專利名稱：蛋白酶檢測的制作方法
蛋白酶檢測本發(fā)明涉及含有發(fā)色氨基酸的多肽，摻入了這種多肽的產物，以及制造這種多肽 的方法。本發(fā)明還涉及檢測蛋白酶的方法。在本技術領域中已知有大量反應試劑或化合物可用于測量蛋白水解作用。其中 包括合成修飾的多肽底物，它們在被蛋白水解作用切開時，釋放出指示劑基團或不穩(wěn)定分 子，例如已經在其c-末端被對硝基苯胺或萘胺修飾的合成多肽。例如，EP-A-0864864公開 了使用 Dnp-Pro- 3 -環(huán)己基-Ala-Gly-Cys (Mu) -His-Ala-Lys (N-Me-Abz) -NH2 檢測蛋白酶， Dnp-Pro- 3 -環(huán)己基-Ala-Gly-Cys (Mu) -His-Ala-Lys (N-Me-Abz) _NH2 是一種基于熒光的肽 而不是發(fā)色的肽。Plapinger等，J.Org.Chem 1965，30，1781報道了被胰蛋白酶切開后發(fā)色 的物質，它們是精氨酸的衍生物。在對硝基苯胺從這樣的肽底物的C-末端切下并釋放到溶液中后，可以測量到UV 吸收值的增加。在肽底物含有萘胺的情況下，釋放的發(fā)色部分可以被附加的報告分子捕獲， 產生可見的顏色變化。合成的胰蛋白酶底物Na-苯甲?；?DL-精氨酸萘胺(BANA) 常用于蛋白水解活性的分析測定，以例如幫助診斷牙周疾病。本技術領域已知的發(fā)色蛋白酶底物，例如BANA，它們的相應發(fā)色部分位于多肽的 C-末端(除了硫代酯肽(Thiopeptolides)之外，參見下文)。這種發(fā)色蛋白酶底物的問題 在于，發(fā)色部分位于多肽的C-末端，由于缺乏側翼氨基酸，多肽的格式受到限制，從而限制 了蛋白酶特異性。本技術領域已知的發(fā)色肽還具有不良的水溶解性，并且較長多肽的合成 為合成過程增加了復雜性。這導致多肽配制困難，并增加了在商業(yè)化規(guī)模上多肽擴大生產 的成本。此外，C-末端發(fā)色團不能以直接方式連接到固相表面上，這限制了使用這些多肽 在診斷中可視化蛋白水解作用的方法的可能應用。硫代酯肽(Thiopeptolides),正如在Weingarten 等，Biochem，1985，24， 6730-6734中描述的，具有位于肽序列內部的發(fā)色部分，但是不使用酰胺鍵。基于硫代酯肽 的肽底物的問題在于，由于它們在蛋白水解切割位點處不含通常的酰胺鍵，它們不能提供 最大的底物識別或轉換(turnover)。本發(fā)明試圖緩解上述的一個或多個問題。根據本發(fā)明的一個方面，提供了含有發(fā)色氨基酸的多肽，發(fā)色氨基酸在其N和C端 兩側帶有至少一個氨基酸。優(yōu)選情況下，發(fā)色氨基酸的胺基具有低于5的pKa，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反應。有利情況下，多肽包含靶蛋白酶的靶序列，該靶蛋白酶能夠切開包含發(fā)色氨基酸 的氨基的肽鍵。根據本發(fā)明，還提供了含有發(fā)色氨基酸的多肽，其中發(fā)色氨基酸在其N和C端兩 側帶有至少一個氨基酸，發(fā)色氨基酸的胺基具有低于5的pKa，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反 應，并且其中多肽包含靶蛋白酶的靶序列，該靶蛋白酶能夠切開包含發(fā)色氨基酸的氨基的 肽鍵。
方便的是，發(fā)色氨基酸含有直接鍵合到發(fā)色氨基酸的氨基的氮原子上的芳族環(huán)部 分。優(yōu)選情況下，發(fā)色氨基酸與天然氨基酸等排性(isosterically)匹配。方便的是，靶序列含有發(fā)色氨基酸。優(yōu)選情況下，當靶序列被切開時，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反應，給出可檢測信號。有利情況下，共軛醛是取代的苯甲醛或肉桂醛或反，反-苯基戊二烯醛。優(yōu)選情況下，共軛醛是DMAC或DMAB。方便的是，芳族部分是苯基或萘基部分。有利情況下，多肽是線性多肽。優(yōu)選情況下，多肽在多肽的C或N末端處或附近固定化在固相表面上。有利情況下，多肽共價結合到固相表面上。方便的是，多肽在多肽的C或N末端處或附近還含有第一個和第二個結合部分。優(yōu)選情況下，多肽的長度在2到100個氨基酸之間，更優(yōu)選在3到40個氨基酸之 間。根據本發(fā)明的另一個方面，提供了在樣品中檢測蛋白酶的方法，包括下列步驟(i)將樣品暴露于前述權利要求任一項的多肽中，允許蛋白酶切開多肽并產生片 段，在該片段的N-末端展現發(fā)色氨基酸；(ii)將共軛醛與含有發(fā)色氨基酸的片段反應，產生有色加成物；以及(iii)檢測有色加成物，有色加成物的存在表明樣品中存在蛋白酶。