專利名稱：：蛋白酶篩選方法及由此鑒別的蛋白酶的制作方法蛋白酶篩選方法及由此鑒別的蛋白酶相關(guān)申請(qǐng)要求EdwinMadison2006年7月5日提交的名稱為"ProteaseScreeningMethodsandProteasesIdentifiedThereby"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)No,60/818,804以及EdwinMadison2006年7月5日提交的名稱為"ModifiedUrinary-PlasminogenActivator(u-PA)Proteases"的優(yōu)先木又。當(dāng)允許時(shí)，上述申請(qǐng)的主題以其全文引入本文。本申請(qǐng)與EdwinMadison2007年7月5日提交的名稱為"ProteaseScreeningMethodsandProteasesIdentifiedThereby"的美國(guó)申請(qǐng)系歹U號(hào)11/825,627相關(guān)，其要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/818,804和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/818,910的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)還與JNguyen,CThanos，SWaugh畫Ruggles,和CCraik2003年10月2曰提交的名稱為"MethodsofGeneratingandScreeningforProteasesw池AlteredSpecificity"的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)10/677,977并在2004年7月29日公幵為美國(guó)申請(qǐng)?zhí)朥S-2004-0146938相關(guān)以及與2004年4月15日公開的相應(yīng)公開的國(guó)際PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/031733相關(guān)，其要求2002年10月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/415,388的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)還與JNguyen和SWaugh-Ruggles2005年4月2日提交的名稱為"CleavageofVEGFandVEGFReceptorbyWild-TypeandMutantMTSP-1"的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)11/104,110并在2006年1月5日公開為美國(guó)申請(qǐng)?zhí)朥S-2006-0002916相關(guān)，以及與2005年11月24日公開的相應(yīng)公開的國(guó)際PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2005/110453相關(guān)，其要求2004年4月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/561,720的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)還與JNguyen和SWaugh-Ruggles2005年4月12日提交的名稱為"CleavageofVEGFandVEGFReceptorbyWild-TypeandMutantProteases"的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)11/104,111并在2006年2月2日公開為美國(guó)申請(qǐng)?zhí)朥S-2006-0024289相關(guān)，以及與2005年10月27日公開的相應(yīng)公開的國(guó)際PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2005/100556相關(guān)，其要求2004年4月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/561,671的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)還與EdwinL.Madison2005年10月21日提交的名稱為"ModifiedProteasesthatInhibitComplementActivation"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/729,817相關(guān)。本申請(qǐng)還與EdwinL.Madison,JackNguyen,SandraWaughRuggles和ChristopherThanos2006年10月20日提交的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)11/584,776相關(guān)，以及與2007年4月26日公開的相應(yīng)公開的國(guó)際PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2007/047995相關(guān)，其各自要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/729,817的優(yōu)先權(quán)。當(dāng)允許時(shí)，上述相關(guān)申請(qǐng)的主題以其全文引入本文。在CD盤上的序列表的引用CD-R上電子形式的序列表在此提交4個(gè)拷貝(標(biāo)為COPY1,COPY2，COPY3，和CRF)，它們的內(nèi)容以其全文引入本文。每個(gè)上述CD盤的計(jì)算機(jī)可讀文件在2007年7月5日創(chuàng)建，是相同的，大小為1809千比特，名稱為4902SEQ.PCl.txt.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了鑒別具有修飾的底物特異性或者其它性質(zhì)的修飾的蛋白酶的方法。所述方法通過將候選物和修飾的蛋白酶與底物接觸而進(jìn)行篩選，所述底物在底物裂解時(shí)捕獲所述候選物和修飾的蛋白酶。背景蛋白酶是降解蛋白質(zhì)的酶。由于蛋白酶可以與靶蛋白特異性相互作用并且使其失活或者活化，因此已經(jīng)將它們用作治療劑。天然發(fā)生的蛋白酶通常不是最佳的治療劑，因?yàn)槠洳怀尸F(xiàn)使其適于作為生物治療劑的特異性、穩(wěn)定性和/或催化活性(見例如Fernandez-GacioWa/.(2003)7&"A21:408-414)。在治療性質(zhì)之中，重要的是無(wú)免疫原性或者免疫原性降低、對(duì)于耙分子的特異性及有限的副作用。天然發(fā)生的蛋白酶通常缺乏這些性質(zhì)的一種或多種。已經(jīng)嘗試工程化具有改良性質(zhì)的蛋白酶。這些方法包括1)合理設(shè)計(jì)(rationaldesign),這需要關(guān)于蛋白酶的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制和分子建模的信息；2)定向進(jìn)化，這是包括產(chǎn)生蛋白酶的各種突變體庫(kù)(repertoire)及選擇呈現(xiàn)預(yù)期特性的那些突變體的方法(BertschingerWa/.(2005)in尸/zagecfop/^y/"所o欣/.朋dl)n/gZ)/助v"(Sidhus,ed)，pp.461-491)。就前者而言，缺少關(guān)于蛋白酶的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的信息限制了合理設(shè)計(jì)大多數(shù)蛋白酶的突變的能力。采用定向進(jìn)化方法取得有限的成功。篩選改良的蛋白酶活性通常導(dǎo)致底物選擇性喪失，反之亦然。最佳的治療性蛋白酶應(yīng)呈現(xiàn)對(duì)于靶底物的高度特異性和高度催化效率。由于可利用的選擇具有優(yōu)化的特異性和優(yōu)化的活性的蛋白酶的方法的效力有限，因此仍需要開發(fā)其它蛋白質(zhì)選擇方法。因此，本發(fā)明的目的是提供選擇具有希望的底物特異性和活性的蛋白酶或者突變體蛋白酶的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了選擇或鑒別具有希望的或預(yù)定的底物特異性和活性的蛋白酶或突變體蛋白酶或其催化活性部分的方法。本發(fā)明特別提供了蛋白酶篩選方法，所述方法鑒別對(duì)于靶底物具有改變的、改良的或者優(yōu)化的或者其它改變的底物特異性和/或活性的蛋白酶。所述方法可用于例如篩選對(duì)于疾病或病癥的病因?qū)W中涉及的靶底物具有改變的底物特異性和/或活性的蛋白酶。依靠對(duì)于耙底物的改變的、典型地增加的特異性和/或活性，在本發(fā)明的方法中鑒別或被選擇的蛋白酶是在所述靶底物所參與的疾病或病癥的治療中用作試劑或治療劑的候選物。在實(shí)施本發(fā)明的方法中，將蛋白酶或其催化活性部分的集合與蛋白酶捕獲多肽接觸，導(dǎo)致形成蛋白酶捕獲多肽與所述集合中的蛋白酶或其催化活性部分的穩(wěn)定復(fù)合物。在一些實(shí)例中，所述蛋白酶捕獲多肽被修飾為由對(duì)于靶底物(例如參與疾病或病癥的靶底物)具有預(yù)定底物特異性和/或活性的蛋白酶裂解。所述方法可進(jìn)一步包括篩選所述復(fù)合物對(duì)于耙底物的裂解序列的底物特異性。在這種實(shí)例中，被鑒別或選擇的蛋白酶對(duì)于靶底物具有改變的活性和/或特異性。在一個(gè)實(shí)例中，所述穩(wěn)定復(fù)合物是通過被選擇的蛋白酶與蛋白酶捕獲多肽的共價(jià)連接而形成的。所述被選擇的蛋白酶或其催化活性部分是從本發(fā)明方法提供的復(fù)合物中鑒別或選擇的。本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括從集合中未復(fù)合的蛋白酶成員中分離復(fù)合的蛋白酶的步驟。在一個(gè)實(shí)例中，對(duì)所述蛋白酶捕獲多肽進(jìn)行標(biāo)記以進(jìn)行檢測(cè)和分離，所述分離是通過捕獲含有可檢測(cè)的蛋白酶捕獲多肽和所述蛋白酶或其催化活性部分的復(fù)合物而實(shí)現(xiàn)。捕獲可以是在懸24浮液、溶液或者固體支持物上實(shí)現(xiàn)。在固體支持物的捕獲情況中，使所述蛋白酶捕獲多肽附著于所述固體支持物，這可以在所述蛋白酶捕獲多肽與所述蛋白酶或其催化活性部分集合進(jìn)行接觸之前、期間或隨后進(jìn)行。所述固體支持物可包括例如96孔平板的孔。在一些實(shí)例中，用生物素標(biāo)記所述蛋白酶捕獲多肽。在其它實(shí)例中，可以用His標(biāo)記對(duì)所述蛋白酶捕獲多肽進(jìn)行標(biāo)記，所述分離可以通過用金屬螯合劑例如但非限于硫酸鎳(NiS04)、氯化鈷(CoCl2)、硫酸銅(CuS04)和氯化鋅(ZnCl2)進(jìn)行捕獲而實(shí)現(xiàn)。所述金屬螯合劑可以與固體支持物綴合，例如與珠如瓊脂糖珠或磁珠綴合。在本發(fā)明提供的方法中，所述方法可進(jìn)一步包括擴(kuò)增分離的復(fù)合物中的蛋白酶或其催化活性部分的步驟。在一些實(shí)例中，分離的復(fù)合物中的蛋白酶或其催化活性部分在噬菌體上展示，擴(kuò)增是通過用所述噬菌體感染宿主細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。所述宿主細(xì)胞可包括細(xì)菌，例如大腸桿菌(E.coli)?？梢院Y選從細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)菌周質(zhì)、噬菌體上清或者純化的蛋白質(zhì)中擴(kuò)增的蛋白酶的靶底物特異性和/或活性。典型地，所述靶底物是疾病或病癥病因?qū)W中涉及的多肽或裂解序列。本發(fā)明還提供了多重方法，其中將蛋白酶集合與多種不同的蛋白酶捕獲多肽(包括其修飾的形式)接觸，對(duì)每個(gè)蛋白酶捕獲多肽均進(jìn)行標(biāo)記，由此其可以被可鑒別地檢測(cè)。在這種方法中，至少兩個(gè)蛋白酶捕獲多肽被可鑒別地標(biāo)記，由此可以形成一個(gè)以上的穩(wěn)定復(fù)合物及鑒別一種以上的蛋白酶。在本發(fā)明提供的方法中，所述方法還包括多輪篩選以優(yōu)化蛋白酶選擇，其中在本發(fā)明篩選方法的第一輪中鑒別或選擇蛋白酶之后對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，從而產(chǎn)生蛋白酶或其催化活性部分的第二個(gè)集合。將所述第二個(gè)蛋白酶集合與蛋白質(zhì)捕獲多肽接觸產(chǎn)生第二組穩(wěn)定復(fù)合物，所述蛋白質(zhì)捕獲多肽與第一種蛋白酶捕獲多肽相同或不同。鑒別或選擇第二組穩(wěn)定復(fù)合物中的蛋白酶。在本發(fā)明提供的方法中，所述蛋白酶捕獲多肽是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，a巨球蛋白家族的成員，或者p35家族的成員。本發(fā)明提供的方法中使用的這種多肽分子通過蛋白酶或其催化活性部分與蛋白酶捕獲多肽的共價(jià)連接而形成復(fù)合物。在本發(fā)明提供的方法的一方面，鑒別了具有希望的底物特異性的蛋白25酶，通過將蛋白酶和/或蛋白酶的蛋白酶解活性部分的集合與蛋白酶捕獲多肽接觸，在所述蛋白酶捕獲多肽裂解時(shí)形成蛋白酶捕獲多肽與蛋白酶的穩(wěn)定復(fù)合物。選擇蛋白酶捕獲多肽或其修飾形式用于所述方法中，以由具有希望的底物特異性的蛋白酶裂解。在所述方法中，鑒別了所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分，以選擇具有希望的底物特異性的蛋白酶。本發(fā)明提供的方法中使用的蛋白酶集合是蛋白酶或其催化活性部分的任何集合，包括至少、大約或者等于5、10、50、100、103、104、105、106或更多個(gè)成員。在一些情況中，所述蛋白酶是絲氨酸和/或半胱氨酸蛋白酶。在本發(fā)明提供的方法中，蛋白酶或其催化活性部分的集合被展示以與蛋白酶捕獲多肽接觸。在一個(gè)實(shí)例中，所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分被展示在固體支持物、細(xì)胞表面或者微生物表面上。所述蛋白酶可以被展示在酵母、細(xì)菌、病毒、噬菌體、核酸、mRNA分子或者核糖體上。在蛋白酶或其蛋白酶解活性部分被展示在微生物上的情況中，所述微生物包括但非限于大腸桿菌、釀酒酵母(S.cerevisiae)，或者病毒如M13、fd或T7噬菌體或者桿狀病毒。在本發(fā)明提供的方法中，蛋白酶或其蛋白酶解活性部分被展示在噬菌體展示文庫(kù)上，所述蛋白酶集合是蛋白酶噬菌體展示文庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶例如通過被展示為全長(zhǎng)蛋白酶的蛋白酶解活性部分而提供在所述集合中。