一種滸苔蛋白酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種滸苔蛋白酶的制備方法，該方法包括：選擇原料、高壓清洗、漏水剪切、添加蛋白酶抑制劑榨汁、加入抽提液和緩沖液放入搗碎機(jī)制備粗抽提液、固體硫酸銨離心、乙酸溶液透析脫鹽、加入羅氏蛋白酶抑制劑冰浴冷卻、加入氯丁橡膠cr322攪拌離心、用碳酸氫鈉純化、n-乙酰-l-半胱氨酸溶液結(jié)晶、冷凍離心收集結(jié)晶、成品保存。有效保證滸苔蛋白酶活力和純度。本發(fā)明的可廣泛應(yīng)用在洗滌工業(yè)、食品工業(yè)、紡織工業(yè)、皮革工業(yè)、紙漿工業(yè)、飼料、石油天然氣鉆井、臨床醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)等行業(yè)。并在的應(yīng)用中具有減少耗能，減少化學(xué)品、快速環(huán)保的優(yōu)良效果。
【專利說明】一種滸苔蛋白酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種植物蛋白酶，尤其涉及一種滸苔蛋白酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，植物蛋白酶在洗滌工業(yè)、食品工業(yè)、紡織工業(yè)、皮革工業(yè)、紙漿工業(yè)、飼料、石油天然氣鉆井、臨床醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)等行業(yè)的中廣泛應(yīng)用，植物蛋白酶具有減少耗能，減少化學(xué)品、快速環(huán)保等優(yōu)良效果，其應(yīng)用也越來越受到人們的關(guān)注。
[0003]植物蛋白酶的制備以植物質(zhì)為原料，進(jìn)行蛋白酶制備。常用的植物蛋白酶植物質(zhì)多采用綠色谷物、草類、未成熟的谷物和樹葉等。滸苔蛋白酶的優(yōu)勢(shì)在于能夠與海洋經(jīng)濟(jì)很好的結(jié)合，原料價(jià)格低，有助于更好的對(duì)滸苔原料進(jìn)行綜合利用，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生價(jià)值最大化。滸苔細(xì)胞培養(yǎng)可以不受地域、土地、氣候、季節(jié)等自然條件的限制，在工業(yè)化條件下，可實(shí)現(xiàn)全年生產(chǎn)。滸苔生長(zhǎng)的倍增時(shí)間一般為15h-60h，生產(chǎn)周期為8-15d，與木瓜、大蒜、紫草等相t匕，滸苔大大縮短了生產(chǎn)周期。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中還沒有一種滸苔蛋白酶的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在下文中給出關(guān)于本發(fā)明的簡(jiǎn)要概述，以便提供關(guān)于本發(fā)明的某些方面的基本理解。應(yīng)當(dāng)理解，這個(gè)概述并不是關(guān)于本發(fā)明的窮舉性概述。它并不是意圖確定本發(fā)明的關(guān)鍵或重要部分，也不是意圖限定本發(fā)明的范圍。其目的僅僅是以簡(jiǎn)化的形式給出某些概念，以此作為稍后論述的更詳細(xì)描述的前序。
[0006]本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種滸苔蛋白酶的制備方法。該方法能夠與海洋經(jīng)濟(jì)很`好的結(jié)合，具有原料價(jià)格低，有助于更好的對(duì)滸苔原料進(jìn)行綜合利用，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生價(jià)值最大化的優(yōu)點(diǎn)。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0008]本發(fā)明提供一種滸苔蛋白酶的制備方法，包括以下步驟:
[0009](I)選擇滸苔，并清洗打撈的滸苔；
[0010](2)將打撈的滸苔剪切，然后加入蛋白酶抑制劑進(jìn)行榨汁，得到滸苔汁液；所述蛋白酶抑制劑的加入量為滸苔汁液重量的1%_3% ；
[0011](3)將滸苔汁液放入搗碎機(jī)，給搗碎機(jī)加入抽提液和緩沖液，搗碎抽提后，將懸浮液過濾，得到的濾液為滸苔蛋白酶的粗抽提液；
[0012]所述抽提液制備方法:按照IL蒸餾水加入0.5-2g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化鈉NaCI溶液中加入0.1-0.3g氯化鉀；按照IL蒸餾水配置的所述抽提液用于加入100克的滸苔汁液中；