方便的是，步驟(i)包括用蛋白酶切開多肽的含有發(fā)色氨基酸的氨基的肽鍵。根據本發(fā)明的另一個方面，提供了本發(fā)明的制造方法，包括下列步驟i.合成含有一個發(fā)色氨基酸的氨基酸二聚體；以及ii.在多肽合成過程中將二聚體摻入到多肽的剩余部分中。方便的是，步驟(ii)包含將二聚體與新生寡肽相連。根據本發(fā)明的另一個方面，提供了用于在樣品中檢測蛋白酶的產品，包含本發(fā)明的多肽；以及其上可以固定化多肽的固相支持物。優(yōu)選情況下，產品還包含共軛醛。有利情況下，固相支持物包含第一個和第二個鉸鏈連接的片層，多肽固定化在第 一個片層上，共軛醛位于第二個片層上，使得將片層折疊到一起時可以將材料從第一個片 層轉移到第二個片層上。方便的是，產品還包含可插入到固定化在第一個片層上的多肽與位于第二個片層 上的共軛醛之間的膜，膜阻止了尺寸大于閾值尺寸的物質通過膜從第一個片層到達第二個 片層，多肽可以被蛋白酶切開以釋放含有發(fā)色氨基酸的片段，片段小于閾值尺寸?；蛘?，固相支持物包含色譜介質。有利情況下，色譜介質還包含片段結合分子，能夠結合含有在被蛋白酶切開后可 以從多肽釋放的發(fā)色氨基酸的多肽片段，多肽可以固定化在色譜介質上的標記區(qū)域處，片 段結合分子固定化在色譜介質上的可視化區(qū)域處。
方便的是，多肽可以被切開成第一個和第二個片段，第一個片段含有發(fā)色氨基酸， 其中產品還包含可以與第二個片段結合的可檢測標記物；以及固定化在色譜介質中或其 上的第一種和第二種捕獲分子，第一種捕獲分子能夠結合第一個片段，第二種捕獲分子能 夠結合第二個片段或可檢測標記物。優(yōu)選情況下，標記物包含能夠結合第二個片段的結合成分。有利情況下，色譜介質包括測試條?；蛘撸V介質包括多孔材料柱。根據本發(fā)明的另一個方面，提供了合成的多肽，含有大量原料氨基酸和至少一個 與天然氨基酸等排性匹配的發(fā)色氨基酸。根據本發(fā)明的另一個方面，提供了本發(fā)明的合成多肽在檢測樣品中的蛋白酶中的應用。將發(fā)色部分包埋在肽序列中，降低了疏水性對合成和使用的影響。因為本發(fā)明的 發(fā)色團位于肽序列中，因此肽的C和N末端是游離的，可用于本技術領域的專業(yè)人員熟知的 標準偶聯化學。本說明書中的“發(fā)色氨基酸”是指能夠改變顏色的氨基酸分子(含有氨基和羧 基)。更具體來說，當它在肽底物中位于蛋白酶切割位點的P1’位置，經蛋白水解作用釋放 并隨后通過共價化學與第二種分子發(fā)生反應時，它可以形成可以在400到900nm之間檢測 的有色加成物。本說明書中的“靶蛋白酶”被定義為識別并切開發(fā)色多肽上的靶區(qū)域的蛋白酶，其 中靶區(qū)域在切割位點的P1’位置上包含發(fā)色氨基酸。“天然氨基酸”是指任何一種下述氨基酸丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸， 半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨 酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，色氨酸和纈氨酸。本說明書中的“側翼”氨基酸是連接到至少一個其他氨基酸上的氨基酸，其中該連 接通過一個氨基酸的氨基末端與另一個氨基酸的羧基之間的肽鍵進行。本說明書中的“等排性”匹配與天然氨基酸和相應的發(fā)色氨基酸相關。它意味著 匹配的取代的發(fā)色氨基酸與它所代替的天然氨基酸具有相似的空間占有率。如果對含有天 然氨基酸的肽序列特異的蛋白酶也能夠切開其中天然氨基酸被發(fā)色氨基酸取代的多肽，那 么發(fā)色氨基酸可以被視為與天然氨基酸等排性匹配。

圖1顯示了本發(fā)明的多肽與蛋白酶的反應。為了簡化，序列Ala-[pABA]-Gly被用 作與胰彈性蛋白酶起反應的例子，其中PABA代替了丙氨酸。圖2顯示了用于本發(fā)明的實施方案的發(fā)色氨基酸的選擇。圖3顯示了根據本發(fā)明的一個實施方案，用于檢測蛋白酶的產品的透視圖。圖4顯示了根據本發(fā)明的另一個實施方案，用于檢測蛋白酶的產品的橫截面圖。圖5顯示了根據本發(fā)明的另一個實施方案，用于檢測蛋白酶的產品的頂視圖。圖6是流程圖，顯示了根據本發(fā)明的另一個實施方案合成多肽的方法。序列 Val-Arg-[p-ABA]-Gly被用作在固相(用圓圈描繪的樹脂)上合成的例子。分子合成中的 關鍵反應是步驟iii)。利用標準的肽化學，使用輸入氨基酸的活化的酯，不容易實現該反 應。但是，使用輸入氨基酸的?；然铮@著改進了反應化學。