在一些實(shí)例中，蛋白酶集合與蛋白酶捕獲多肽的接觸是在同質(zhì)混合物中進(jìn)行。本發(fā)明提供了蛋白酶選擇方法，其中將至少兩種不同的蛋白酶捕獲多肽與所述集合接觸，但是只有一種蛋白酶捕獲多肽是可檢測(cè)地標(biāo)記的。所述可檢測(cè)地標(biāo)記的蛋白酶捕獲多肽可以捕獲含有所述可檢測(cè)的蛋白酶捕獲多肽和蛋白酶或其催化活性部分的穩(wěn)定復(fù)合物。在這種方法的一些實(shí)例中，在反應(yīng)中存在與可檢測(cè)地標(biāo)記的蛋白酶捕獲多肽相比過量存在的一或多種未被可檢測(cè)地標(biāo)記的其它蛋白酶捕獲多肽。在所述方法中，所述標(biāo)記是可以檢測(cè)的任何標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記或者表位標(biāo)記，如His標(biāo)記。在其它實(shí)例中，所述可檢測(cè)的標(biāo)記是生物素。本發(fā)明方法中進(jìn)行選擇的蛋白酶的集合包括蛋白酶的任何集合。在一些實(shí)例中，所述蛋白酶是絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶。所述蛋白酶集合包括是絲氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶及枯草桿菌蛋白酶家族成員或者來(lái)自半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶家族的胱天蛋白酶。所述蛋白酶包括任何蛋白酶或其催化活性部分，如表7示出。在一些實(shí)例中，所述蛋白酶或其催化活性部分是尿激酶纖溶酶原激活物(u-PA)蛋白酶、組織纖溶酶原激活物(t-PA)蛋白酶或者M(jìn)T-SP1蛋白酶。一方面，本發(fā)明方法中使用的蛋白酶捕獲多肽是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、p35家族成員、oc-巨球蛋白家族成員，或者其任何修飾形式。本發(fā)明方法中使用的蛋白酶捕獲多肽包括但非限于纖溶酶原抑制劑-l(PAI-l)、抗凝血酶(AT3)或者a2-巨球蛋白，或者其修飾形式。本發(fā)明方法中使用的蛋白酶捕獲多肽的修飾形式包括在所述蛋白酶捕獲多肽的反應(yīng)位點(diǎn)含有氨基酸置換、缺失或者取代的那些修飾形式。在一些實(shí)例中，所述修飾是相應(yīng)于靶底物的裂解序列的任一或多個(gè)氨基酸置換。所述靶底物可以是疾病或病癥病因?qū)W中涉及的任何蛋白質(zhì)。靶底物的例子包括但非限于VEGFR、t-PA裂解序列，或者補(bǔ)體蛋白。例如，靶底物包括但非限于VEGFR2或者補(bǔ)體蛋白C2。靶底物的裂解序列包括但非限于SEQIDNO:389、479和498所示的任何序列。在一些情況中，所述蛋白酶捕獲多肽是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，且所述一或多個(gè)氨基酸置換是位于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)中。所述反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)(reactivesiteloop,RSL)中的一或多個(gè)置換包括在P4-P2，任一或多個(gè)位置中的那些置換。本發(fā)明的方法中使用的這種絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的例子是SEQIDNO:497、499、610和611所示的任何序列。在另一實(shí)例中，所述蛋白酶捕獲多肽是a2巨球蛋白且所述一或多個(gè)氨基酸置換位于所述多肽的誘餌區(qū)。在本發(fā)明方法中針對(duì)修飾的蛋白酶捕獲多肽被鑒別或選擇的蛋白酶可以根據(jù)與非靶底物相比對(duì)于靶底物的改變的底物特異性進(jìn)行篩選或選擇。在這些實(shí)例中，所述非靶底物包括相應(yīng)的模板蛋白酶的底物。典型地，被鑒別或選擇的蛋白酶的底物特異性增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更多倍。本發(fā)明提供的方法包括鑒別和/或選擇具有希望的底物特異性的蛋白酶的方法被重復(fù)或者進(jìn)行多次的重復(fù)方法。在這種方法中，在所述方法的第一次重復(fù)或者第一輪中可以鑒別多種不同的蛋白酶。在其它實(shí)例中，在第一次重復(fù)后基于在第一輪重復(fù)中選擇的被鑒別的蛋白酶產(chǎn)生和制備多種蛋27白酶。此外，在一些實(shí)例中，將在第一輪或重復(fù)和/或在連續(xù)輪中鑒別的被選擇的蛋白酶的氨基酸序列進(jìn)行比較，以鑒別熱點(diǎn)。熱點(diǎn)是在多輪中被認(rèn)為是修飾的基因座的那些位置，如與野生型或模板蛋白酶相比在所述方法使用的修飾的蛋白酶集合中至少2、3、4、5或更多種被鑒別的蛋白酶中出現(xiàn)的那些位置。本發(fā)明方法中還提供了在鑒別蛋白酶之后制備第二個(gè)蛋白酶集合的步驟，其中鑒別的蛋白酶用作模板以在蛋白酶序列或其催化活性部分中產(chǎn)生進(jìn)一步的突變，由此所述第二個(gè)集合的成員(基于)含有具有鑒別的蛋白酶的突變及其它突變的多肽；然后將所述第二個(gè)集合與用于分離第一種蛋白酶的蛋白酶捕獲劑(proteasetrap)相同或不同的蛋白酶捕獲多肽接觸，其中所述蛋白酶捕獲劑經(jīng)修飾以被具有希望的底物特異性的蛋白酶裂解；從復(fù)合物集合中鑒別蛋白酶或其蛋白酶解活性部分，由此鑒別的蛋白酶與第一種鑒別的蛋白酶相比對(duì)于希望的底物具有較高的活性或特異性。所述第二個(gè)集合與鑒別的模板蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的氨基酸序列相比可以含有隨機(jī)或聚焦突變(focusedmutation)。聚焦突變包括例如熱點(diǎn)位置，如在絲氨酸蛋白酶如u-PA中基于胰凝乳蛋白酶編號(hào)的第30、73、89和155位。在實(shí)施本發(fā)明的方法中，形成穩(wěn)定復(fù)合物的反應(yīng)可以通過控制一或多個(gè)參數(shù)而調(diào)節(jié)。這種參數(shù)是改變反應(yīng)速率或程度或者反應(yīng)效率的任何參數(shù)，例如但非限于反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH、離子強(qiáng)度、文庫(kù)濃度和蛋白酶捕獲多肽濃度。反應(yīng)可以在存在反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)劑的條件下在蛋白酶捕獲多肽與蛋白酶或其蛋白酶解活性部分之間進(jìn)行，從而增強(qiáng)鑒別的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的選擇性。所述競(jìng)爭(zhēng)劑包括例如血清或血漿。如人血清或人血漿，細(xì)胞或組織提取物，生物學(xué)流體如尿液或血液，純化或部分純化的野生型形式(或者其它修飾形式)蛋白酶捕獲劑。這種競(jìng)爭(zhēng)劑的例子是純化或部分純化的蛋白酶捕獲多肽的野生型形式或者蛋白酶捕獲多肽的一或多種特異性變體。本發(fā)明提供了進(jìn)化或者選擇或者鑒別對(duì)于至少兩種裂解序列具有特異性/選擇性和/或活性的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的重復(fù)方法。所述方法包括如下步驟a)將蛋白酶和/或其蛋白酶解活性部分的集合與第一種蛋白酶捕獲多肽接觸，在所述蛋白酶捕獲多肽被所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分裂解時(shí)形成含有蛋白酶捕獲多肽與所述集合中的蛋白酶或其催化活性部分的穩(wěn)定復(fù)合物，其中所述接觸是在存在競(jìng)爭(zhēng)劑的條件下進(jìn)行；b)鑒別或者選擇與第一種蛋白酶捕獲多肽形成復(fù)合物的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分；c)將與第一種蛋白酶捕獲多肽形成復(fù)合物的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分與第二種蛋白酶捕獲多肽在存在競(jìng)爭(zhēng)劑的條件下接觸；及d)鑒別或者選擇與第一種蛋白酶捕獲多肽形成復(fù)合物的蛋白酶或其蛋白酶解活性成分。所述兩個(gè)裂解序列可以在一個(gè)靶底物中或者可以在兩個(gè)不同的耙底物中。所述鑒別的、選擇的或者進(jìn)化的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分對(duì)于一或兩個(gè)不同耙底物中的至少兩個(gè)不同裂解序列具有底物特異性和/或裂解活性。所述第一種和第二種蛋白酶捕獲多肽可以相同或不同。典型地，本發(fā)明方法中使用的第一種和第二種蛋白酶捕獲多肽是不同的，且均被修飾為由對(duì)于不同靶底物具有預(yù)定底物特異性的蛋白酶裂解。所述方法可進(jìn)一步包括重復(fù)至少一次步驟a)和b)或者a)-d)，直至對(duì)于至少兩個(gè)識(shí)別序列具有希望的或者預(yù)定的底物特異性和裂解活性的蛋白酶被分離。底物特異性和裂解活性與模板蛋白酶相比典型地增加。所述方法中使用的競(jìng)爭(zhēng)劑包括所述蛋白酶捕獲多肽可以與其相互作用的任何物質(zhì)，其典型地具有比靶蛋白酶低的穩(wěn)定性。競(jìng)爭(zhēng)劑包括但非限于血清、血漿、人血清或人血槳、細(xì)胞或組織提取物、生物學(xué)流體如尿液或血液、純化或部分純化的蛋白酶捕獲劑的野生型形式及蛋白酶捕獲多肽的一或多種特異變體。本發(fā)明還提供了蛋白酶選擇方法，包括如下步驟a)將蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的集合與第一種蛋白酶捕獲多肽接觸，在所述蛋白酶捕獲多肽裂解時(shí)，所述蛋白酶捕獲多肽與所述集合中的任何蛋白酶或其催化活性部分形成共價(jià)復(fù)合物；b)從未復(fù)合的蛋白酶捕獲多肽中分離復(fù)合的蛋白酶；c)分離或者選擇或者鑒別復(fù)合的蛋白酶；d)基于被選擇的蛋白酶產(chǎn)生蛋白酶或其蛋白酶解活性成分的第二個(gè)集合；及e)重復(fù)步驟a)-c)，將蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的第二個(gè)集合與第二種蛋白酶捕獲多肽(與第一種蛋白酶捕獲多肽不同)接觸形成復(fù)合物；分離所述復(fù)合物；以及分離、選擇或者鑒別復(fù)合的蛋白酶。所述第一種和第二種蛋白酶捕獲多肽可以被修飾為含有29兩個(gè)不同的靶底物識(shí)別序列，從而被鑒別的或者選擇的蛋白酶對(duì)于至少兩個(gè)識(shí)別序列具有特異性和高度裂解活性。這些方法可以重復(fù)多次。在這些方法中，可以將所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的集合與所述第一種和/或第二種蛋白酶捕獲多肽在存在競(jìng)爭(zhēng)劑(見上述)的條件下接觸。在本發(fā)明提供的任何蛋白酶選擇方法中，所述集合可含有修飾的蛋白酶。所述蛋白酶中的修飾可以是隨機(jī)或定向修飾或者在多肽的靶區(qū)域中的修飾。本發(fā)明還提供了含有蛋白酶和/或其蛋白酶解活性部分及至少一種蛋白酶捕獲多肽的組合。所述成分可以是單獨(dú)提供或者是以混合物提供。所述蛋白酶捕獲多肽包括絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、p35家族成員、oc-巨球蛋白家族成員，其修飾的形式及混合物。蛋白酶和/或其催化活性部分的集合可以是以溶液或者懸浮液或者固相形式提供，或者另外展示在例如固體支持物(基質(zhì)材料)上或者于展示文庫(kù)中，例如但非限于噬菌體展示文庫(kù)，其中文庫(kù)成員展示至少蛋白酶的蛋白酶解活性部分。本發(fā)明提供了含有所述組合的試劑盒。典型地，所述試劑盒含有包裝的成分，及任選其它試劑和進(jìn)行所述方法的說明書。本發(fā)明還提供了通過修飾選自第30、73、89和155位(基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))的一或多個(gè)殘基而修飾絲氨酸蛋白酶如u-PA的底物特異性的方法。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法鑒別的修飾的蛋白酶。所述修飾的蛋白酶由于鑒別的修飾而呈現(xiàn)改變的底物特異性和/或活性。使用所述選擇方法鑒別的任何修飾可以在野生型蛋白酶、其任何等位基因或物種變體或者在所述蛋白酶的任何其它變體中產(chǎn)生。另外，本發(fā)明還提供了含有與野生型蛋白酶或其等位基因或物種變體具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列相同性的修飾的蛋白酶，只要本文所述方法中鑒別的修飾存在即可。這種蛋白酶是修飾的蛋白酶，包括胰凝乳蛋白酶家族中修飾的絲氨酸蛋白酶，如在選自第30、73、89和155位(基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))的熱點(diǎn)位置中含有一或多個(gè)突變的尿纖溶酶原激活物(u-PA)多肽或者其催化活性片段，其中底物特異性被改變。30本發(fā)明還提供了在本發(fā)明的方法中鑒別的修飾的尿纖溶酶原激活物(U-PA)蛋白酶，其呈現(xiàn)對(duì)于疾病或病癥的病因?qū)W中涉及的靶底物的增加的特異性和/或活性。這種靶底物包括但非限于VEGFR或者組織纖溶酶原激活物(t-PA)底物。因此，本發(fā)明還提供了裂解t-PA底物的修飾的絲氨酸蛋白酶或者其催化活性部分。特別地，這種蛋白酶是修飾的尿纖溶酶原激活物(u-PA)多肽，其中所述u-PA多肽或其催化活性部分在選自第21、24、30、39、61(A)、80、82、84、89、92、156、158、159和187位(基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))的位置含有一或多個(gè)修飾。本發(fā)明還提供了這種修飾的u-PA多肽或其催化活性部分，其含有選自F21V、124L、F30V、F30L、T39A、Y61(A)H、E80G、E82E、E84K、189V、K92E、K156T、T158A、V159A和K187E的一或多個(gè)突變。本發(fā)明還提供了這些修飾的u-PA多肽，其中u-PA多肽或其催化活性部分含有兩或多個(gè)突變，所述突變選自F30V/Y61(a)H、F30V/K82E、F30V/K156T、F30V/K82E/V159A、F30V/K82E/T39A/V159A、F30V/K82E/T158A/V159A、F30V/Y61(a)H/K92E、F30V/K82E/V159A/E80G/I89V/K187E及F30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V\K187E。