[0013]所述緩沖液制備方法:按照IL蒸餾水加入0.3-1.5g三羥甲基甲烷，配置三羥甲基甲烷溶液，按照IL蒸餾水配置的所述緩沖液用于加入100克的滸苔汁液中；
[0014](4)在0_2°C將固體硫酸銨加入所述的粗抽提液中，攪拌，至溶液飽和度35-45%，離心后棄上清夜，得到滸苔蛋白酶溶液；
[0015](5)將滸苔蛋白酶溶液裝入透析袋中，將透析袋浸泡在0.5-2mol/L乙酸溶液中進(jìn)行脫鹽處理；
[0016](6)給脫鹽處理后的滸苔蛋白酶溶液中加入羅氏蛋白酶抑制劑，冰浴冷卻，再加入氯丁橡膠，攪拌，離心，得沉淀，沉淀再用NaHCO3洗脫，攪拌，離心后再次得到沉淀；
[0017]所述蛋白酶抑制劑用量為:每100克的滸苔汁液中對(duì)應(yīng)加入0.05-0.1ml蛋白酶抑制劑；
[0018]所述氯丁橡膠的用量為:每100克的滸苔汁液中對(duì)應(yīng)加入20_30mg氯丁橡膠； [0019]所述NaHCO3的用量為:每100克的滸苔汁液中對(duì)應(yīng)加入5_10g NaHCO3 ；
[0020](7)將步驟(6)最終得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在23_25°C室溫下放置60-120min生成結(jié)晶，所得到的結(jié)晶為滸苔蛋白酶；
[0021 ] 所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液按照IOOmL蒸餾水加入0.1-0.3gN_乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，按照IOOmL蒸餾水配置的所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液用于加入100克的滸苔汁液中。
[0022]所述蛋白酶抑制劑選自EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid乙二胺四乙酸)、a2-巨球蛋白、B.M.綜合酶片或羅氏蛋白酶。
[0023]進(jìn)一步地，步驟(1)中還包括:
[0024]選擇的滸苔為:打撈后到使用< 2天，自然溫度打撈后，滸苔的加工溫度< 37°C，優(yōu)選20-37°C;優(yōu)選20°C至37°C，通過IOOkpa高壓水清洗滸苔，去除沙石，時(shí)間20-30分鐘。
[0025]進(jìn)一步地，步驟(2)中:
[0026]對(duì)清洗的滸苔進(jìn)行自然漏水處理:
[0027]將沖洗后的滸苔平整堆放在漏水架上，每層漏水架設(shè)置接水底盤，每層滸苔厚度15-25cm，所述剪切的滸苔的長(zhǎng)度和寬度為1-1.5cm。
[0028]所述浸泡的時(shí)間為l_2h。
[0029]所述透析袋為玻璃紙透析袋。
[0030]所述冰浴冷卻的時(shí)間為10-15min，加入氯丁橡膠的攪拌時(shí)間為5_10min，加入NaHCO3的攪拌時(shí)間為2-16min。
[0031]進(jìn)一步地，將步驟(7)的得到的結(jié)晶在4°C的條件下放置8_16h，結(jié)晶長(zhǎng)大，冷凍離心收集結(jié)晶。
[0032]所述氯丁橡膠選自氯丁橡膠CR322、氯丁橡膠CR2442或氯丁橡膠CR121。
[0033]所述滸苔蛋白酶在0°C冰箱保存。
[0034]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0035]1、本發(fā)明可廣泛應(yīng)用在洗滌工業(yè)、食品工業(yè)、紡織工業(yè)、皮革工業(yè)、紙漿工業(yè)、飼料、石油天然氣鉆井、臨床醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)等行業(yè)。并在的應(yīng)用中具有減少耗能，減少化學(xué)品、快速環(huán)保的優(yōu)良效果。
[0036]2、滸苔蛋白酶能夠與海洋經(jīng)濟(jì)很好的結(jié)合，原料價(jià)格低，制備工藝簡(jiǎn)單，有助于更好的對(duì)滸苔原料進(jìn)行綜合利用，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生價(jià)值最大化。
[0037]3、滸苔細(xì)胞培養(yǎng)可以不受地域、土地、氣候、季節(jié)等自然條件的限制，在工業(yè)化條件下，可實(shí)現(xiàn)全年生產(chǎn)。[0038]4、滸苔蛋白酶具有生物降解性，一定程度上緩解給環(huán)境帶來的污染。