圖7(A)顯示了根據本發(fā)明的一個實施方案使用用于檢測蛋白酶的產品和獲得的 陽性發(fā)色反應(陽性蛋白酶樣品)的結果的圖片。(B)是在圖3描述的風格的裝置中，使 用陽性[上方線]和陰性[下方線]樣品時從電子讀數器獲得的數據的圖形表示。(C)是 與可商購發(fā)色底物苯甲?；鵢精氨酰-萘胺(BANA)相比，同樣的陽性蛋白酶樣品的圖形表 示。在相同條件下，與BANA相比，發(fā)色底物顯示出增加的酶轉換和顏色產生。圖8A顯示了平板分析測定結果，比較了作為彈性蛋白酶底物的AAPV-[pABA]_GGC 和AAPV-[ANA]-GGC。圖8B顯示了縱向流分析測定的結果，比較了作為彈性蛋白酶底物的 AAPV-[pABA]-GGC和 AAPV-[ANA]-GGC。圖9顯示了發(fā)色氨基酸ANA(2-氨基萘甲酸)和pABA(對氨基苯甲酸)的結構比 較。圖10A顯示了 AAPV-[pABA]_GGC的電子濺射質譜圖；預計質量是692. 78，測量到 的質量是692. 2。圖10B顯示了 AAPC-[ANA]-GGC的電子濺射質譜圖；預計質量是742. 84， 測量到的質量是742.4。圖 11 顯示了 Fmoc-Val-pABA-OH 的屮 NMR 譜圖。圖12顯示了使用Fmoc-Val-pABA-GGC合成的AAPV- [pABA] -GGC的電子濺射質譜 圖；預計質量是692. 78，測量到的質量是692. 3。在本發(fā)明的第一個實施方案中，提供了檢測樣品中的蛋白酶例如木瓜蛋白酶或胰 蛋白酶的方法。方法包括提供接受器，其中放置有可切開的多肽的溶液?？汕虚_的多肽從 N-端到C-端包含序列丙氨酸-[對氨基苯甲酰基]-甘氨酸。也就是說，多肽包含在其N和 C端側翼帶有兩個其他氨基酸(丙氨酸和甘氨酸)的發(fā)色氨基酸(對氨基苯甲酸)。例如 這種包含對氨基苯甲酸的多肽，在被切開并與第二種試劑反應之前，是無色的。在本實施方 案中使用的第二種試劑是共軛醛二甲基_氨基-肉桂醛(DMAC)。將樣品放置在小管中，與多肽混合足夠長的時間，以便靶酶切開肽底物，典型情況 下少于10分鐘。在本實施例中，由于所選的氨基酸序列，蛋白酶在不到3分鐘內快速切開 了多肽序列。結果，蛋白酶在丙氨酸殘基的-CO-部分與對氨基苯甲酸殘基的-NH-基團之 間的肽鍵處切開多肽，如圖1中所示。該切割導致釋放了兩個分子；第一個分子是游離的丙 氨酸殘基，第二個分子包含與甘氨酸殘基相連的對氨基苯甲酸殘基。第二個分子是發(fā)色中 間體。在方法的下一個步驟中，向小管中加入DMAC并混合。如圖1中所示，DMAC與發(fā)色 中間體在酸性條件下反應，形成了有色的加成物。跟具體來說，在陽性蛋白酶樣品中，新產 生的發(fā)色中間體與DMAC反應，產生了紅色。相反，在陰性蛋白酶樣品中，底物保持完整，屏 蔽了 pABA基團，使它不與輸入的DMAC反應。DMAC分子本身在微酸性條件下是黃色化合物， 在不存在暴露的pABA的情況下產生黃色。因此，本發(fā)明的本實施方案的方法，導致對樣品中蛋白酶的存在(紅色)或不存在 (黃色)作出響應而產生顏色。根據圖1中示例的實施方案，多肽中發(fā)色氨基酸的氨基一側上的肽鍵被靶蛋白酶 水解，因此暴露出發(fā)色氨基酸的胺基。在本實施方案中，共軛醛是DMAC，但是在其他實施方 案中可以使用可選的醛，例如取代的苯甲醛和肉桂醛，例如二甲基-氨基-苯甲醛(DMAB)。以下，將描述符合本發(fā)明的實施方案的多肽的合成。發(fā)色多肽通過常規(guī)的Fmoc化學在本技術領域的專業(yè)人員熟悉的固相上合成。在某些實施方案中，每個氨基酸連接 通過使用輸入氨基酸的活化的酯來實現。在其他實施方案中，使用?；然飳⑤斎氚?基酸連接到發(fā)色殘基上。通過在肽合成之前合成含有P1氨基酸和發(fā)色團(P1’)的構件 (building block)，并將整個構件作為單個部分導入，可以獲得效率的提高。這種構件的例 子是Fmoc-丙氨酰-對氨基苯甲酸，可以以與氨基酸同樣的方式添加到新生多肽上。多肽的 長度典型地在2到100個殘基的范圍內。使用這種方法可以容易地合成不同長度的發(fā)色多 肽，這種制造方法的自動化也容易實現。這對于大規(guī)模生產用于商業(yè)化應用來說是有利的。 此外，本發(fā)明的發(fā)色多肽沒有已知的致癌性質，因此在大規(guī)模制造中不存在安全性問題。在第一個實施方案中，多肽包含發(fā)色氨基酸對氨基苯甲酸。但是，在可選實施方案 中，使用了不同的發(fā)色氨基酸，例如在圖2中顯示的之一。這些發(fā)色氨基酸含有芳族部分 (例如苯基或萘基)或其他雜環(huán)類似物，并且芳香環(huán)部分接近發(fā)色氨基酸的氨基(即它是苯 胺)。但是，應該理解，在本發(fā)明的其他實施方案中，提供了不含芳香環(huán)部分的發(fā)色酸。重要 的是，發(fā)色氨基酸的胺基具有明顯低于(例如小于5)多肽中存在的任何其他氨基酸(氨基 末端或側鏈)的pKa。