本發(fā)明還提供了裂解VEGFR、特別是裂解VEGFR-2的修飾的絲氨酸蛋白酶或其催化活性部分。特別地，本發(fā)明提供了修飾的尿纖溶酶原激活物(u-PA)多肽及其催化活性部分，其中所述u-PA多肽或其催化活性部分在選自第38、72、73、75、132、133、137、138、155、160和217位的位置(基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))含有一或多個(gè)修飾，從而改變對(duì)于VEGFR-2或其序列的底物特異性。本發(fā)明還提供了這樣的多肽，其含有選自V38D、R72G、L73A、L73P、S75P、F132L、G133D、E137G、1138T、L155P、L155V、L155M、V160A和R217C的一或多個(gè)突變。這些多肽可進(jìn)一步包括在第30和/或89位(基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))的修飾，如選自F30I、F30T、F30L、F30V、F30G、F30M和I89V的修飾。本發(fā)明還提供了含有一或多個(gè)突變及在一些情況中含有兩或多個(gè)突變的這些u-PA多肽或其催化活性部分，所述突變選自L73A/I89V、L73P、R217C、L155P、S75P/I89V/I138T、E137G、R72G/L155P、G133D、V160A、V38D、F132L/V160A、L73A/I89V/F30T、L73A/I89V/F30L、L73A/I89V/F30V、L73A/I89曹30G、L73A/I89V/L155V、31L73A/I89V/F30M、L73A/I89V/L155M、L73A/I89V/F30L/L155M和L73A/I89V/F30G/L155M。本發(fā)明還提供了修飾的u-PA多肽，其中所述u-PA多肽或其催化活性部分含有選自F301、F30T、F30G和F30M的一或多個(gè)突變。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明方法鑒別的修飾的MT-SP1多肽。這種修飾的多肽包括具有選自如下的一或多個(gè)氨基酸修飾的SEQIDNO:253所示MT畫SP1多肽D23E、I41F、141T、L52M、Y60(g)s、T56K、H71R、F93L、簡(jiǎn)K、F97Y、F97L、T98P、F99L、A126T、V129D、P131S、1136T、1136V、H143R、T144I、H54V、畫4D、T166A、L171F、P173S、F184(a)L、Q192H、S20U、Q209L、Q221(a)L、R230W、F234L和V244G(基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))。在一些實(shí)例中，所述修飾是在具有SEQIDNO:505所示氨基酸序列的MT-SP1的催化活性部分中。在其它實(shí)例中，所述修飾是在MT-SP1多肽中進(jìn)一步包含相應(yīng)于SEQIDNO:253所示MT-SP1多肽中C122S修飾的修飾(基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))，例如SEQIDNO:507或517所示MT-SPl。本發(fā)明特別提供的修飾是選自I41F、F97Y、L171F和V244G的任何修飾。本發(fā)明提供的修飾的MT-SP1多肽可進(jìn)一步包括相應(yīng)于SEQIDNO:253所示MT-SP1多肽中Q175R或D217V的一或多個(gè)修飾。這種修飾包括選自如下的任何修飾I136T/N164D/T166A/F184(A)L/D217V、I41F、I41F/A126T/V244G、D23E/I41F/T98P/T144I、I41F/L171F/V244G、H143R/Q175R、I41F/L171F、R230W、I41F/I154V/V244G、I141F/L52M/V129D/Q221(A)L、F99L、F97Y/I136V/Q192H/S201I、H71R/P131S/D217V、D217V、T65K7F93L/F97Y/D217V、I41T/P173S/Q209L、F97L/F234L、Q175R、N95K和Y60(G)S。任何上述修飾的MT-SP1多肽呈現(xiàn)增加對(duì)于C2補(bǔ)體蛋白的特異性或者對(duì)于C2補(bǔ)體蛋白的活性或者這二者的修飾。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其含有修飾的蛋白酶，包括修飾的絲氨酸蛋白酶如修飾的u-PA多肽或者修飾的MT-SPl多肽。所述藥物組合物含有藥物可接受的賦形劑，可以根據(jù)任何合適的給藥途徑而加以配制，所述給藥途徑包括但非限于系統(tǒng)、口月艮、經(jīng)鼻、肺部、局部(local)及表面(topical)給藥途徑。本發(fā)明還提供了試劑盒，所述試劑盒含有任何所述藥物組合物、給予所述組合物的裝置及任選包含給藥說明書。本發(fā)明提供了編碼修飾的蛋白酶、包括u-PA蛋白酶和MT-SPl蛋白酶及其催化活性部分的核酸分子。本發(fā)明還提供了含有所述核酸分子的載體及含有所述核酸分子或載體的細(xì)胞。本發(fā)明提供了治療患有疾病或病癥的對(duì)象的方法，所述疾病或病癥例如但非限于是動(dòng)脈血栓形成、靜脈血栓形成和血栓栓塞、缺血性腦中風(fēng)、后天凝血障礙、彌散性血管內(nèi)凝血、細(xì)菌感染和牙周炎及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其通過給予t-PA治療，通過給予含有修飾的u-PA蛋白酶或其蛋白酶解部分或者編碼核酸分子或者細(xì)胞的藥物組合物而進(jìn)行。所述方法通過給予對(duì)象核酸分子、細(xì)胞或者藥物組合物而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還提供了治療患有由VEGFR、特別是VEGFR-2介導(dǎo)的疾病或病癥的對(duì)象的方法。這種疾病和病癥包括但非限于癌癥、血管生成相關(guān)疾病、眼病如黃斑變性、炎癥疾病和糖尿病，特別是糖尿病并發(fā)癥如糖尿病視網(wǎng)膜病變。所述方法通過給予含有或者編碼修飾的u-PA蛋白酶的核酸分子或者細(xì)胞或者組合物實(shí)現(xiàn)，所述修飾的蛋白酶與未修飾的形式相比呈現(xiàn)對(duì)于VEGFR-2的底物特異性，特別是增加的底物特異性。所述方法任選包括給予治療所述疾病或病癥的另一種藥物，例如在所述疾病是癌癥時(shí)給予抗腫瘤藥物。本發(fā)明還提供了治療患有由補(bǔ)體蛋白、特別是C2介導(dǎo)的疾病或病癥的對(duì)象的方法。這種疾病或病癥包括但非限于敗血癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、膜增生性腎小球腎炎(MPGN)、多發(fā)性硬化(MS)、重癥肌無(wú)力(MG)、哮喘、炎癥性腸病、免疫復(fù)合物(IC)介導(dǎo)的急性炎癥性組織損傷、阿爾茨海默病(AD)、缺血-再灌注損傷，及Guillan-Barre綜合征。在一些實(shí)例中，所述缺血-再灌注損傷是由于例如但非限于心肌梗塞(MI)、中風(fēng)、血管成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)(CPB)和血液透析等事件或治療而導(dǎo)致的。所述方法是給予含有或編碼修飾的MT-SP1蛋白酶的核酸分子或者細(xì)胞或者組合物實(shí)現(xiàn)的，所述修飾的蛋白酶與未修飾的形式相比呈現(xiàn)對(duì)于C2的底物特異性，特別是增加的底物特異性。在其它實(shí)例中，所述疾病或病癥由對(duì)對(duì)象進(jìn)行的治療導(dǎo)致。例如，所述治療可以導(dǎo)致補(bǔ)體介導(dǎo)的缺血-再灌注損傷。這種治療包括但非限于血管成形術(shù)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)。在這些33實(shí)例中，在對(duì)對(duì)象進(jìn)行治療之前給予修飾的MT-SP1蛋白酶。所述修飾的MT-SP1多肽可以通過在體外、離體或者在體內(nèi)與體液或者組織樣品接觸而給予。本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的方法中使用的修飾的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。這種修飾的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽在其反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)中相應(yīng)于第P4-P2'位的位置用靶底物的裂解序列修飾。典型地，所述靶底物參與疾病或病癥的病因?qū)W。這種耙底物包括但非限于VEGFR、補(bǔ)體蛋白或者t-PA底物。例如，靶底物包括VEGFR2和補(bǔ)體蛋白C2。本發(fā)明提供的修飾的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的例子是修飾的纖溶酶原激活物抑制劑-l(PAI-l)和抗凝血酶-3(AT3)。修飾的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白例如SEQIDNO:497、499、610和611所示。附圖簡(jiǎn)述圖1描述了絲氨酸蛋白酶抑制蛋白對(duì)蛋白酶的抑制機(jī)制及穩(wěn)定的抑制復(fù)合物的產(chǎn)生。在接觸之后，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(I)和蛋白酶(E)最初形成非共價(jià)的Michaelis樣復(fù)合物(EI)。隨后是P1-P1'易斷裂鍵的裂解及蛋白酶的催化性絲氨酸對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)(RSL)羰基的親核攻擊以及共價(jià)的?；?酶中間體(Ef)的形成。動(dòng)態(tài)捕獲的共價(jià)抑制產(chǎn)物(EI+)是RSL插入、蛋白酶移位、蛋白酶活性位點(diǎn)變形及整體蛋白酶結(jié)構(gòu)變形的結(jié)果。次要的非抑制途徑釋放正常的裂解產(chǎn)物絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(I"和反應(yīng)性蛋白酶(E)。詳細(xì)描述概要A.定義B.篩選蛋白酶的方法C.蛋白酶捕獲多肽1.絲氨酸蛋白酶抑制蛋白結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)2.蛋白酶催化、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的抑制機(jī)制及酰基酶中間體的形成a.絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的例子i.PAI-1ii.抗凝血酶(AT3)3.其它蛋白酶捕獲多肽a.p35b.a巨球蛋白(aM)4.蛋白酶捕獲多肽競(jìng)爭(zhēng)劑5.蛋白酶捕獲多肽變體D.蛋白酶l.候選蛋白酶a.蛋白酶的類別i.絲氨酸蛋白酶(a)尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)(b)組織纖溶酶原激活物(t-PA)(c)MT-SPlii.半胱氨酸蛋白酶E.進(jìn)行篩選的修飾的蛋白酶和集合1.變體蛋白酶的產(chǎn)生a.隨機(jī)誘變b.聚焦誘變(FocusedMutagenesis)2.變體蛋白酶的嵌合形式3.組合文庫(kù)及其它文庫(kù)a.噬菌體展示文庫(kù)b.細(xì)胞表面展示文庫(kù)c.其它展示文庫(kù)F.接觸、分離和鑒別選擇的蛋白酶的方法1.重復(fù)篩選2.選擇的蛋白酶的例子G.評(píng)定蛋白酶活性和特異性的方法H.產(chǎn)生編碼蛋白酶捕獲多肽(即絲氨酸蛋白酶抑制蛋白)或其變體或者蛋白酶/修飾的蛋白酶的核酸的方法l.載體和細(xì)胞2表達(dá)a.原核細(xì)胞b.酵母細(xì)胞c.昆蟲細(xì)胞d.哺乳動(dòng)物細(xì)胞e.植物3.純化技術(shù)4.融合蛋白5.核苷酸序列I.選擇的蛋白酶多肽的制備、配制和給予1.組合物與輸送2.選擇的蛋白酶的體內(nèi)表達(dá)與基因治療a.核酸的輸送i.載體-附加型載體與整合載體ii.人工染色體及其它非病毒載體輸送方法iii.含有核酸的細(xì)胞的脂質(zhì)體及其它膠囊形式和給予b.體外及離體輸送c.全身、局部和表面輸送3.組合治療4.產(chǎn)品和試劑盒的物品J.使用選擇的蛋白酶多肽的治療方法實(shí)例l.裂解tPA耙位的選擇的uPA多肽的治療方法實(shí)例a.血栓形成性疾病和病癥i.動(dòng)脈血栓形成ii.靜脈血栓形成和血栓栓塞(a)缺血性腦中風(fēng)iii.后天凝血障礙(a)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)(b)細(xì)菌感染和牙周炎b.其它tPA耙位相關(guān)病癥36C.診斷方法2.裂解VEGF或VEGFR靶位的選擇的蛋白酶多肽的治療方法實(shí)例a.血管生成、癌癥及其它細(xì)胞周期依賴性疾病或病癥b.使用裂解VEGF或VEGFR的選擇的蛋白酶的組合治療3.裂解補(bǔ)體蛋白靶位的選擇的MT-SP1多肽的治療方法實(shí)例a.免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病b.神經(jīng)退行性疾病c.心血管疾病K.實(shí)施例A.定義除非特別指出，本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的相同含義。除非特別指出，本文中所列舉的所有專利、專利申請(qǐng)、公布的申請(qǐng)和出版物、Genbank序列、數(shù)據(jù)庫(kù)、網(wǎng)站及其它公布的材料均以其全部?jī)?nèi)容并入作參考。當(dāng)本文的術(shù)語(yǔ)有多種定義時(shí)，本章中的定義起決定作用。當(dāng)參考URL或其它這種標(biāo)識(shí)符或地址時(shí)，應(yīng)理解這種標(biāo)識(shí)符可以改變并且互聯(lián)網(wǎng)上的特定信息可以來(lái)來(lái)去去，但是通過檢索互聯(lián)網(wǎng)可以發(fā)現(xiàn)等價(jià)信息。其中的引用表明這種信息的可利用性和公共傳播。如本文所用，"蛋白酶捕獲劑"或者"蛋白酶捕獲多肽"是指由蛋白酶裂解的底物，且在裂解時(shí)與所述蛋白酶形成穩(wěn)定復(fù)合物，從而隨著所述蛋白酶經(jīng)歷實(shí)際的過渡狀態(tài)形成酶復(fù)合物而捕獲所述蛋白酶，從而抑制蛋白酶的活性并捕獲它。因此，蛋白酶捕獲劑是蛋白酶的抑制劑。蛋白酶捕獲劑是多肽或分子，其包括由蛋白酶裂解的氨基酸殘基，由此當(dāng)裂解時(shí)形成穩(wěn)定復(fù)合物。