[0039]5、滸苔蛋白酶的制備技術(shù)帶動(dòng)滸苔的綜合利用，使其高效地轉(zhuǎn)化為洗滌、食品、飼料、紡織和各類物質(zhì)的化學(xué)品。
[0040]6、制備工藝具有酶的活力和純度較高，滸苔蛋白酶活力> 230萬單位/克。
[0041]7、有利促進(jìn)海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明:
[0043]實(shí)施例1
[0044]一種滸苔蛋白酶的制備方法，包括以下步驟:
[0045](1)選擇滸苔，并清洗打撈的滸苔；
[0046](2)將打撈的滸苔剪切，然后加入a2_巨球蛋白進(jìn)行榨汁，得到滸苔汁液；取100克滸苔汁液中含有I克a2-巨球蛋白；
[0047](3)將100克滸苔汁液放入搗碎機(jī)，給搗碎機(jī)加入抽提液和緩沖液，搗碎抽提后將懸浮液過濾，得到的濾液為滸苔蛋白酶的粗抽提液；
[0048]所述抽提液制備方法:將IL蒸餾水加入0.5g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化鈉NaCI溶液中加入0.3g氯化鉀；
[0049]所述緩沖液制備方法:將IL蒸餾水加入1.5g三羥甲基甲烷，配置三羥甲基甲烷溶液；
[0050](4)在0°C，將固體硫酸銨加入所述的粗抽提液中，攪拌，至溶液飽和度35%，離心后棄上清夜，得到滸苔蛋白酶溶液；
[0051](5)將滸苔蛋白酶溶液裝入透析袋中，將透析袋浸泡在0.5ml/L乙酸溶液中進(jìn)行脫鹽處理；
[0052](6)給脫鹽處理后的滸苔蛋白酶溶液中加入0.05g羅氏蛋白酶抑制劑，冰浴冷卻，再加入20mg氯丁橡膠，攪拌，離心，得沉淀，沉淀再用5g濃度為60%的NaHCO3溶液洗脫，攪拌，離心后再次得到沉淀；
[0053](7)將步驟(6)最終得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在25°C室溫下放置IOOmin生成結(jié)晶，所得到的結(jié)晶為滸苔蛋白酶；其中，N-乙酰-L-半胱氨酸溶液為IOOmL蒸餾水加入0.1gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液。
[0054]實(shí)施例2
[0055]一種滸苔蛋白酶的制備方法，包括以下步驟:
[0056](1)選擇滸苔，并清洗打撈的滸苔；選擇的滸苔為:打撈后到使用< 2天，自然溫度打撈后，滸苔的加工溫度30°C ;通過IOOkpa高壓水清洗滸苔，去除沙石，時(shí)間20-30分鐘。
[0057](2)對(duì)清洗的滸苔進(jìn)行自然漏水處理:
[0058]將沖洗后的滸苔平整堆放在漏水架上，每層漏水架設(shè)置接水底盤，每層滸苔厚度15-25cm，所述剪切的滸苔的長(zhǎng)度和寬度為1-1.5cm;將打撈的滸苔剪切，然后加入B.M.綜合酶片進(jìn)行榨汁，得到滸苔汁液；B.M.綜合酶片的加入量為滸苔汁液重量的2%，即100克滸苔汁液加入2克蛋白酶抑制劑；
[0059](3)將100克將苔汁液加入2克B.M.綜合酶片放入waringblender高速組織搗碎機(jī)，給搗碎機(jī)加入抽提液和緩沖液，溫度(TC -50C，間隙式操作5s，重復(fù)10次搗碎抽提，懸浮液用布氏漏斗過濾，用美藍(lán)染色法測(cè)定滸苔細(xì)胞破碎程度，過濾后得到的濾液為滸苔蛋白酶的粗抽提液；
[0060]所述抽提液制備方法:將IL蒸餾水加入Ig的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的NaCI溶液中加入0.2g氯化鉀；
[0061]所述緩沖液制備方法:將IL蒸餾水加入0.Sg三羥甲基甲烷，配置三羥甲基甲烷溶液；
[0062](4)將固體硫酸銨磨碎成均勻細(xì)粒，在1°C下攪拌下分批加入所述的粗抽提液至飽和度40%，離心，棄上清夜，沉淀為澄清的滸苔蛋白酶溶液。
[0063](5)將滸苔蛋白酶溶液裝入透析袋中，將玻璃紙透析袋浸泡在0.7ml/L乙酸溶液中進(jìn)行脫鹽處理，浸泡的時(shí)間為1.5h ；
[0064](6)給脫鹽處理后的滸苔蛋白酶溶液中加入0.08ml羅氏蛋白酶抑制劑，冰浴冷卻IOmin,再加入25mg氯丁橡膠CR322,攪拌6min,離心,得沉淀,沉淀再用8g50%的NaHCO3溶液洗脫，攪拌lOmin，離心后再次得到沉淀；
[0065](7)將步驟(6)最終得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在25°C室溫下放置IOOmin生成結(jié)晶，結(jié)晶在4°C的條件下放置10h，結(jié)晶長(zhǎng)大，冷凍離心收集結(jié)晶，所得到的結(jié)晶為滸苔蛋白酶；