通過這種方式，在低pH條件下，發(fā)色胺至少部分去質子化，而結構中 存在的其他胺事實上是完全質子化的。這使得與共軛醛的反應主要發(fā)生在發(fā)色氨基酸上。 當然，對于發(fā)色酸來說，還必需使空間位阻不會阻止與共軛醛的相互作用。理想情況下，在多肽中使用的發(fā)色氨基酸與天然氨基酸等排性匹配，以便盡可能 接近地模擬靶蛋白酶的底物結構。因此，合成了具有個體靶蛋白酶特異性靶區(qū)域的發(fā)色多 肽。發(fā)色氨基酸可以位于多肽中的任何位置，前提是它不位于氨基酸的C-末端。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽被摻入到用于檢測樣品中的蛋白酶的產品 中，該產品采用小冊子(booklet)的形式。適合的這種小冊子公開在PCT申請No.PCT/ GB2007/000643中，該申請在此引為參考。參考圖3，現在將描述符合本實施方案的小冊子 1。小冊子包含平面基材例如紙板的第一和第二個片層2、3，通過鉸鏈4相連。在第一個片 層中央，在吸附性襯墊5的頂部提供了薄的反應薄膜25。反應薄膜25浸有發(fā)色多肽并可以 由PVA制成。在第二個片層3的中央，提供了孔隙6，它與反應薄膜25和吸附性襯墊5對 齊?？紫?被可視化薄膜7覆蓋，使得當第一和第二個片層2、3彼此壓在一起時可視化薄 膜7位于孔隙6與反應薄膜25之間?？梢暬∧そ蠨MAC和HC1?？蛇x地，反應薄膜25 和吸附性襯墊5在使用前用可移除薄膜(未顯示)覆蓋，以便反應薄膜25和吸附性襯墊5 保持密封與環(huán)境隔離。在使用中，揭去覆蓋反應薄膜25和吸附性襯墊5的任何可移除薄膜，將懷疑含有 蛋白酶的樣品沉積在反應薄膜25上并吸入吸附性襯墊5。如果樣品中存在蛋白酶，那么蛋 白酶切開發(fā)色多肽，釋放出發(fā)色中間體，正如在第一個實施方案中已描述的。然后將小冊子 1的第一和第二個片層2、3壓到一起，使得反應薄膜25上的成分與可視化薄膜7、更具體來 說DMAC相接觸。因此，某些發(fā)色中間體從反應薄膜25和吸附性襯墊5傳遞到可視化薄膜7，在那里 它與DMAC反應形成了有色加成物。正如前面描述的，有色加成物顏色為紅色，小冊子1的 用戶可以通過孔隙6觀察到它?；蛘?，如果樣品不含能夠切開發(fā)色多肽的蛋白酶，那么不形成發(fā)色中間體，發(fā)色多 肽保持黃色的顏色。因此，可視化薄膜也保持其顏色或變成黃色。
在本實施方案的變體中，提供了膜，它覆蓋住可視化薄膜，不允許高于某個閾值尺 寸的物質通過它。閾值的選擇使得樣品中任何天然具有顏色的物質太大而不能通過膜，而 發(fā)色中間體小得足以通過膜，因此可以與與可視化薄膜、更具體來說是其上的DMAC相接 觸?，F在參考圖4，將描述本發(fā)明的另一個實施方案。在本實施方案中，本發(fā)明的多肽 被摻入到用于檢測蛋白酶的產品中，該產品采用縱向流生化測定的形式。檢測裝置8包含 接受器9，它具有上層部分10，在其頂端具有開口 11，在其底部具有漏斗12，連接到頸部13 上。頸部13由透明材料例如有機玻璃(perspex)或玻璃制成，通往倒置的漏斗14，漏斗14 反過來位于下層部分15的頂部。頸部13圍住了基質16，基質16中固定化有大量本發(fā)明 的發(fā)色多肽。例如，在某些實施方案中，基質16含有大量顆粒，發(fā)色多肽在其C-末端處或 附近使用酰胺鍵或通過巰基相互作用(形成硫醚)共價鍵合到顆粒上。在這種情況下，“附 近”意味著C-末端的10或20個氨基酸殘基之內。在使用中，通過接受器9的上層部分10的開口端11加入懷疑含有蛋白酶的樣品， 使得它流入漏斗12，并緩慢釋放到基質16中。樣品通過重力和毛細作用以恒定速率通過基 質16。樣品中的蛋白酶在發(fā)色氨基酸的-NH-部分與在N-端方向上緊鄰的氨基酸的-CO-部 分之間的肽鍵處，切開基質16中的發(fā)色多肽。因此，釋放出發(fā)色多肽的N-端片段，而發(fā)色 中間體保持固定化在基質16中。任選地，使用緩沖液將樣品洗過，以便確保所有N-端片段 都被洗過基質16，進入接受器9中的下層部分15中。然后，將裝有包含DMAC的緩沖液的容器(未顯示)放置在接受器9的上層部分10 的開口端11上，并將其下端刺穿，以便將緩沖液釋放到接受器9的漏斗12中。含有DMAC 的緩沖液流過基質16，在那里它與發(fā)色中間體相接觸，與其反應形成有色加成物。任何過量 的DMAC流過基質16，進入接受器9的下層部分15。正如前面已經解釋的，有色加成物顏色 為紅色，因此樣品中存在蛋白酶將導致基質16變紅。這可以通過頸部13觀察到?；蛘?，如果樣品不含能夠在靶序列處切開發(fā)色肽的蛋白酶，那么基質16中的發(fā)色 肽保持未切開，因而沒有發(fā)色中間體用于與DMAC反應。