所述復(fù)合物足夠穩(wěn)定，可以允許從未反應(yīng)的捕獲劑或者從與所述蛋白酶較不穩(wěn)定地相互作用的捕獲劑中分離所述復(fù)合物。蛋白酶捕獲劑包括被所述蛋白酶裂解的合成的、修飾的或者天然發(fā)生的任何分子，當(dāng)裂解時(shí)與所述蛋白酶形成復(fù)合物，使得可以從未反應(yīng)的捕獲劑中分離出反應(yīng)的蛋白酶或復(fù)合物。這種蛋白酶捕獲劑的例子是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，修飾的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，呈現(xiàn)與絲氨酸蛋白酶抑制蛋白相似機(jī)制的分子，例如p35，及由蛋白酶裂解并且捕獲蛋白酶形成穩(wěn)定復(fù)合物的任何其它分子，例如0t2巨球蛋白。蛋白酶捕獲劑還包括合成的多肽，其由蛋白酶(或其蛋白酶解活性部分)裂解，當(dāng)裂解時(shí)與所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分形成穩(wěn)定復(fù)合物。如本文所用，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白是指抑制蛋白酶的一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，當(dāng)其反應(yīng)位點(diǎn)由蛋白酶裂解時(shí)導(dǎo)致穩(wěn)定的?；?酶中間體形成及穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物中的蛋白酶的捕獲。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白包括等位基因和物種變體及其它變體，只要所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子通過形成穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物而抑制蛋白酶。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白還包括全長(zhǎng)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的截短或連續(xù)的氨基酸片段，其最低限度包括至少足夠的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)(RSL)部分，以促進(jìn)蛋白酶抑制及與所述蛋白酶的穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物的形成。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的實(shí)例在表2中列出和/或具有SEQIDNO:l-38任一所示的氨基酸序列、其等位基因變體或者截短部分。如本文所用，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的"突變體"或者"變體"是指含有氨基酸修飾的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，特別是在絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)中含有修飾。所述修飾可以是在相應(yīng)于1^15-14-13....4-3-2-1-1，-2，-3，..？11，的位置一或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或者取代。典型地，所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與野生型絲氨酸蛋白酶抑制蛋白相比在反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)中的l、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多個(gè)氨基酸位置上含有氨基酸置換。最通常地，所述置換是在相應(yīng)于P4-P2'位置的一或多個(gè)氨基酸上。例如，SEQIDNO:ll所示的PAI-l絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，相應(yīng)于SEQIDNO:11第366-370氨基酸位置的P4-P1'位置(VSARM)可以被修飾。實(shí)施例1描述了VSARM氨基酸殘基被修飾為RRVRM或PFGRS。如本文所用，"易斷裂的鍵"是指被蛋白酶裂解的多肽中的鍵，表示在底物的裂解序列中P1-P1'位置之間形成的鍵。如本文所用，反應(yīng)位點(diǎn)是指由蛋白酶裂解的那部分靶底物序列。典型地，反應(yīng)位點(diǎn)包括P1-P1'易斷裂鍵序列。如本文所用，反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)(RSL，也稱作反應(yīng)中心環(huán)RCL)是指絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子中的氨基酸序列(典型為17-22個(gè)連續(xù)氨基酸)，其作為蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)且通常含有唯一的或者主要的蛋白酶特異性決定簇。RSL序列的裂解及其構(gòu)象變化是穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子對(duì)蛋白酶的捕獲的結(jié)果。對(duì)于本發(fā)明之目的，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL環(huán)中的任一或多個(gè)氨基酸均可以被修飾為相應(yīng)于希望的耙蛋白的裂解序列。這種修飾的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白或其含有變體RSL序列的部分可以用于選擇具有改變的底物特異性的蛋白酶。如本文所用，分配(partitioning)是指穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白-蛋白酶復(fù)合物與裂解的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白之間絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分配的過程。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白中的分配的原因與抑制途徑的性質(zhì)有關(guān)，其得自裂解的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)經(jīng)過絲氨酸蛋白酶抑制蛋白表面的大量移位。如果蛋白酶在采取抑制的位置之前有時(shí)間解離(即酶-絲氨酸蛋白酶抑制蛋白復(fù)合物去?；?，則發(fā)生分配。因此，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白-蛋白酶相互作用的結(jié)果依賴于抑制(^)和底物(^)途徑之間的分配比率(如圖1示出)，其由抑制作用的化學(xué)計(jì)量表示(Shl良好的抑制劑的值為l，因?yàn)榇蠖鄶?shù)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子分配為復(fù)合物形成且&/&接近為0。然而如果RSL環(huán)未足夠快速地插入蛋白酶中，則發(fā)生分配且反應(yīng)直接向裂解產(chǎn)物行進(jìn)。如本文所用，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，催化效率或者kcat/km是蛋白酶裂解底物效率的一種測(cè)量方法，是在穩(wěn)定狀態(tài)條件下測(cè)量的。如本文所用，抑制作用的二級(jí)速率常數(shù)是指蛋白酶與抑制劑相互作用的速率常數(shù)。通常蛋白酶與抑制劑如蛋白酶捕獲劑如絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的相互作用是與每種反應(yīng)物、抑制劑和蛋白酶的濃度產(chǎn)物成比例的二級(jí)反應(yīng)。由緊密結(jié)合或者不可逆的抑制劑或者蛋白酶捕獲劑對(duì)于蛋白酶的抑制作用的二級(jí)速率常數(shù)是恒定的，當(dāng)乘以酶濃度和抑制劑濃度時(shí)獲得特定的抑制劑使酶失活的速率。每對(duì)蛋白酶捕獲劑和酶的速率常數(shù)獨(dú)特地反映其相互作用。作為二級(jí)反應(yīng)，二級(jí)速率常數(shù)的提高意味著修飾的被選擇的蛋白酶與抑制劑之間的相互作用比未修飾的蛋白酶與抑制劑之間的相互作用快。因此，二級(jí)速率常數(shù)的變化反映出反應(yīng)成分即蛋白酶和/或抑制劑之間相互作用的變化。當(dāng)篩選蛋白酶時(shí)，二級(jí)速率常數(shù)提高可以反映蛋白酶中希望的選擇修飾。如本文所用，酰基酶中間體是指底物與絲氨酸蛋白酶的催化中心內(nèi)的39必需絲氨酸(典型為Serl95，基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))之間催化反應(yīng)第一步期間形成的共價(jià)中間體。所述反應(yīng)如下進(jìn)行絲氨酸-OH攻擊底物Pl位置的羰基碳，組氨酸的氮接受來(lái)自絲氨酸的-OH的氫，來(lái)自羰基氧的雙鍵的一對(duì)電子移動(dòng)至所述氧原子。這樣導(dǎo)致負(fù)電荷的四面體樣中間體產(chǎn)生。連接底物肽鍵中氮與碳的鍵斷裂。產(chǎn)生這個(gè)鍵的共價(jià)電子移動(dòng)去攻擊組氨酸的氫，從而破壞連接。先前從羰基氧雙鍵移動(dòng)的電子移動(dòng)返回負(fù)電荷氧，再次形成鍵，導(dǎo)致共價(jià)?；钢虚g體形成。所述?；钢虚g體由水水解，導(dǎo)致脫酰作用并且形成裂解的底物和游離的酶。如本文所用，蛋白酶集合是指含有至少10種不同蛋白酶和/或其蛋白酶解活性部分的集合，通常含有至少50、100、500、1000、104、105或更多個(gè)成員。所述集合典型地含有準(zhǔn)備篩選底物特異性的蛋白酶(或其蛋白酶解活性部分)。所述集合中包括天然發(fā)生的蛋白酶(或者其蛋白酶解活性部分)和/或修飾的蛋白酶(或其蛋白酶解活性部分)。所述修飾包括沿著所述蛋白酶長(zhǎng)度的隨機(jī)突變和/或在靶定或選擇區(qū)域中的修飾(即聚焦突變)。所述修飾可以是組合的，且可以包括在特定基因座或者所有基因座或者其亞集的取代所有氨基酸的所有變換。所述集合可包括全長(zhǎng)或者較短的蛋白酶，包括僅蛋白酶結(jié)構(gòu)域。所述蛋白酶可包括任何蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。所述集合及特定集合的大小由用戶確定。在其它實(shí)施方案中，所述集合含有少如2種蛋白酶。如本文所用，"組合集合"或者"組合文庫(kù)"是在其序列中具有與起始模板蛋白酶多肽序列相比獨(dú)特和多樣的氨基酸突變的蛋白酶多肽的集合。集合中表現(xiàn)的突變可以是貫穿多肽序列或者可以位于多肽序列的特定區(qū)域。所述突變可以隨機(jī)產(chǎn)生或者可以基于結(jié)構(gòu)或功能信息根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或者合理地設(shè)計(jì)的靶向突變。如本文所用，"模板蛋白酶"是指具有用于誘變的氨基酸序列的蛋白酶。模板蛋白酶可以是野生型蛋白酶或者其催化活性部分的序列，或者其可以是產(chǎn)生另外突變的變體蛋白酶或者其催化活性部分的序列。例如，在本發(fā)明的選擇方法中鑒別的突變體蛋白酶可以用作起始模板以在隨后輪次的選擇中進(jìn)一步誘變。如本文所用，隨機(jī)突變是指不考慮突變或者對(duì)于突變沒有偏好而在多肽的序列中導(dǎo)入一或多個(gè)氨基酸變化。隨機(jī)誘變可以方便地通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)進(jìn)行，包括例如UV照射、化學(xué)方法及PCR方法(例如易錯(cuò)PCR)。如本文所用，聚焦突變是指在多肽的特定區(qū)域或者特定位置的一或多個(gè)氨基酸改變。例如，可以在蛋白酶的特異性結(jié)合口袋中產(chǎn)生氨基酸的靶向突變。聚焦誘變可以例如使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)通過定點(diǎn)誘變或者多位點(diǎn)定向誘變方法進(jìn)行。如本文所用，蛋白酶捕獲劑與蛋白酶或其蛋白酶解活性部分之間的穩(wěn)定復(fù)合物是指足夠穩(wěn)定的能從與所述蛋白酶捕獲劑未形成復(fù)合物的蛋白酶(即未復(fù)合的蛋白酶)中分離出的復(fù)合物。這種復(fù)合物可以通過任何穩(wěn)定的相互作用包括共價(jià)、離子和疏水性相互作用而形成，但是在反應(yīng)條件下是足夠穩(wěn)定的以保持足夠時(shí)間的復(fù)合以對(duì)復(fù)合物進(jìn)行分離。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與裂解的蛋白酶之間的這種相互作用典型是共價(jià)鍵。如本文所用，"熱點(diǎn)"是在通過蛋白酶選擇獲得的對(duì)于希望的新底物序列呈現(xiàn)改良的活性和/或選擇性的多個(gè)變體中被突變的位置。一或多個(gè)"熱點(diǎn)"可以在蛋白酶選擇期間鑒別。因此，這種位置是蛋白酶的特異性和/或選擇性決定簇，并因此促成底物特異性，也可以在蛋白酶家族如絲氨酸蛋白酶家族或者特定的蛋白酶家族的一個(gè)以上成員中的相應(yīng)基因座(如基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))作為廣泛的特異性和/或選擇性決定簇而發(fā)生。如本文所用，關(guān)于底物特異性的希望的特異性是指對(duì)于預(yù)定的或預(yù)選的或者其它方式靶定的底物的裂解特異性。如本文所用，"選擇"或其語(yǔ)法上的變化用語(yǔ)是指挑選或者選擇與蛋白酶捕獲多肽復(fù)合的蛋白酶。因此，對(duì)于本發(fā)明而言，選擇是指基于蛋白酶在穩(wěn)定的復(fù)合物中與蛋白酶捕獲多肽之間的結(jié)合而選出蛋白酶。通常地，選擇可以通過捕獲共價(jià)復(fù)合物而方便地進(jìn)行，且如果需要時(shí)可以分離所述蛋白酶。例如，選擇可以通過例如用預(yù)定的標(biāo)記、標(biāo)簽或者其它可檢測(cè)的部分標(biāo)記所述蛋白酶捕獲多肽而方便地進(jìn)行，從而基于其在穩(wěn)定復(fù)合物中的結(jié)合而鑒別所述蛋白酶。如本文所用，"鑒別"及其語(yǔ)法上的變化用語(yǔ)是指識(shí)別或者了解穩(wěn)定復(fù)合物中的蛋白酶。