[0066]所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液的制備:IOOmL蒸餾水加入0.2gN_乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液；
[0067](8)保存結(jié)晶:0°C 下冰箱保存，液態(tài)滸苔蛋白酶pH5-10于_5°C下穩(wěn)定，pH ( 8時(shí)穩(wěn)定性有所增加，可保存6-12個(gè)月。
[0068]實(shí)施例3
[0069]一種滸苔蛋白酶的制備方法，包括以下步驟:
[0070](I)選擇滸苔，并清洗打撈的滸苔；選擇的滸苔為:打撈后到使用< 2天，自然溫度打撈后，滸苔的加工溫度20°C ;通過IOOkpa高壓水清洗滸苔，去除沙石，時(shí)間20-30分鐘。
[0071](2)對(duì)清洗的滸苔進(jìn)行自然漏水處理:
[0072]將沖洗后的滸苔平整堆放在漏水架上，每層漏水架設(shè)置接水底盤，每層滸苔厚度15-25cm，所述剪切的滸苔的長(zhǎng)度和寬度為1-1.5cm;將打撈的滸苔剪切，然后加入羅氏蛋白酶進(jìn)行榨汁，得到滸苔汁液；羅氏蛋白酶的加入量為滸苔汁液重量的2%，即100克滸苔汁液加入2克蛋白酶抑制劑；
[0073](3)將100克將苔汁液加入3克羅氏蛋白酶放入waringblender高速組織搗碎機(jī)，給搗碎機(jī)加入抽提液和緩沖液，溫度0°C _5°C，間隙式操作5s，重復(fù)10次搗碎抽提，懸浮液用布氏漏斗過濾，用美藍(lán)染色法測(cè)定滸苔細(xì)胞破碎程度，過濾后得到濾液為滸苔蛋白酶的粗抽提液；
[0074]所述抽提液制備方法:將IL蒸餾水加入2g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化鈉NaCI溶液中加入0.3g氯化鉀；
[0075]所述緩沖液制備方法:將IL蒸餾水加入1.5g三羥甲基甲烷，配置三羥甲基甲烷溶液；
[0076](4)將固體硫酸銨磨碎成均勻細(xì)粒，在2°C下攪拌下分批加入所述的粗抽提液至飽和度35%，離心，棄上清夜，沉淀為澄清的滸苔蛋白酶溶液。
[0077](5)將滸苔蛋白酶溶液裝入透析袋中，將玻璃紙透析袋浸泡在1.5ml/L乙酸溶液中進(jìn)行脫鹽處理，浸泡的時(shí)間為2h ；
[0078](6)給脫鹽處理后的滸苔蛋白酶溶液中加入0.05ml羅氏蛋白酶抑制劑，冰浴冷卻12min,再加入20mg氯丁橡膠CR322,攪拌8min,離心,得沉淀,沉淀再用10g45%的NaHCO3溶液洗脫，攪拌2min，離心后再次得到沉淀；
[0079](7)將步驟(6)最終得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在23°C室溫下放置60min生成結(jié)晶，結(jié)晶在4°C的條件下放置16h，結(jié)晶長(zhǎng)大，冷凍離心收集結(jié)晶，所得到的結(jié)晶為滸苔蛋白酶；
[0080]所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液的制備:IOOmL蒸餾水加入0.3gN_乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液；
[0081](8)保存結(jié)晶:0°C下冰箱保存，液態(tài)滸苔蛋白酶pH5-10于_5°C下穩(wěn)定，pH ( 8時(shí)穩(wěn)定性有所增加，可保存6-12個(gè)月。
[0082]實(shí)施例4
[0083]一種滸苔蛋白酶的制備方法，包括以下步驟:
[0084](I)選擇滸苔，并清洗打撈的滸苔；選擇的滸苔為:打撈后到使用< 2天，自然溫度打撈后，滸苔的加工溫度37°C ;通過IOOkpa高壓水清洗滸苔，去除沙石，時(shí)間20-30分鐘。
[0085](2)對(duì)清洗的滸苔進(jìn)行自然漏水處理:
[0086]將沖洗后的滸苔平·整堆放在漏水架上，每層漏水架設(shè)置接水底盤，每層滸苔厚度15-25cm，所述剪切的滸苔的長(zhǎng)度和寬度為1-1.5cm ;將打撈的滸苔剪切，然后加入a2-巨球蛋白進(jìn)行榨汁，得到滸苔汁液；所述蛋白酶抑制劑的加入量為滸苔汁液重量的3%，即100克滸苔汁液加入3克蛋白酶抑制劑；
[0087](3)將100克將苔汁液放入waringblender高速組織搗碎機(jī),給搗碎機(jī)加入抽提液和緩沖液，溫度(TC -50C，間隙式操作5s，重復(fù)10次搗碎抽提，懸浮液用布氏漏斗過濾，用美藍(lán)染色法測(cè)定滸苔細(xì)胞破碎程度，過濾后得到的濾液為滸苔蛋白酶的粗抽提液；