DMAC顏色為黃色，有一部分通過非 特異性吸附保留在基質16中。因此對蛋白酶陰性樣品作出反應，基質16顏色變?yōu)辄S色。已經發(fā)現，在發(fā)色多肽合成過程中，天然氨基酸與發(fā)色氨基酸的-NH2_部分的酰胺 連接反應是合成的相對低效的部分。因此，合成反應經常產生一部分不完整的多肽，其中沒 有氨基酸連接到發(fā)色氨基酸的N-端。如果這種不完整多肽的比例明顯，那么可能導致假陽 性結果，因為不完整多肽具有與發(fā)色中間體相同的結構，并與完整的多肽一起結合到基質 16上。因此，不完整多肽將與DMAC反應，即使在樣品中不存在蛋白酶的情況下也產生顏色 變化。因此，在某些可選實施方案中，發(fā)色多肽通過它們的N-末端固定化(即共價鍵合) 到基質16上。通過這種方式，任何不完整多肽將不與基質結合，因為它們缺少用于連接到 基質16上的N-末端氨基酸。在這樣的實施方案中，當施加含有活性蛋白酶的樣品時，發(fā)色 中間體從基質16上釋放，并在基質16下方提供吸附性集液器(例如棉塞)，以便捕獲釋放 的發(fā)色中間體，并顯示顏色變化。在本發(fā)明的另一個實施方案中，發(fā)色多肽在兩個末端各包含第一和第二個結合部 分。這種多肽的合成的例子提供在實施例2中。在該具體實施方案中，生物素連接到多肽 的C-末端，熒光素連接到N-末端上。發(fā)色多肽用于包含側向流的雙功能配體捕獲蛋白酶檢測分析中。側向流分析測定的進一步詳細情況，提供在PCT申請NO.PCT/GB2007/000637 和GB0716492.4中，這些申請在此引為參考。參考圖5，側向流裝置17包含硝酸纖維素條 18，它具有上游末端22和下游末端23。靠近上游末端22置有由吸附性材料制成的樣品接 受區(qū)19。進一步朝向下游末端23有第一個可視化區(qū)20。再進一步朝向下游末端23是第 二個可視化區(qū)21。第一個可視化區(qū)20包含大量固定化在條18表面上的多肽結合分子。每 個多肽結合分子能夠結合到發(fā)色多肽的C-末端上。因此，在該具體實施方案中，第一種結 合分子是鏈親和素，可以與多肽C-末端上的生物素結合。第二個可視化區(qū)21包含大量固 定化在條18表面上的抗小鼠抗體。在使用時，將懷疑含有蛋白酶的樣品與上面描述的大量發(fā)色多肽混合。允許蛋白 酶切開多肽，釋放出對應于多肽的C-末端的發(fā)色中間體，以及對應于多肽的N-末端的片 段。然后向混合物加入與連接到N-末端片段上的熒光素基團結合的小鼠抗FITC-金抗體。 將樣品混合物放置在樣品接受區(qū)19上。然后樣品混合物由于毛細作用沿著硝酸纖維素條 18的長度吸附，以箭頭24的方向朝向下游末端23。因此，它通過第一個可視化區(qū)20，然后 通過第二個可視化區(qū)21。當樣品混合物通過第一個可視化區(qū)20時，生物素標簽與鏈親和素結合，將發(fā)色中 間體固定化在第一個可視化區(qū)20上。發(fā)色中間體保持與第一個可視化區(qū)結合，而N-末端片 段進一步沿著硝酸纖維素條20吸附到第二個可視化區(qū)21?？剐∈罂贵w與小鼠抗FITC-金 抗體結合，從而將N-末端片段固定化在第二個可視化區(qū)21處。然后，將DMAC添加到樣品接受區(qū)19，它沿著條以箭頭24的方向吸附。當DMAC到 達第一個可視化區(qū)時，它與固定化的發(fā)色中間體反應，形成了紅色加成物。此外，與抗FITC 抗體結合的金顆粒，由于它們在硝酸纖維素條18上的第二個檢測區(qū)21處形成可見的線，可 以被觀察到?；蛘?，如果樣品中不存在蛋白酶，那么當整個多肽沿著硝酸纖維素條18吸附時， 它被固定化在第一個檢測區(qū)處。隨后，當DMAC被加入到樣品接受區(qū)19時，它沿著硝酸纖 維素條18吸附，但是因為發(fā)色氨基酸沒有暴露在多肽上，DMAC沒有反應地通過第一個檢測 區(qū)。因此，在第一個檢測區(qū)20處沒有顏色形成(除了任何殘留的DMAC之外，它的顏色是黃 色)，此外，金顆粒濃縮在第一個檢測區(qū)20處。因此，通過在第一個檢測區(qū)20處出現由金顆 粒形成的可見的線而不是紅色，并且在第二個檢測區(qū)21不出現可見的線，可以表明樣品中 不存在有功能的蛋白酶。因此，本實施方案能夠進行兩波反應性檢測，一次使用DMAC，另一次使用金顆粒檢 測。