典型地，在本發(fā)明的方法中，蛋白酶是通過其在穩(wěn)定復(fù)41合物中與蛋白酶捕獲多肽的結(jié)合而鑒別的，例如通過擴(kuò)增(即在合適的宿主細(xì)胞中生長(zhǎng))復(fù)合物中結(jié)合的蛋白酶及隨后通過DNA測(cè)序進(jìn)行鑒別。如本文所用，為了進(jìn)行檢測(cè)或分離而進(jìn)行的標(biāo)記是指使分子如蛋白酶捕獲多肽與可檢測(cè)的標(biāo)記如熒光團(tuán)或者與標(biāo)簽或者其它部分結(jié)合以進(jìn)行純化或者分離或者分開?？蓹z測(cè)地標(biāo)記是指對(duì)分子如蛋白酶捕獲多肽標(biāo)記以進(jìn)行檢測(cè)或分離。如本文所用，蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的擴(kuò)增是指所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的量增加，如通過分離和克隆及表達(dá)，或者在蛋白酶或其蛋白酶解活性部分在微生物上展示的情況中，將所述微生物導(dǎo)入合適的宿主中并且使其生長(zhǎng)或培養(yǎng)以便產(chǎn)生更多展示的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分。如本文所用，與反應(yīng)混合物均質(zhì)是指所述反應(yīng)物是液相混合物，包括溶液或懸浮液。如本文所用，蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的集合"基于"特定的蛋白酶是指所述集合衍生自特定的蛋白酶，例如通過隨機(jī)或者定向誘變或者合理設(shè)計(jì)或者其它修飾方案產(chǎn)生集合。如本文所用，通過給予t-PA治療的疾病或病癥是指本領(lǐng)域技術(shù)人員給予t-PA進(jìn)行治療的疾病或病癥。這種病癥包括但非限于纖維蛋白溶解病，如動(dòng)脈血栓形成、靜脈血栓形成和血栓栓塞、缺血性中風(fēng)、后天凝血障礙、彌散性血管內(nèi)凝血，及這些病癥的前期狀況，如細(xì)菌或病毒感染、牙周炎及神經(jīng)系統(tǒng)病癥。如本文所用，由VEGFR-2介導(dǎo)的疾病或病癥參與病理學(xué)或病因?qū)W中。這種病癥包括但非限于炎癥和血管生成病癥，例如癌癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變和眼部疾病包括黃斑變性。如本文所用，"蛋白酶"和"肽酶"可互換使用，是指催化共價(jià)肽鍵水解的酶。這些名稱包括酶原形式及其活化的單鏈、雙鏈和多鏈形式。為清楚起見，蛋白酶是指所有形式的蛋白酶。依賴于其活性位點(diǎn)的催化活性和裂解耙底物肽鍵的機(jī)制，蛋白酶包括例如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。如本文所用，酶原是指通過蛋白酶解激活的蛋白酶，包括通過成熟裂解如激活裂解和/或與其它蛋白質(zhì)和/或輔因子形成復(fù)合物而激活。酶原是蛋白酶解酶的無(wú)活性前體。這種前體通常較大，但是非必需比其活性形式大。對(duì)于絲氨酸蛋白酶而言，酶原通過特異性裂解而轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚悦?，包括催化和自身催化裂解，或者通過結(jié)合激活的輔因子，產(chǎn)生活性酶。因此，酶原是酶學(xué)上無(wú)活性形式的蛋白質(zhì)，通過激活物的作用而將其轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍酌附饷浮Ａ呀饪梢酝ㄟ^自身催化而實(shí)現(xiàn)。酶原通常是無(wú)活性的，可以通過催化或者自身催化裂解所述酶原的前區(qū)(proregion)而被轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒旎钚远嚯摹Ｈ绫疚乃茫?前區(qū)"、"前肽"或者"前序列(pros叫uence)"是指被裂解以產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)的區(qū)域或節(jié)段。其可包括通過掩蔽催化機(jī)構(gòu)(catalyticmachinery)及因此防止催化中間體的形成(即通過在空間上封閉底物結(jié)合位點(diǎn))而發(fā)揮抑制酶活性的功能的節(jié)段。前區(qū)是位于成熟的生物活性多肽的氨基末端的氨基酸序列，可以是小如幾個(gè)氨基酸或者可以是多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。如本文所用，激活序列是指酶原中為激活裂解或者成熟裂解以形成活性蛋白酶所需要的部位的氨基酸序列。激活序列的裂解可以自身催化裂解或者通過其激活配體偶催化。激活裂解是一種成熟裂解類型，其中發(fā)生為活性所需的構(gòu)象改變。這是經(jīng)典的激活途徑，例如對(duì)于絲氨酸蛋白酶而言，其中裂解產(chǎn)生新的N末端，其與催化機(jī)構(gòu)的保守區(qū)域如催化殘基相互作用，誘導(dǎo)活性所需的構(gòu)象改變。激活可以導(dǎo)致多鏈形式的蛋白酶產(chǎn)生。在一些情況中，單鏈形式的蛋白酶可以呈現(xiàn)與單鏈一樣的蛋白酶解活性。如本文所用，結(jié)構(gòu)域是指分子如蛋白質(zhì)或者編碼核酸的一部分，其在結(jié)構(gòu)上和/或在功能上與所述分子的其它部分不同且是可鑒別的。如本文所用，蛋白酶結(jié)構(gòu)域是蛋白酶的催化活性部分。蛋白酶的蛋白酶結(jié)構(gòu)域包括任何這些蛋白質(zhì)的單鏈、雙鏈和多鏈形式。蛋白質(zhì)的蛋白酶結(jié)構(gòu)域含有為其蛋白酶解活性所需的該蛋白質(zhì)所有必需性質(zhì)，例如其催化中心。如本文所用，蛋白酶的催化活性部分或蛋白酶解活性部分是指蛋白酶結(jié)構(gòu)域，或者其保留蛋白酶活性的任何片段或部分。重要的是，至少在體外，所述蛋白酶的單鏈形式及其催化結(jié)構(gòu)域或者其蛋白酶解活性部分(典型為C末端截短)呈現(xiàn)蛋白酶活性。如本文所用，"編碼蛋白酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分的核酸"是指作為連續(xù)序列的僅編碼所述單鏈蛋白酶結(jié)構(gòu)域或其活性部分而不編碼所述蛋白酶的其它連續(xù)部分的核酸。如本文所用，所述基本上由蛋白酶結(jié)構(gòu)域組成的多肽是指所述多肽的唯一部分是蛋白酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分。所述多肽可任選地且通常包括其它的非蛋白酶衍生的氨基酸序列。如本文所用，"S1-S4"是指形成底物P1-P4殘基的結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基(見例如SchecterandBerger(1967)所oc/zew5/op/z>wi&sCowmw"27:157-162)。每個(gè)S1-S4均含有一、二或多個(gè)殘基，其可以是非連續(xù)的。這些位點(diǎn)從識(shí)別位點(diǎn)N末端至蛋白酶解位點(diǎn)相繼編號(hào)，稱作易斷裂鍵。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"P1-P4"和"P1'-P4'"是指底物肽中的殘基，其分別與Sl-S4殘基和Sl'-S4'殘基特異性相互作用，且由蛋白酶裂解。Pl-P4是指位于裂解位點(diǎn)N末端側(cè)的殘基位置；Pl'-P4'是指位于裂解位點(diǎn)C末端側(cè)的殘基位置。氨基酸殘基從多肽底物的N末端至C末端被標(biāo)記為(Pi,...，P3,P2，Pl，Pl',P2'，P3'，…，Pj)。各自的結(jié)合亞位點(diǎn)被標(biāo)記(Si，...，S3,S2,Sl，Sl'，S2',S3',...,Sj)。在Pl與Pl，之間催化裂解。如本文所用，"結(jié)合口袋"是指與底物上特定氨基酸相互作用的殘基。"特異性口袋"是較其它結(jié)合口袋提供更多能量的結(jié)合口袋(最重要的或者決定性的結(jié)合口袋)。典型地，結(jié)合步驟在過渡態(tài)形成之前進(jìn)行，為發(fā)生催化過程所必需。S1-S4和S1'-S4'氨基酸組成底物序列結(jié)合口袋，并且通過分別與肽、多肽或者蛋白質(zhì)底物的P1-P4和P1'-P4'氨基酸相互作用而促進(jìn)底物識(shí)別。無(wú)論蛋白酶與底物相互作用是否是Sl-S4和Sl'-S4'位置中氨基酸的功能。如果任一或多個(gè)S1、S2、S3、S4、Sl'、S2，、S3，和S4，亞位點(diǎn)中的氨基酸與底物中P1、P2、P3、P4、Pl'、P2'、P3，和P4'位點(diǎn)的任一或多個(gè)氨基酸相互作用或者識(shí)別其，則所述蛋白酶可裂解所述底物。結(jié)合口袋使靶氨基酸與蛋白酶處于合適位置，由此實(shí)現(xiàn)肽鍵的催化和底物的裂解。例如，絲氨酸蛋白酶典型識(shí)別底物中的P4-P2，位點(diǎn)；其它蛋白酶可以具有超出P4-P2'的擴(kuò)大的識(shí)別作用。如本文所用，"有助于擴(kuò)大底物特異性"的氨基酸是指除了特異性口袋之外活性位點(diǎn)裂口(cleft)中的那些殘基。這些氨基酸包括蛋白酶中的Sl-S4、44sr-S4，殘基。如本文所用，二級(jí)相互作用位點(diǎn)在活性位點(diǎn)裂口外面。這些位點(diǎn)可有助于底物識(shí)別和催化。這些氨基酸包括可導(dǎo)致與底物的第二和第三殼相互作用(shellinteraction)的氨基酸。例如，蛋白酶結(jié)構(gòu)中圍繞Sl-S4、S1，畫S4，氨基酸的環(huán)在定位底物中的P1-P4、Pl'-P4'氨基酸中起作用，從而將易斷裂鍵記錄于(registering)蛋白酶活性位點(diǎn)中。如本文所用，蛋白酶的活性位點(diǎn)是指底物結(jié)合位點(diǎn)，在此發(fā)生對(duì)底物的催化?；钚晕稽c(diǎn)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)使得可以識(shí)別及結(jié)合所述底物，及隨后水解和裂解底物中的易斷裂鍵。蛋白酶的活性位點(diǎn)含有有助于肽裂解的催化機(jī)制的氨基酸以及有助于底物序列識(shí)別的氨基酸，例如有助于擴(kuò)大底物結(jié)合特異性的氨基酸。如本文所用，絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶的"催化三聯(lián)體"或者"活性位點(diǎn)殘基"是指絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)中的氨基酸組合，典型為三個(gè)氨基酸的組合，其有助于肽裂解的催化機(jī)制。通常地，催化三聯(lián)體在絲氨酸蛋白酶中發(fā)現(xiàn)，提供活性親核體及酸/堿催化作用。絲氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體含有三個(gè)氨基酸，在胰凝乳蛋白酶中是Asp皿、His"和Ser195。這些殘基對(duì)于絲氨酸蛋白酶的催化效率是關(guān)鍵的。如本文所用，"底物識(shí)別位點(diǎn)"或者"裂解序列"是指由蛋白酶裂解的蛋白酶活性位點(diǎn)識(shí)別的序列。典型地，例如對(duì)于絲氨酸蛋白酶而言，裂解序列由底物中的P1-P4和P1'-P4'的氨基酸組成，在P1位置之后發(fā)生裂解。典型地，絲氨酸蛋白酶的裂解序列的長(zhǎng)度為6個(gè)殘基，以匹配許多蛋白酶的擴(kuò)大的底物特異性，但是根據(jù)蛋白酶而可以更長(zhǎng)或更短。例如，為自身催化所需的MT-SP1的底物識(shí)別位點(diǎn)或裂解序列是RQARVV，其中R在P4位置，Q在P3位置，A在P2位置，R在P1位置。MT-SP1中的裂解發(fā)生在位置R后，隨后是序列VVGG。如本文所用，靶底物是指在其底物識(shí)別位點(diǎn)由蛋白酶特異性裂解的底物。靶底物最低程度包括組成裂解序列的氨基酸。任選地，靶底物包括含有裂解序列及任何其它氨基酸的肽。全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、其等位基因變體、同工型或者含有由蛋白酶識(shí)別的裂解序列的任何部分是該蛋白酶的耙底物。此外，靶底物包括含有不影響蛋白酶裂解底物的其它部分的肽或蛋白質(zhì)。例45如，靶底物可包括與熒光部分化學(xué)連接的四氨基酸肽或者全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。如本文所用，裂解是指蛋白酶對(duì)肽鍵的破壞。蛋白酶的裂解位點(diǎn)基序包含易斷裂鍵的N和C末端殘基(分別為unprimed和primedsides,蛋白酶的裂解位點(diǎn)稱作...P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'...，裂解發(fā)生在Pl與Pl'殘基之間)。典型地，底物的裂解是激活裂解或者抑制裂解。激活裂解是指多肽從無(wú)活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问降牧呀狻＿@種裂解包括例如酶原裂解為活性酶，和/或前生長(zhǎng)因子(progrowthfactor)裂解為活性生長(zhǎng)因子。例如，MT-SP1可以通過在Pl-P4序列RQAR裂解耙底物而自動(dòng)激活。激活裂解也可以是蛋白質(zhì)裂解為一或多種自身具有活性的蛋白質(zhì)的裂解。例如，激活裂解在補(bǔ)體系統(tǒng)中發(fā)生，其是不可逆的蛋白酶解級(jí)聯(lián)事件，其終止導(dǎo)致多個(gè)效應(yīng)分子的形成，刺激炎癥、促進(jìn)抗原吞噬作用及直接溶解一些細(xì)胞。如本文所用，抑制裂解是蛋白質(zhì)裂解為一或多種非功能性降解產(chǎn)物。抑制裂解導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的減小或降低。典型地，蛋白質(zhì)活性的降低降低了涉及所述蛋白質(zhì)的途徑或過程。在一個(gè)實(shí)例中，任一或多種靶蛋白例如VEGFR的裂解是抑制裂解，導(dǎo)致耙底物的任一或多種功能或活性的伴隨降低或抑制。例如，對(duì)于VEGFR的裂解，可以被抑制的活性包括但非限于配體結(jié)合、激酶活性或者血管發(fā)生活性如在體內(nèi)或體外的血管發(fā)生活性。對(duì)于抑制而言，所述裂解使得活性與天然形式蛋白質(zhì)的活性相比降低至少大約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99.9%或更多。抑制裂解所需的蛋白質(zhì)裂解百分比根據(jù)蛋白質(zhì)而變化，但是可以通過測(cè)定蛋白質(zhì)的活性而確定。如本文所用，蛋白酶多肽是具有相應(yīng)于本文所述任一候選蛋白酶或者其變體蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽。如本文所用，"修飾的蛋白酶"或者"突變蛋白酶"是指在其一級(jí)序列中與野生型或模板蛋白酶相比具有一或多個(gè)修飾的蛋白酶多肽(蛋白質(zhì))。所述一或多個(gè)突變可以是一或多個(gè)氨基酸置換(取代)、插入、缺失及其任意組合。修飾的蛋白酶多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)修飾位置的那些蛋白酶多肽。修飾的蛋白酶可以是全長(zhǎng)蛋白酶，或者可以是修飾的全長(zhǎng)蛋白酶的催化活性部分，只要所述修飾的蛋白酶是蛋白酶解活性的。通常地，這些突變改變了野生型或者模板蛋白酶裂解任一或多種希望的或預(yù)定的靶底物的特異性和活性。除了在改變蛋白酶的底物特異性的區(qū)域中含有修飾之外，修飾的蛋白酶在對(duì)于蛋白酶的底物特異性非必需的區(qū)域中也可允許具有其它修飾。因此，修飾的蛋白酶與相應(yīng)的野生型或者支架蛋白酶的氨基酸序列典型具有60%、70%、80%、85%、90%、91°/。、92%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列相同性。修飾的全長(zhǎng)蛋白酶或者修飾的蛋白酶的其催化活性部分可包括是融合蛋白的蛋白酶，只要所述融合蛋白自身不改變蛋白酶的底物特異性。如本文所用，胰凝乳蛋白酶編號(hào)是指SEQIDNO:391所示成熟胰凝乳蛋白酶多肽的氨基酸編號(hào)。胰凝乳蛋白酶家族蛋白斷即u-PA、t-PA、MT-SPl及其它成員)包括蛋白酶結(jié)構(gòu)域的對(duì)比可以用胰凝乳蛋白酶進(jìn)行。在這種情況中，相應(yīng)于胰凝乳蛋白酶的氨基酸的蛋白酶的氨基酸以胰凝乳蛋白酶氨基酸的編號(hào)示出。相應(yīng)位置可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用人工對(duì)比方式或者使用多種可利用的對(duì)比程序(例如BLASTP)通過這種對(duì)比而確定。相應(yīng)位置也可以基于結(jié)構(gòu)對(duì)比，例如通過使用計(jì)算機(jī)模擬的蛋白酶結(jié)構(gòu)對(duì)比而確定。相應(yīng)于揭示的序列中氨基酸的多肽的氨基酸是指使用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比算法如GAP算法對(duì)比所述多肽與所揭示的序列以使得相同性或同源性最大化(其中對(duì)比保守氨基酸)而鑒別的氨基酸。例如，在對(duì)比u-PA與成熟胰凝乳蛋白酶多肽時(shí)，SEQIDNO:191所示u-PA的前體序列中氨基酸C168與成熟胰凝乳蛋白酶多肽的氨基酸C1對(duì)比在一起。因此，u-PA中的氨基酸C168基于胰凝乳蛋白酶編號(hào)也是C1。使用這種胰凝乳蛋白酶編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)，SEQIDNO:191所示前體u-PA序列中氨基酸L244與基于胰凝乳蛋白酶編號(hào)的L73相同，氨基酸1260與基于胰凝乳蛋白酶編號(hào)的189相同。在另一實(shí)例中，在對(duì)比MT-SP1絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(相應(yīng)于SEQIDNO:253的第615-855位氨基酸)與成熟胰凝乳蛋白酶時(shí)，在MT-SP1第615位的V以胰凝乳蛋白酶編號(hào)V16示出。隨后的氨基酸相應(yīng)編號(hào)。因此，在全長(zhǎng)MT-SP1(SEQIDNO:253)第708位的氨基酸F基于胰凝乳蛋白酶編號(hào)相應(yīng)于F99。在殘基存在于蛋白酶中而在胰凝乳蛋白酶中不存在的情況中，該氨基酸殘基以字母表示。例如，是胰凝乳蛋白酶中是具有氨基酸60(基于胰凝乳蛋白酶編號(hào))的環(huán)的一部分但是與胰凝乳蛋白酶相比插入在MT-SP1序列中的殘基，例如稱作47Asp60b或Arg60c。如本文所用，對(duì)于靶底物的特異性是指與另一底物(稱作非靶底物)相比蛋白酶優(yōu)先裂解靶底物。特異性以二級(jí)速率常數(shù)或特異性常數(shù)反映(kcat/Km)，這是蛋白酶與其底物的親和性及該酶的效率的測(cè)量數(shù)據(jù)。如本文所用，對(duì)于裂解的特異性常數(shù)是(k^/Km)，其中Km是Michaelis-Menton常數(shù)(在一半V鵬的[S])，Kcat是V腿/[Et]，其中Et是最終的酶濃度。參數(shù)keat、Km和k^/Km可以通過將底物濃度的倒數(shù)對(duì)底物裂解速度的倒數(shù)作圖并擬合進(jìn)Lineweaver-Burk方程(1/速度KKm/V皿)(l/[S])+1/Vmax，其中Vma^[et]keat)而計(jì)算?？梢允褂迷诖嬖诓煌瑵舛鹊孜锏臈l件下確定裂解速度隨著時(shí)間而增加的任何方法計(jì)算特異性常數(shù)。例如，將底物與熒光部分連接，其在由蛋白酶裂解時(shí)釋放。通過確定在不同酶濃度下的裂解速度，可以確定特定蛋白酶的k^。特異性常數(shù)可以用于使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法例如使用位置掃描組合文庫(kù)(positionalscanningcombinatoriallibrary,PS-SCL)確定蛋白酶的任一或多個(gè)Sl-S4口袋中的氨基酸相對(duì)于底物中伴隨的Pl-P4氨基酸的位點(diǎn)特異性偏愛。此外，特異性常數(shù)也可以用于確定蛋白酶對(duì)于一個(gè)靶底物相對(duì)于另一個(gè)靶底物的偏愛。如本文所用，底物特異性比率是特異性常數(shù)的比率，可用于對(duì)比兩或多個(gè)蛋白酶的特異性或者蛋白酶對(duì)于兩個(gè)以上底物的特異性。例如，蛋白酶對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)底物的底物特異性或者競(jìng)爭(zhēng)蛋白酶對(duì)于底物的底物特異性可以通過對(duì)比kca/Km而進(jìn)行比較。例如，對(duì)于靶底物具有2X106M"sec"特異性常數(shù)或者對(duì)于非靶底物具有2X104M"sec"特異性常數(shù)的蛋白酶對(duì)于所述靶底物更具特異性。使用上述特異性常數(shù)，所述蛋白酶對(duì)于耙蛋白酶具有100的底物特異性比率。如本文所用，對(duì)于靶底物的偏愛可以底物特異性比率表示。反映偏愛性的特定比率值是底物與所研究的蛋白酶之間的函數(shù)。大于1的底物特異性比率表示對(duì)于靶底物的偏愛，小于1的底物特異性比率表示對(duì)于非靶底物的偏愛。通常地，至少或者大約為1的比率反映出被認(rèn)為是候選治療劑的蛋白酶的充分差異。如本文所用，改變的特異性是指與起始野生型或模板蛋白酶相比修飾的或選擇的蛋白酶的底物特異性變化。通常，特異性變化是與模板蛋白酶的野生型底物(在此稱作非耙底物)相比修飾的蛋白酶對(duì)于靶底物的偏愛性變化。典型地，與靶蛋白酶的底物特異性相比，本發(fā)明提供的修飾的蛋白酶或者選擇的蛋白酶對(duì)于耙蛋白質(zhì)的任一或多種預(yù)定或希望的裂解序列呈現(xiàn)增加的底物特異性。例如，對(duì)于耙底物相對(duì)于與非靶底物的底物特異性比率為100的修飾的蛋白酶或者選擇的蛋白酶與底物特異性比率為10的支架蛋白酶相比呈現(xiàn)出特異性增加io倍。在另一實(shí)例中，底物特異性比率為1相對(duì)于底物特異性比率為0.1的修飾的蛋白酶呈現(xiàn)出底物特異性增加10倍。為了呈現(xiàn)出與模板蛋白酶相比增加的特異性，修飾的蛋白酶對(duì)于任一或多種預(yù)定靶底物具有1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更高的底物特異性。如本文所用，當(dāng)用于描述蛋白酶從競(jìng)爭(zhēng)底物混合物中選擇和裂解一種靶底物的能力時(shí)，"選擇性"可以與特異性互換使用?？梢酝ㄟ^例如對(duì)比蛋白酶裂解靶底物的特異性常數(shù)而確定與任一或多種靶底物相比，蛋白酶對(duì)于一種靶底物增加的選擇性。例如，如果蛋白酶對(duì)于耙底物的裂解特異性常數(shù)為2X106M"sec—1而對(duì)于其它任一其他底物的裂解特異性常數(shù)為2X1(^M"sec'1，則該蛋白酶對(duì)于前者靶底物更具選擇性。如本文所用，活性是指多肽或其與全長(zhǎng)(完整)蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的一部分的一或多種功能活性。功能活性包括但非限于生物學(xué)活性、催化或酶活性、抗原性(結(jié)合或者與多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗多肽抗體的能力)、免疫原性、形成多聚體的能力及特異性結(jié)合所述多肽的受體或配體的能力。如本文所用，催化活性或者裂解活性是指在檢測(cè)選擇的底物的蛋白酶解作用的體外蛋白酶解測(cè)定中評(píng)價(jià)的蛋白酶的活性。裂解活性可以通過評(píng)價(jià)蛋白酶的催化效率而測(cè)量。如本文所用，對(duì)于靶底物的活性是指裂解活性和/或功能活性，或者反映蛋白酶對(duì)于靶底物的活性的其它量度。裂解活性可以通過評(píng)價(jià)蛋白酶的催化效率而測(cè)量。對(duì)于本發(fā)明而言，如果與不存在蛋白酶的條件相比，蛋白酶呈現(xiàn)出更高的對(duì)耙底物的蛋白酶解或者裂解作用和/或調(diào)節(jié)(即激活或抑制)靶底物蛋白的功能活性，則表示活性增加。如本文所用，絲氨酸蛋白酶或者絲氨酸內(nèi)肽酶是指一類肽酶，其特征在于在酶的活性中心存在絲氨酸殘基。絲氨酸蛋白酶參與機(jī)體內(nèi)的許多功49能，包括血液凝固、炎癥以及在原核生物和真核生物中的消化酶。由"絲氨酸蛋白酶"所致的裂解機(jī)制是基于絲氨酸對(duì)于粑定肽鍵的親核攻擊。與天冬氨酸相關(guān)的半胱氨酸、蘇氨酸或水分子或金屬也可以發(fā)揮這個(gè)作用。絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的排列的側(cè)鏈形成大多數(shù)絲氨酸蛋白酶共有的催化三聯(lián)體。絲氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)在多肽底物結(jié)合之處是裂口形狀。絲氨酸蛋白酶的例子包括SEQIDNO:433所示尿纖溶酶原激活物(u-PA)及SEQIDNO:253所示MT-SP1，及其催化活性部分，例如SEQIDNO:505所示MT-SP1蛋白酶結(jié)構(gòu)域(也稱作B-鏈)。如本文所用，人蛋白質(zhì)是由人基因組中存在的核酸分子如DNA編碼的蛋白質(zhì)，包括其所有等位基因變體和保守變體。如果修飾基于人蛋白質(zhì)的野生型或者主要序列，則蛋白質(zhì)的變體或修飾是人蛋白質(zhì)。如本文所用，天然發(fā)生的oi-氨基酸殘基是在自然界發(fā)現(xiàn)的那20種(X-氨基酸殘基，其通過負(fù)載tRNA分子由人體中關(guān)聯(lián)mRNA密碼子的特異性識(shí)別而摻入蛋白質(zhì)中。如本文所用，非天然發(fā)生的氨基酸是指非遺傳編碼的氨基酸。如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其類似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是單鏈或雙鏈的。當(dāng)用于描述探針或引物時(shí)，包括單鏈分子，其任選被標(biāo)記，如用可檢測(cè)的標(biāo)記如熒光或放射性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。這種分子典型是這樣的長(zhǎng)度，以便其靶位用于探查或引發(fā)文庫(kù)時(shí)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是唯一的或者是低拷貝數(shù)的(典型小于5，通常小于3)。通常探針或引物含有與感興趣的基因互補(bǔ)或相同的序列的至少14、16或30個(gè)連續(xù)核苷酸。探針和引物的長(zhǎng)度可以是IO、20、30、50、IOO或更多個(gè)核酸。如本文所用，肽是指長(zhǎng)度為2-40個(gè)氨基酸的多肽。如本文所用，在本發(fā)明提供的各個(gè)氨基酸序列中出現(xiàn)的氨基酸根據(jù)其己知的三字母或單字母縮寫的方式表示(表1)。在各個(gè)核酸片段中出現(xiàn)的核苷酸以本領(lǐng)域常用的標(biāo)準(zhǔn)單字母命名法命名。如本文所用，"氨基酸"是含有氨基基團(tuán)和羧酸基團(tuán)的有機(jī)化合物。多肽含有兩或多個(gè)氨基酸。對(duì)于本發(fā)明而言，氨基酸包括20種天然發(fā)生的氨基酸、非天然氨基酸及氨基酸類似物(即其中a-碳具有側(cè)鏈的氨基酸)。如本文所用，"氨基酸殘基"是指多肽在其肽鍵部位被化學(xué)消化(水解)時(shí)形成的氨基酸。本文所述的氨基酸殘基推定為L(zhǎng)異構(gòu)體形式。也如此命名的D異構(gòu)體形式的殘基可以由任何L-氨基酸殘基取代，只要多肽保留希望的功能性質(zhì)。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游離氨基基團(tuán)。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游離羧基基團(tuán)。與/AW.C&m.,243:3552-3559(1969)及采用的37C.F.R..§§1.821-1.822所述標(biāo)準(zhǔn)多肽命名法一致，表l示出了氨基酸殘基的縮寫。表i-對(duì)應(yīng)表符號(hào)l個(gè)字母3個(gè)字母氨基酸YTyr酪氨酸GGly甘氨酸FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer絲氨酸Ilie異亮氨酸Leu亮氨酸TThr蘇氨酸VVal纈氨酸PPro脯氨酸KLys賴氨酸HHis組氨酸QGin谷氨酰胺EGlu谷氨酸ZGlxGlu禾口/或GinwTip色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺BAsxAsn禾口/或AspCCys半胱氨酸XXaa未知或其它氨基酸應(yīng)注意本文示出的所有氨基酸殘基序列均是從左至右方向是氨基末端至羧基末端常規(guī)方向。另外，短語(yǔ)"氨基酸殘基"廣泛是指包括對(duì)應(yīng)表(表l)中列出的氨基酸及修飾的和不常見的氨基酸，如并入作參考的37C.F.R.§§1.821-1.822中提及的那些。此外，應(yīng)注意在氨基酸殘基序列的起始處或末端的破折號(hào)"一"表示與一或多個(gè)氨基酸殘基的進(jìn)一步序列的肽鍵，與氨基末端基團(tuán)如NH2或者與羧基末端基團(tuán)如COOH的肽鍵。51如本文所用，"天然發(fā)生的氨基酸"是指在多肽中出現(xiàn)的20種L-氨基酸。