[0088]所述抽提液制備方法:將IL蒸餾水加入1.5g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化鈉NaCI溶液中加入0.15g氯化鉀；
[0089]所述緩沖液制備方法:將IL蒸餾水加入0.3g三羥甲基甲烷，配置三羥甲基甲烷溶液；
[0090](4)將固體硫酸銨磨碎成均勻細(xì)粒，在0°C下攪拌下分批加入所述的粗抽提液至飽和度40%，離心，棄上清夜，沉淀為澄清的滸苔蛋白酶溶液。
[0091](5)將滸苔蛋白酶溶液裝入透析袋中，將玻璃紙透析袋浸泡在2ml/L乙酸溶液中進(jìn)行脫鹽處理，浸泡的時(shí)間為100分鐘；
[0092](6)給脫鹽處理后的滸苔蛋白酶溶液中加入0.1ml羅氏蛋白酶抑制劑，冰浴冷卻15min,再加入30mg氯丁橡膠CR322,攪拌8min,離心,得沉淀,沉淀再用5g85%的NaHCO3溶液洗脫，攪拌5min，離心后再次得到沉淀；
[0093](7)將步驟(6)最終得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在24°C室溫下放置120min生成結(jié)晶，結(jié)晶在4°C的條件下放置8h，結(jié)晶長(zhǎng)大，冷凍離心收集結(jié)晶，所得到的結(jié)晶為滸苔蛋白酶；[0094]所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液的制備:IOOmL蒸餾水加入0.1gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液；
[0095](8)保存結(jié)晶:0°C下冰箱保存，液態(tài)滸苔蛋白酶pH5-10于_5°C下穩(wěn)定，pH≤8時(shí)穩(wěn)定性有所增加，可保存6-12個(gè)月。
[0096]用福林試劑還原，分光光度法測(cè)定本發(fā)明滸苔蛋白酶活力:
[0097]1、先將酪素溶液放入40°C ±0.2°C恒溫水浴中，預(yù)熱5min
[0098]2、4個(gè)試管(滸苔蛋白酶實(shí)例1-4試樣)一加滸苔蛋白酶液態(tài)的酶液
1.0Oml — 400C ±0.2°C，2min 加酪素 1.0Oml (搖勻)一40°C ±0.2°C，2min 加三氯乙酸
2.0Oml (搖勻)一取出靜置lOmin，過濾一取1.0Oml濾液一碳酸鈉溶液(取43g碳酸鈉，以蒸餾水溶解并定溶至1000ml)5.0ml —加福林試劑使用液1.0Oml — 40°C ±0.2°C顯色20min于680波長(zhǎng)，用IOmm比色皿測(cè)其吸光度。
[0099]3、標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算:X=AXKX4/10XN=2/5XAXKXN
[0100]X-樣品酶活力，u/g(u/ml)，A-樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度，k_吸光常數(shù)，4_反應(yīng)試劑的總體積(ml), 10-反應(yīng)時(shí)間IOmin (以Imin計(jì)算),N_稀釋倍數(shù)，行試驗(yàn)測(cè)定值誤差
(3%。
[0101]4、測(cè)定吸光度計(jì)算:X=AXKX8/2X10/1XNXE=2/5XAXKXNXE
[0102]X:樣品酶活力，u/g(u/ml) ; A:樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度；
[0103]k:吸光常數(shù)；8:反應(yīng)試劑的總體積(ml)；
[0104]2:吸取酶液 2.0Oml;1/10:反應(yīng)時(shí)間 IOmin,以 Imin 計(jì)；
[0105]N:稀釋倍數(shù)；E:紫外法與福林法的換算系數(shù)(系數(shù)為
[0106]0.50)，平行試驗(yàn)測(cè)定值誤差≤3%。
[0107]5、測(cè)定酶(固體或液體)，稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，如表1。
[0108]表1
[0109]
【權(quán)利要求】
