛋白酶抗性肽或多肽或權(quán)利要求43的可變結(jié)構(gòu)域。
67.治療疾病的方法，包括向需 其的受試者施用有效量的、通過權(quán)利要求1到41的任 一項的方法可選擇或選擇的蛋白酶抗性肽或多肽或可變結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及從肽和多肽的文庫或集(例如，展示系統(tǒng))中選擇、分離和/或回收對蛋白酶的降解有抗性的肽或多肽的方法，所述蛋白酶例如在人類的GI道或肺部組織中存在的蛋白酶。通常，該方法包括提供肽或多肽的文庫或集，在適于蛋白酶活性的條件下將文庫或集與蛋白酶組合，并選擇、分離和/或回收對蛋白酶降解有抗性的并具有期望的生物活性的肽或多肽。所選擇的肽和多肽具有作為治療劑的實用性，例如，用于治療人類GI道或肺部組織的疾病或狀況。
文檔編號C07K16/22GK101848935SQ200880102138
公開日2010年9月29日 申請日期2008年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
發(fā)明者C·埃內(nèi)弗, I·湯林森, L·耶斯珀斯, M·普佩卡 申請人:杜門蒂斯有限公司