如本文所用，"非天然氨基酸"是指這樣的有機(jī)化合物，其具有與天然氨基酸相似的結(jié)構(gòu)，但是在結(jié)構(gòu)上已經(jīng)被修飾為模擬天然氨基酸的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性。非天然發(fā)生的氨基酸因此包括例如除了所述20種天然發(fā)生的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸類似物，但非限于氨基酸的D-立體異構(gòu)體(D-isostereomer)。非天然氨基酸的例子在本文中描述，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。如本文所用，等動(dòng)力混合物是其中氨基酸的摩爾比率已經(jīng)基于其報(bào)道的反應(yīng)速率而調(diào)節(jié)的混合物(見例如Ostreshetal.,(1994)Biopolymers34:1681)。如本文所用，DNA構(gòu)建體是單鏈或雙鏈、線性或環(huán)形DNA分子，含有以天然未發(fā)現(xiàn)的方式組合和并列的DNA節(jié)段。DNA構(gòu)建體以人工操縱的結(jié)果而存在，包括操縱的分子的克隆及其它拷貝。如本文所用，DNA節(jié)段是具有特定屬性的較大DNA分子的一部分。例如，編碼特定多肽的DNA節(jié)段是較長(zhǎng)的DNA分子的一部分，如質(zhì)?；蛸|(zhì)粒片段，當(dāng)從5'至3'方向讀取時(shí)，其編碼特定多肽的氨基酸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)直向同源物是指得自一個(gè)物種的是功能對(duì)應(yīng)物的多肽或蛋白質(zhì)，或者來(lái)自不同物種的多肽或蛋白質(zhì)。直向同源物的序列差異是物種形成的結(jié)果。如本文所用，術(shù)語(yǔ)多核苷酸是指從5'至3'末端讀取的脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分離自天然來(lái)源、在體外合成或者從天然分子與合成分子的組合中制備。多核苷酸分子的長(zhǎng)度在本文以核苷酸(縮寫為nt)或堿基對(duì)(縮寫為bp)示出。術(shù)語(yǔ)核苷酸根據(jù)上下文用于描述單鏈和雙鏈分子。當(dāng)該術(shù)語(yǔ)用于雙鏈分子時(shí)，其用于表示全長(zhǎng)分子，且應(yīng)理解為與術(shù)語(yǔ)堿基對(duì)相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到雙鏈多核苷酸的兩個(gè)鏈在長(zhǎng)度上可以略微不同，其末端可以是交錯(cuò)的；因此雙鏈多核苷酸分子內(nèi)的所有核苷酸可以不都是配對(duì)的。這種不配對(duì)的末端通常不超過20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。如本文所用，兩個(gè)蛋白質(zhì)或核酸之間的"相似性"是指蛋白質(zhì)的氨基酸序列或者核酸的核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)性。相似性可以基于殘基序列和其中包含的殘基的相同性和/或同源性程度。評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)或核酸之間相似性程度的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。例如，在評(píng)價(jià)序列相似性的一個(gè)方法中，將兩個(gè)氨基酸或核苷酸序列以在序列之間產(chǎn)生最大水平相同性的方式對(duì)比。"相同性"是指氨基酸或者核苷酸序列無(wú)差異的程度。氨基酸序列的對(duì)比及在一定程度上核苷酸序列的對(duì)比也可以考慮到氨基酸(或者核苷酸)中的保守差異和/或頻繁取代。保守差異是保持所包含殘基的物理-化學(xué)性質(zhì)的那些差異。對(duì)比可以是整體對(duì)比(對(duì)全長(zhǎng)序列進(jìn)行對(duì)比，包括所有殘基)或者局部對(duì)比(僅包括最相似區(qū)域的序列部分的對(duì)比)。"相同性"具有本領(lǐng)域公認(rèn)的含義，可以使用公開的技術(shù)計(jì)算(見例如C細(xì)p她"o打a/她/ecw/ar所o/ogy，Lesk，A.M.,ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;所oco附/wri"g.,Z^/b/Twaricsaw/Cewo膨iVq/e加，Smith,D.W"ed.,AcademicPress,NewYork,1993;Cow/w/er^"a/戸So/5fe《we"ceD"fa，PartI，Griffin，A.M.,andGriffin,H.G.，eds.，HumanaPress,NewJersey,1994;5fegwewceJwa—'sz>zMo/ecw/ar5/o/ogy，vonHeinje，G.，AcademicPress,1987;及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.，MStocktonPress,NewYork,1991)。存在測(cè)量?jī)蓚€(gè)多核苷酸或多肽之間相同性的許多方法，術(shù)語(yǔ)"相同性"為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(Carillo，H.&Lipton,D.，WM"A栃073(1988》。如本文所用，同源(關(guān)于核酸和/或氨基酸序列)是指大約高于或等于25%序列同源性，典型高于或等于25%、40%、50%、60°/。、70%、80%、85%、90%或95%序列同源性；如果需要，可以指明精確的百分比。對(duì)于本發(fā)明而言，除非特別指出，則術(shù)語(yǔ)"同源性"和"相同性"通常可互換使用。通常地，為了確定同源性或相同性百分比，對(duì)比序列以便獲得最高級(jí)另U的匹配(見例如Com/wto//owa/Afo/ecw/(2r所o/ogv，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;說ocom/w""g..朋d/Vq/ec&,Smith,D.W"ed.，AcademicPress,NewYork,1993;Compilero/SegwewceDato,尸aW/,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994;5fe《wewce爿朋/戸's,"Mo/ecw/or所o/ogv,vonHeinje，G.，AcademicPress,1987;及5fe《wewce爿"(3/拜'51ZV/mer,Gribskov，MDevereux，J.，eds.，MStocktonPress,NewYork,1991;Carilloda/.(1988)5Z4MJ々7^WM^^:1073)。通過序列同源性，保守氨基酸的數(shù)目通過標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比算法程序確定，可以使用每個(gè)供應(yīng)商確定的默認(rèn)缺口罰分?；旧贤吹暮怂岱肿拥湫驮谥械葒?yán)格條件或者在高度嚴(yán)格條件下沿著感興趣的核酸的長(zhǎng)度雜交。本發(fā)明還涉及含有簡(jiǎn)并密碼子代替雜交核酸分子中的密碼子的核酸分子。任兩個(gè)分子是否具有至少60%、70%、80%、85°/。、卯％、95%、96%、97%、98%或99%"相同"或"同源"的核苷酸序列或氨基酸序列可以使用已知的計(jì)算機(jī)算法如FASTA程序利用例如默認(rèn)參數(shù)確定，如PearsonW(1988)尸rac.iVa".JcW.L/iS^S5:2444所述(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.，&a/.，臉c/dci^艦rc/27卿387(1984》、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.R，d"/"/Mo/ec歷o/"5:403(1990》；GuidetoHugeComputers,MartinJ.Bishop,ed"AcademicPress,SanDiego,1994及Carilloa/.(1988)5X4MJ^p//^/A/w/24S:1073)。例如，NationalCenterforBiotechnologyInformation數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST可用于確定相同性。其它可商購(gòu)或可公開獲得的程序包括DNAStar"MegAlign"程序(Madison,WI)和theUniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(UWG)"Gap"禾呈序(MadisonWI)。蛋白質(zhì)和/或核酸分子的同源性或者相同性百分比可以例如通過使用GAP計(jì)算機(jī)程序?qū)Ρ刃蛄行畔⒍_定(例如Needleman"a/.(1970)Mo/,所o/.48:443，由SmithandWaterman((1981)Jc/v.Ma仇2:482修訂)。簡(jiǎn)而言之，GAP程序?qū)⑾嗨菩砸?guī)定為相似的對(duì)比符號(hào)(即核苷酸或氨基酸)的數(shù)目除以兩個(gè)序列中較短序列的符號(hào)總數(shù)。GAP程序的默認(rèn)參數(shù)可包括:(l)一元比較矩陣(含有相同性值為1，非相同性值為0)及Gribskov"(1986)7Vwc/.爿c/A14:6745的加權(quán)比較矩陣，如SchwartzandDayhoff，eds.，爿:TL4SOFi^OZHTV促0C/五AO;廁DOTC/C7mE,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每個(gè)缺口的3.0罰分及每個(gè)缺口中每個(gè)符號(hào)的額外0.10罰分；及(3)末端缺口無(wú)罰分。因此，如本文所用，術(shù)語(yǔ)"相同性"或者"同源性"表示測(cè)試多肽或多核苷酸與參考多肽或多核苷酸之間的對(duì)比。如本文所用，術(shù)語(yǔ)至少"90%相同"是指相對(duì)于參考核酸或多肽的氨基酸序列從90至99.99的相同性百54分比。在90%或者更高水平的相同性是指假定對(duì)比長(zhǎng)度為100個(gè)氨基酸的測(cè)試多肽和參考多肽。在測(cè)試多肽中不超過10%的(即100分之IO)氨基酸與參考多肽的氨基酸不同。在測(cè)試多核苷酸與參考多核苷酸之間可以進(jìn)行相似對(duì)比。這種差異可以表示隨機(jī)分布于多肽全長(zhǎng)的點(diǎn)突變，或者其可以聚集在不同長(zhǎng)度的一或多個(gè)位置直至最大容許值，例如10/100氨基酸差異(大約90%相同性)。差異定義為核酸或者氨基酸取代、插入或者缺失。在大約85-90%以上的同源性或相同性水平，結(jié)果應(yīng)與程序和缺口參數(shù)設(shè)置無(wú)關(guān)，這種高水平相同性可以易于通過人工對(duì)比而不用依靠軟件即可評(píng)定。如本文所用，對(duì)比的序列是指使用同源性(相似性和域相同性)對(duì)比核苷酸或氨基酸序列中的相應(yīng)位置。典型地，對(duì)比50%或更高相同性的相關(guān)的兩或多個(gè)序列。對(duì)比的序列組是指在相應(yīng)位置對(duì)比的兩或多個(gè)序列，且可以包括衍生自RNA的對(duì)比序列，例如EST及與基因組DNA序列對(duì)比的其它c(diǎn)DNA。如本文所用，"引物"是指可作為模板指導(dǎo)的DNA合成的起始點(diǎn)的核酸分子，所述合成是在適當(dāng)條件下(例如存在四種不同的核苷三磷酸和聚合劑如DNA聚合酶、RNA聚合酶或者逆轉(zhuǎn)錄酶)、在合適的緩沖液中及在合適的溫度下進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到某些核酸分子可以作為"探針"和"引物"。然而，引物具有3'羥基基團(tuán)以進(jìn)行延伸。引物可用于多種方法中，包括例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR、RNAPCR、LCR、多重PCR、panhandlePCR、捕獲PCR、表達(dá)PCR、3'和5'RACE、原位PCR、連接介導(dǎo)的PCR及其它擴(kuò)增方法。如本文所用，"引物對(duì)"是指一組引物，其包括與被擴(kuò)增(例如通過PCR擴(kuò)增)的序列的5'末端雜交的5'(上游)引物及與被擴(kuò)增的序列的3'末端的互補(bǔ)序列雜交的3，(下游)引物。如本文所用，"特異性雜交"是指通過互補(bǔ)堿基配對(duì)，核酸分子(例如寡核苷酸)與靶核酸分子退火。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知影響特異性雜交的體外和體內(nèi)參數(shù)，例如特定分子的長(zhǎng)度和組成。與體外雜交特別相關(guān)的參數(shù)進(jìn)一步包括退火和洗滌溫度、緩沖液組成和鹽濃度。在高度嚴(yán)格條件下，除去非特異性結(jié)合的核酸分子的洗滌條件例如是O.lxSSPE、0.1%SDS、65°C，在中等條件下是0.2xSSPE、0.1%SDS、50。C。等價(jià)的嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域所已知。技術(shù)人員可容易地調(diào)節(jié)這些參數(shù)以實(shí)現(xiàn)核酸分子與適于特定用途的靶核酸分子的特異性雜交。如本文所用，與產(chǎn)物基本上相同是指足夠的相似，由此感興趣的性質(zhì)足以未加改變以便所述基本上相同的產(chǎn)物可用于代替所述產(chǎn)物。如本文所用，也應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)"基本上相同"或者"相似"根據(jù)上下文而有所不同，這種用法為相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。如本文所用，等位基因變體或者等位基因變異是指占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩或多種變化形式任一。等位基因變異通過突變天然產(chǎn)生，且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的表型多態(tài)性。基因突變可以是沉默突變(編碼的多肽中無(wú)變化)或者可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語(yǔ)"等位基因變體"在本文也用于描述由基因的等位基因變體編碼的蛋白質(zhì)。