實施例實施例l-Val-Arg-「pABAl_Gly 的合成參考圖6，現在將描述Val-Arg-[pABA]_Gly的合成。肽合成在固相上(WangResin Merck Biosciences)使用 Fmoc 化學方 法進行(((Fmoc 固相合成實用方法〉〉(Fmoc solid phase synthesis-apractical approach. )2000Chan，WC和White，PD Oxford UniversityPress)。在典型的合成中，將50mg 樹脂(載量0.91mmol/g)在20 y m過濾柱(Kinesis)中，在二甲基甲酰胺(DMF) (2ml)中溶脹1小時。將樹脂用DMF進一步清洗(2x2ml)，在真空下排流至干燥。第一個氨基酸的連接 使用溶解在2ml無水DMF中的0. 23mmol PYB0P (苯并三唑基-氧基三吡咯烷基磷鐺六 氟磷酸酯)和0. 23mmol H0BT(羥基苯并三唑)和0. 23mmol保護的甘氨酸殘基來進行。向 溶液加入0.46mmol DIPEA( 二異丙基乙胺)，然后分配到樹脂中。將樹脂漿液在室溫攪拌 90分鐘，然后在真空下排液并用DMF清洗(2x2ml)。進行了重復反應，以確保完全覆蓋樹脂 的反應性位點。在用DMF(3x2ml)、(二氯甲烷)DCM(3x2ml)清洗并用DMF(2ml)再清洗一次 后，通過加入20%哌啶在DMF中的溶液(5ml)并攪拌5分鐘，對樹脂進行了 Fmoc去保護。 然后將樹脂用DMF(2x2ml)清洗，并將反應重復一次。將樹脂在DMF(3x2ml)、DCM(3x2ml)、 然后最后在DMF(2ml)中充分清洗。然后對于其余的氨基酸殘基重復該反應。為了添加 發(fā)色基團后的氨基酸，在如下進行連接之前制備了?；然铩⑷鈿?Triphosgene) (0. 077mmol)和Fmoc保護的氨基酸(0. 23mmol)溶解在lml四氫呋喃(THF)中。向溶液逐 滴加入0. 76mmol三甲基吡啶，產生了白色懸液。然后將其加入到樹脂中，在室溫下混合1 小時。將反應混合物排液，用THF(2x2ml)和DCM(3x2ml)清洗。重復反應以確保完全，然后 將樹脂排液，并用1冊(2口1111)、0〔11(3口1111)、然后用01^(21111)充分清洗。按照上面的描述， 去保護得到促進。從樹脂上切下和側鏈的去保護，通過加入TFA 水三乙基硅烷(TES) (95% 2.5% 2.5%)來進行。將漿液劇烈攪拌90分鐘。為了完成合成，通過使用 0. 1% TFA水(2x5ml)進一步洗滌，從樹脂漿液除去粗品肽混合物。然后將混合物蒸發(fā)至 干，通過用溶劑小心地沖洗肽殘渣然后傾析，用無水乙醚(2x10ml)進行清洗。將殘渣空氣 干燥1小時，然后溶解在盡可能少量的水(3_5ml)中，通過0.2pm濾器過濾。將濾液注射 到Phenomenex Jupiter proteo柱上進行分析，然后進行制備HPLC。將純的級份合并，蒸發(fā) 至干，然后重新溶解在純水(0.5-lml)中，在微量離心(印pendorf)管中速凍并冷凍干燥， 以獲得白色/無色的粉末狀固體。使用陽離子濺射質譜通過LC-MS對肽進行驗證。實施例2-木瓜蛋白酶的檢測在分析測定中使用發(fā)色多肽Val-Arg-[pABA]-Gly來檢測樣品溶液中木瓜蛋白酶 的存在。將含有蛋白酶木瓜蛋白酶的樣品施加到圖3中描述的實施方案的小冊子的第一個 片層上(參見圖8A)。小冊子的第一個片層事先已經用發(fā)色多肽浸漬過。5分鐘后，將小冊 子的第一和第二個片層折疊到一起。小冊子的第二個片層事先已用DMAC浸漬過，10分鐘 后，DMAC從黃色變?yōu)榧t色，正如可以通過小冊子的第二個片層上的孔隙觀察到的。作為對 照，也使用水代替樣品重復了分析測定，顏色變化的結果顯示在圖8B的圖中。也在相同的條件下使用BANA而不是發(fā)色多肽重復了蛋白酶分析測定。對 于分析測定過程中檢測到的顏色變化速率進行了比較，結果用圖形顯示在圖8C中。 Val-Arg-[pABA]-Gly與BANA(苯甲?；滨］涟?相比，顯示出引發(fā)了更快的可檢測的 顏色變化，這對于原位檢測裝置來說是有利的。^MM 3A-用于檢測丨彈件存在的i舌合的發(fā)代底4勿的石角定合成了兩種肽 AAPV- [pABA] -GGC 和 AAPV- [ANA] -GGC,其中 pABA 是對氨基苯 甲酸，ANA是2-氨基萘甲酸。測試了兩種肽作為嗜中性彈性蛋白酶的底物的適合性。 AAPV-[pABA]-GGC和AAPV-[ANA]-GGC的電子濺射質譜圖分別顯示在圖10A和10B中。在獨立的板孔中，向0. 5mg/ml肽(5 yl)添加不同濃度的彈性蛋白酶(18、9、6和3單位/ml的稀釋液，5 ill)。將混合物用20 u 1緩沖液(50mM磷酸鹽，5mM EDTA ；pH 7. 4)稀 釋，在37°C溫育30分鐘。向每個板孔加入15 ill DMAC工作溶液(0. 3mg/ml DMAC, 50mMHCl), 充分混合，以進行可視化。本實驗的結果顯示在圖8A中。當孔中彈性蛋白酶終濃度為3、1. 5或1單位/ml時，使用AAPV-[pABA]-GGC 的分析測定給出了彈性蛋白酶活性的陽性結果(即孔變?yōu)榧t色/橙色(Pantone 136U))。