1.一種滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選擇滸苔，并清洗打撈的滸苔； (2)將打撈的滸苔剪切，然后加入蛋白酶抑制劑進(jìn)行榨汁，得到滸苔汁液；所述蛋白酶抑制劑的加入量為滸苔汁液重量的1%_3% ； (3)將滸苔汁液放入搗碎機(jī)，給搗碎機(jī)加入抽提液和緩沖液，搗碎抽提后將懸浮液過濾，得到的濾液為滸苔蛋白酶的粗抽提液； 所述抽提液制備方法:按照IL蒸餾水加入0.5-2g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化鈉NaCI溶液中加入0.1-0.3g氯化鉀；按照IL蒸餾水配置的所述抽提液用于加入100克的滸苔汁液中； 所述緩沖液制備方法:按照IL蒸餾水加入0.3-1.5g三羥甲基甲烷，配置三羥甲基甲烷溶液，按照IL蒸餾水配置的所述緩沖液用于加入100克的滸苔汁液中； (4)在0-2°C，將固體硫酸銨加入所述的粗抽提液中，攪拌，至溶液飽和度35-45%，離心后棄上清液，得到滸苔蛋白酶溶液； (5)將滸苔蛋白酶溶液裝入透析袋中，將透析袋浸泡在0.5-2mol/L乙酸溶液中進(jìn)行脫鹽處理； (6)給脫鹽處理后的滸苔蛋白酶溶液中加入羅氏蛋白酶抑制劑，冰浴冷卻，再加入氯丁橡膠，攪拌，離心，得沉淀，沉淀再用重量百分比濃度為45-90%的NaHCO3溶液洗脫，攪拌，離心后再次得到沉淀； 所述蛋白酶抑制劑用量為:每100克的滸苔汁液中對(duì)應(yīng)加入0.05-0.1ml蛋白酶抑制劑； 所述氯丁橡膠的用量為:每100克的滸苔汁液中對(duì)應(yīng)加入20-30mg氯丁橡膠； 所述45-90%的NaHCO3溶液用量為:每100克的滸苔汁液中對(duì)應(yīng)加入5_10g NaHCO3溶液； (7)將步驟(6)最終得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在23-25°C室溫下放置60-120min生成結(jié)晶，所得到的結(jié)晶為滸苔蛋白酶； 所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液按照IOOmL蒸餾水加入0.1-0.3gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，按照IOOmL蒸餾水配置的所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液用于加入100克的滸苔汁液中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑選自乙二胺四乙酸、a2-巨球蛋白、B.Μ.綜合酶片或羅氏蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，步驟(1)中還包括: 選擇的滸苔為:打撈后到使用< 2天，自然溫度打撈后，滸苔的加工溫度為20-37°C;通過IOOkpa高壓水清洗滸苔，去除沙石，時(shí)間20-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)中: 對(duì)清洗的滸苔進(jìn)行自然漏水處理: 將沖洗后的滸苔平整堆放在漏水架上，每層漏水架設(shè)置接水底盤，每層滸苔厚度15-25cm，所述剪切的滸苔的長(zhǎng)度和寬度為1-1.5cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述浸泡的時(shí)間為l_2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述透析袋為玻璃紙透析袋。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，步驟(6)中，所述冰浴冷卻的時(shí)間為10-15min，加入氯丁橡膠的攪拌時(shí)間為5_10min，加入NaHCO3的攪拌時(shí)間為2-16min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，將步驟(7)的得到的結(jié)晶在4°C的條件下放置8-16h，結(jié)晶長(zhǎng)大，冷凍離心收集結(jié)晶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述氯丁橡膠選自氯丁橡膠CR322、氯丁橡膠CR2442或氯丁橡膠CR121。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的滸苔蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述滸苔蛋白酶在O °c冰箱保存。
【文檔編號(hào)】C12N9/50GK103589704SQ201310496220
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月27日
【發(fā)明者】王慧芳, 李春雁 申請(qǐng)人:青島海芬海洋生物科技有限公司