這種顏色變化表明存在彈性蛋白酶。含有0.5單位/ml彈性蛋白酶的孔當與 AAPV-[pABA]-GGC(Pantone 108U)混合時，給出了弱陽性結果。對照孔給出陰性結果。相反，含有AAPV-[ANA]-GGC的孔都沒有明顯改變顏色，它們保持黃色(Pantone 394U)。因此，盡管孔中存在彈性蛋白酶，但彈性蛋白酶活性沒能檢測到。實施例3B 使用了另一種格式來測試嗜中性彈性蛋白酶在存在兩種肽AAPV- [pABA] -GGC和 AAPV-[ANA]-GGC的情況下的活性。肽的C-末端半胱氨酸基團被用作與固相結合的手段。 將用碘乙?；鶊F功能化的燒結聚乙烯玻璃料在50mM磷酸鈉，5mM EDTA，pH 7. 4溶液中清洗 10分鐘。然后將玻璃料轉移到0. 5mg/ml肽溶液(在PBS)中敏化30分鐘。然后將玻璃料 再一次在磷酸鹽EDTA緩沖液中清洗10分鐘。將玻璃料裝在空柱中，加入200 yl彈性蛋白 酶，流動接觸時間大約30秒。為了使測定顯色，將100 ill DMAC工作溶液(0. 3mg/ml DMAC, 50mM HC1)通過柱子。該分析測定的結果顯示在圖8B中。含有AAPV-[pABA]-GGC和彈性蛋白酶的測定 柱給出了陽性結果(Pantone 參比值1505U*)，含有AAPV-[pABA]-GGC但不含彈性蛋白酶 的柱給出了陰性結果(Pantone 參比值3945U*)。含有AAPV-[ANA]-GGC的柱子，一種具有 存在的彈性蛋白酶，另一種不含，都給出了陰性結果(Pantone 參比值3945U*)。實施例3A和3B的結論根據在它們存在時檢測到的彈性蛋白酶活性，在兩種肽之間觀察到了明顯的差 異。彈性蛋白酶底物優(yōu)選在P1’位置具有絲氨酸、蘇氨酸(二者都具有親水側鏈)或甘氨 酸(來源MER0PS數據庫)。因此，具有大的疏水表面的大體積發(fā)色氨基酸不可能與這些優(yōu) 選氨基酸空間匹配合適。萘甲酸(ANA)比對氨基苯甲酸(pABA)體積更大并且更加疏水，因 此AAPV-[ANA]-GGC不是良好的彈性蛋白酶底物。這兩種分子的結構都顯示在圖9中。pABA 發(fā)色氨基酸與絲氨酸和蘇氨酸的空間匹配好得多，因此AAPV-[pABA]-GGC明顯更適合作為 彈性蛋白酶的底物，在底物與酶混合時產生彈性蛋白酶活性。因此，AAPV- [pABA] -GGC可用 于檢測彈性蛋白酶的存在。實施例4 :AAPV- [pABA] -GGC 的合成制造了一種新類型的構件，它們被開發(fā)用于改進含有發(fā)色氨基酸的肽的合成，其 中所述構件的合成與自動化合成相容。用于合成這種構件的方法不需要使用在實施例1中 描述的BTC/三甲基吡啶(collidine)步驟。BTC/三甲基吡啶步驟是有效的，但是需要嚴苛 的條件，并產生不溶性沉淀，使得它不適合與自動化肽合成組合使用。新類型的構件離線合成，并摻入P1氨基酸和P1’發(fā)色氨基酸。它可以使用用于序 列中所有其他氨基酸的標準條件，方便地摻入到合成中。避免了困難的連接步驟中不想要 的副反應，導致了快速、整潔的步驟。
將 Fmoc-Val-OH(lOmmol)和叔丁基 pABA(lOmmol)溶解在無水吡啶中(30ml)。將 溶液在乙二醇/干冰浴中冷卻到_15°C，逐滴加入三氯氧磷(1ml，llmmol)，同時劇烈攪拌。 30分鐘后將反應用TLC終止。加入碎冰(100ml)，將水性混合物用乙酸乙酯(3x50ml)抽提。 然后將該有機提取物用飽和NaHC03(3x50ml)和鹽水(3x50ml)洗滌。然后將有機提取物在 無水硫酸鈉上干燥。將粗混合物蒸發(fā)至干，然后相繼用甲苯、乙酸乙酯和甲醇共蒸發(fā)。將產 物在硅膠上純化，使用19 1的二氯甲烷/甲醇洗脫。純化的叔丁基酯用1 1的TFA/ 二氯甲烷去保護1小時并蒸發(fā)，以獲得淺黃色固體。將該化合物代替單獨的pABA和纈氨酸 連接步驟，直接用于合成AAPV- [pABA] -GGC，成功地生產了預計的肽。粗品純度通過HPLC分 析典型地為70%，與使用原始步驟時觀察到的35%形成對比。Fmoc-Val-pABA-0H的咕NMR 波譜顯示在圖11中，使用Fmoc-Val-pABA-OH合成的AAPV-[pABA]-GGC的電子濺射質譜圖
顯示在圖12中。
序列表的自由內容
<210>1
<223> 發(fā)色多肽 Ala-[pABA]-Gly
<210>2
<223> 發(fā)色多肽 Val-Arg-[pABA] -Gly
<210>3
<223> 發(fā)色多肽 AAPV-[pABA]-GGC
<210>4
<223> 發(fā)色多肽 AAPV-[ANA]-GGC
<210>5
<223> 發(fā)色多肽 Val-[pABA] -GGC
權利要求
含有發(fā)色氨基酸的多肽，其中發(fā)色氨基酸在其N和C端兩側連有至少一個氨基酸，發(fā)色氨基酸的胺基具有低于5的pKa，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反應，并且其中多肽包含靶蛋白酶的靶序列，該靶蛋白酶能夠切開包含發(fā)色氨基酸的氨基的肽鍵。
2.權利要求1的多肽，其中發(fā)色氨基酸含有直接鍵合到發(fā)色氨基酸的氨基的氮原子上 的芳香環(huán)部分。
3.權利要求1或權利要求2的多肽，其中發(fā)色氨基酸與天然氨基酸等排性匹配。
4.前述權利要求任一項的多肽，其中靶序列包含發(fā)色氨基酸。
5.前述權利要求任一項的多肽，其中當靶序列被切開時，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反 應，給出可檢測信號。
6.前述權利要求任一項的多肽，其中共軛醛是取代的苯甲醛或肉桂醛或反，反-苯基 戊二烯醛。
7.前述權利要求任一項的多肽，其中共軛醛是DMAC或DMAB。
8.權利要求2的多肽，其中芳族部分是苯基或萘基部分。
9.前述權利要求任一項的多肽，其中多肽在多肽的C或N末端處或附近固定化在固相 表面上。
10.權利要求9的多肽，其中多肽共價結合到固相表面上。
11.前述權利要求任一項的多肽，在多肽的C或N末端處或附近還含有第一個和第二個 結合部分。
12.前述權利要求任一項的多肽，其中多肽的長度在2到100個氨基酸之間，更優(yōu)選在 3到40個氨基酸之間。
13.在樣品中檢測蛋白酶的方法，包括下列步驟(i)將樣品暴露于前述權利要求任一項的多肽中，允許蛋白酶切開多肽并產生片段，在 該片段的N-末端顯示發(fā)色氨基酸；(ii)將共軛醛與含有發(fā)色氨基酸的片段反應，產生有色加成物；以及(iii)檢測有色加成物，有色加成物的存在表明樣品中存在蛋白酶。
14.權利要求13的方法，其中步驟(i)包括用蛋白酶切開多肽的含有發(fā)色氨基酸的氨 基的肽鍵。
15.制備權利要求1到12任一項的多肽的方法，包括下列步驟i.合成含有一個發(fā)色氨基酸的氨基酸二聚體；以及ii.在多肽合成過程中將二聚體摻入到多肽的剩余部分中。
16.權利要求15的方法，其中步驟(ii)包含將二聚體與新生寡肽相連。
17.用于在樣品中檢測蛋白酶的產品，包含權利要求1到12任一項的多肽；以及其上可以固定化多肽的固相支持物。
18.權利要求17的產品，還包含共軛醛。
19.權利要求18的產品，其中固相支持物包含第一個和第二個鉸鏈連接的片層，多肽 固定化在第一個片層上，共軛醛位于第二個片層上，使得將片層折疊到一起時可以將材料 從第一個片層轉移到第二個片層上。
20.權利要求19的產品，還包含可插入到固定化在第一個片層上的多肽與位于第二個片層上的共軛醛之間的膜，所述膜阻止了尺寸大于閾值尺寸的物質從第一個片層到達第二 個片層，多肽可以被蛋白酶切開以釋放含有發(fā)色氨基酸的片段，所述片段小于閾值尺寸。
21.權利要求17或18的產品，其中固相支持物包含色譜介質。
22.權利要求21的產品，其中色譜介質還包含片段結合分子，能夠結合含有在被蛋白 酶切開后可以從多肽釋放的發(fā)色氨基酸的多肽的片段，多肽能固定化在色譜介質上的標記 區(qū)域處，片段結合分子固定化在色譜介質的可視化區(qū)域處。
23.權利要求21的產品，其中多肽可以被切開成第一個和第二個片段，第一個片段含 有發(fā)色氨基酸，其中產品還包含能與第二個片段結合的可檢測標記物；以及固定化在色 譜介質中或其上的第一種和第二種捕獲分子，第一種捕獲分子能夠結合第一個片段，第二 種捕獲分子能夠結合第二個片段或可檢測標記物。
24.權利要求23的產品，其中標記物包含能夠結合第二個片段的結合成分。
25.權利要求21到24任一項的產品，其中色譜介質包括測試條。
26.權利要求21到24任一項的產品，其中色譜介質包括多孔材料柱。
27.合成的多肽，含有大量原料氨基酸和至少一個與天然氨基酸等排性匹配的發(fā)色氨 基酸。
28.權利要求27的合成多肽在檢測樣品中的蛋白酶中的應用。
全文摘要
含有發(fā)色氨基酸的多肽。發(fā)色氨基酸在其N和C端兩側具有至少一個氨基酸。發(fā)色氨基酸的氨基具有至少為5的pKa。發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反應。多肽含有靶蛋白酶的靶序列，該靶蛋白酶能夠切開含有發(fā)色氨基酸的氨基的肽鍵。
文檔編號B01L3/00GK101896272SQ200880115836
公開日2010年11月24日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權日2007年11月13日
發(fā)明者詹姆斯·亞歷山大·斯庫藤 申請人:莫洛迪克有限公司