典型地，基因的所述參考形式編碼來(lái)自群體或者來(lái)自物種的一個(gè)參考成員中野生型形式和/或優(yōu)勢(shì)形式多肽。典型地，等位基因變體包括物種之間或者物種之中的變體，與相同物種的野生型和/或優(yōu)勢(shì)形式典型具有至少80%、90%或更高的氨基酸相同性；相同性的程度取決于基因及對(duì)比是種間還是種內(nèi)對(duì)比。通常，種內(nèi)等位基因變體與野生型和/或優(yōu)勢(shì)形式具有至少大約80%、85%、90%或95%或者更高的相同性，包括與多肽的野生型和/或優(yōu)勢(shì)形式具有96%、97%、98%、99%或者更高的相同性。本文提及的等位基因變體通常是指相同物種的成員之中的變異蛋白質(zhì)。如本文所用，"等位基因"與"等位基因變體"在本文可互換使用，是指基因或其一部分的替換形式。等位基因占據(jù)同源染色體上的相同基因座或位置。當(dāng)對(duì)象具有基因的兩個(gè)相同的等位基因時(shí)，稱所述對(duì)象是該基因或等位基因純合的。當(dāng)對(duì)象具有基因的兩個(gè)不同的等位基因時(shí)，稱所述對(duì)象是該基因雜合的。特定基因的等位基因彼此可以有一個(gè)核苷酸或者幾個(gè)核苷酸的不同，且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入?；虻牡任换蚩梢允呛型蛔兊幕蛐问健Ｈ绫疚乃?，物種變體是指不同物種中的多肽變體，包括不同的哺乳動(dòng)物物種如小鼠和人。如本文所用，剪接變體是指通過對(duì)基因組DNA的一級(jí)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行不同加工，產(chǎn)生一種以上類型的mRNA而產(chǎn)生的變體。如本文所用，修飾是指多肽的氨基酸序列或者核酸分子的核苷酸序列中的修飾，分別包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置換。修飾多肽的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如使用重組DNA方法學(xué)進(jìn)行。如本文所用，肽模擬物(peptidomimetic)是模擬特定肽的生物學(xué)活性形式的構(gòu)象和某些立體化學(xué)特征的化合物。通常，肽模擬物被設(shè)計(jì)為模擬化合物的某些希望的性質(zhì)而不模擬不希望的性質(zhì)，例如導(dǎo)致生物學(xué)活性構(gòu)象喪失和鍵破壞的柔性。通過用生物等構(gòu)物(bioisostere)置換導(dǎo)致不希望的性質(zhì)的某些基團(tuán)或鍵，可以從生物學(xué)活性化合物制備肽模擬物。生物等構(gòu)物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。例如，亞甲基生物等構(gòu)物CH2S已經(jīng)在腦啡肽類似物中用作酰胺置換物(見例如Spatola(1983)pp.267-357inChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,Weinstein，Ed-volume7，MarcelDekker,NewYork)?？梢钥诜膯岱仁莾?nèi)啡肽的肽模擬物化合物。對(duì)于本發(fā)明而言，環(huán)肽包括在肽模擬物中，是其中一或多個(gè)肽鍵由模擬物置換的多肽。如本文所用，一種多肽包含特定百分比的參考多肽的氨基酸是指在多肽與參考多肽之間共有的連續(xù)相同氨基酸的比例。例如，包含具有SEQIDNO:XX所示氨基酸序列(其列舉了147個(gè)氨基酸)的參考多肽中70%氨基酸的同工型是指所述參考多肽含有SEQIDNO.XX所示氨基酸序列的至少103個(gè)連續(xù)氨基酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子是指含有用于RNA聚合酶結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列的基因部分。啟動(dòng)子序列通常但非總是在基因的5'非編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)。如本文所用，分離的或純化的多肽或蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分基本上不含細(xì)胞材料或者來(lái)自從中衍生所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織中的其它污染蛋白質(zhì)，或者當(dāng)其是經(jīng)化學(xué)合成的時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物。如果通過標(biāo)準(zhǔn)分析方法確定制備物看起來(lái)沒有易于可檢測(cè)的雜質(zhì)，則可以確定所述制備物基本上是不含污染物的，所述方法如薄層層析法(TLC)、凝膠電泳法和高效液相層析法(HPLC)，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用這些方法評(píng)定這種純度，或者所述制備物是足夠純的由此進(jìn)一步的純化將不會(huì)可檢測(cè)地改變所述物質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，如酶和生物學(xué)活性。純化化合物以產(chǎn)生基本上化學(xué)純的化合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知?；旧匣瘜W(xué)純的化合物可以是立體異構(gòu)體的混合物。在這種情況中，進(jìn)一步純化可增加化合物的比活性。術(shù)語(yǔ)"基本上不含細(xì)胞材料"包括這樣的蛋白質(zhì)制備物，其中蛋白質(zhì)自從中分離或者重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞成分中分離出。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)基本上不含細(xì)胞材料包括這樣的蛋白酶蛋白質(zhì)制備物，其具有低于大約30%(干重)的非蛋白酶蛋白質(zhì)(在本文也稱作污染蛋白質(zhì))，通常低于大約20%的非蛋白酶蛋白質(zhì)或者10%的非蛋白酶蛋白質(zhì)或者低于大約5%的非蛋白酶蛋白質(zhì)。當(dāng)所述蛋白酶蛋白質(zhì)或其活性部分是重組產(chǎn)生的時(shí)，其也基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基低于大約或者為所述蛋白酶蛋白質(zhì)制備物體積的20%、10%或5%。如本文所用，術(shù)語(yǔ)基本上不含化學(xué)前體或者其它化學(xué)物包括這樣的蛋白酶蛋白質(zhì)制備物，其中所述蛋白質(zhì)從參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或者其它化學(xué)物中分離出。該術(shù)語(yǔ)包括這樣的蛋白酶蛋白質(zhì)制備物，其具有低于大約30%(干重)、20%、10%、5%或更少的化合物前體或非蛋白酶化學(xué)物或成分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"合成的"，例如合成的核酸分子或者合成的基因或者合成的肽是指核酸分子或者多肽分子是通過重組方法和/或通過化學(xué)合成方法產(chǎn)生的。如本文所用，通過使用重組DNA方法重組產(chǎn)生是指使用分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知的方法表達(dá)由克隆的DNA編碼的蛋白質(zhì)。如本文所用，載體(或質(zhì)粒)是指用于將異源核酸導(dǎo)入細(xì)胞中以進(jìn)行表達(dá)或復(fù)制的不連續(xù)元件。載體典型地保持為附加體，但是可以設(shè)計(jì)為實(shí)現(xiàn)基因或其一部分整合進(jìn)基因組染色體中。本發(fā)明還涉及作為人工染色體的載體，例如酵母人工染色體和哺乳動(dòng)物人工染色體。這種載體的選擇和應(yīng)用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。如本文所用，表達(dá)載體包括能表達(dá)DNA的載體，所述DNA與能實(shí)現(xiàn)這種DNA片段表達(dá)的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子區(qū)域可操縱地連接。這種額外的節(jié)段可包括啟動(dòng)子和終止子序列，及任選可包括一或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一或多個(gè)可選擇的標(biāo)記、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)等。表達(dá)載體通常衍生自質(zhì)粒58或病毒DNA，或者可以含有這兩種元件。因此，表達(dá)載體是指重組DNA或RNA構(gòu)建體，如質(zhì)粒、噬菌體、重組病毒或者其它載體，在導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中時(shí)導(dǎo)致克隆的DNA表達(dá)。合適的表達(dá)載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括在真核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞中可以復(fù)制的那些載體，及保持為附加體的那些載體或者整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中的那些載體。如本文所用，載體還包括"病毒載體"。病毒載體是工程化的病毒，其與外源基因可操縱地連接以(作為運(yùn)載體或穿梭工具)將所述外源基因轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞中。如本文所用，腺病毒是指在人體內(nèi)導(dǎo)致結(jié)膜炎和上呼吸道感染的含有DNA的任何病毒。如本文所用，裸DNA是指無(wú)組蛋白的DNA，其可以用于疫苗和基因治療。裸DNA是遺傳材料，其在稱作轉(zhuǎn)化的基因轉(zhuǎn)移過程中在細(xì)胞與細(xì)胞中傳遞。在轉(zhuǎn)化中，純化的或裸DNA由受體細(xì)胞攝取，其將為受體細(xì)胞提供新的特性或表型。如本文所用，可操縱地連接當(dāng)用于描述DNA節(jié)段時(shí)是指所述節(jié)段的排列使得其功能與指定目的一致，例如轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子中起始且從編碼節(jié)段行進(jìn)至終止子。如本文所用，蛋白質(zhì)結(jié)合序列是指能特異性結(jié)合其它蛋白質(zhì)或肽序列、通常是一組蛋白質(zhì)或肽序列或者特定的蛋白質(zhì)或肽序列的蛋白質(zhì)或肽序列。如本文所用，表位標(biāo)記是指相應(yīng)于表位的一段較短的氨基酸殘基序列，便于隨后對(duì)表位標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行生物化學(xué)和免疫學(xué)分析。表位標(biāo)記是通過將表位標(biāo)記序列加入在合適的表達(dá)載體中的蛋白酶編碼序列中而實(shí)現(xiàn)。表位標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以通過使用針對(duì)所述標(biāo)記的高度特異性抗體進(jìn)行親和純化。如本文所用，金屬結(jié)合序列是指能特異性結(jié)合金屬離子、通常為一組金屬離子或者特定的金屬離子的蛋白質(zhì)或肽序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)評(píng)定是指包括定量和定性確定，獲得樣品中存在的蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域活性的絕對(duì)值，也可以獲得關(guān)于活性水平的指數(shù)、比率、百分比、目測(cè)值或者其它數(shù)值。評(píng)定可以是直接或間接評(píng)定，且實(shí)際檢測(cè)的化學(xué)種類不需要是自身蛋白酶解產(chǎn)物，而是可例如是其衍生物或者一些進(jìn)一步的物質(zhì)。例如，通過SDS-PAGE及用考馬斯藍(lán)染色蛋白質(zhì)檢測(cè)補(bǔ)體蛋白的裂解產(chǎn)物。如本文所用，生物學(xué)活性是指化合物的體內(nèi)活性或者在體內(nèi)給予化合物、組合物或者其它混合物時(shí)產(chǎn)生的生理反應(yīng)。因此，生物學(xué)活性包含這種化合物、組合物和混合物的治療效果和藥物活性。生物學(xué)活性可以在設(shè)計(jì)為測(cè)試或使用這種活性的體外系統(tǒng)中觀測(cè)。因此，對(duì)于本發(fā)明而言，蛋白酶的生物學(xué)活性是其催化活性，其中多肽被水解。如本文所用，當(dāng)用于描述核酸的兩個(gè)序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)等價(jià)是指所述兩個(gè)序列編碼相同的氨基酸序列或者等價(jià)的蛋白質(zhì)。當(dāng)?shù)葍r(jià)用于描述兩個(gè)蛋白質(zhì)或肽時(shí)，是指這兩個(gè)蛋白質(zhì)或肽具有基本相同的氨基酸序列，僅具有基本不改變所述蛋白質(zhì)或肽的活性或功能的氨基酸取代。當(dāng)?shù)葍r(jià)用于描述性質(zhì)時(shí)，所述性質(zhì)不需要以相同程度存在(例如兩個(gè)肽可以表現(xiàn)為不同速率的相同類型酶活性)，但是所述活性通?；鞠嗤?。當(dāng)用于描述兩個(gè)核苷酸序列時(shí)，互補(bǔ)是指兩個(gè)核苷酸序列能雜交，在相對(duì)的核苷酸之間典型具有低于25%、15%或5%的錯(cuò)配。如果需要，指明互補(bǔ)百分比。典型地，選擇在高度嚴(yán)格條件下雜交的兩個(gè)分子。如本文所用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性或者基因或核酸表達(dá)的物質(zhì)降低或者增加或者另外改變蛋白質(zhì)的活性，或者以一些方式上調(diào)或下調(diào)或者另外改變核酸在細(xì)胞中的表達(dá)。如本文所用，藥物作用或者治療作用是指在給予用于治療疾病或病癥或者改善其癥狀的物質(zhì)時(shí)觀測(cè)到的作用。如本文所用，"調(diào)節(jié)"或"改變"是指分子例如蛋白質(zhì)的活性的改變。活性例如包括但非限于生物學(xué)活性，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。調(diào)節(jié)可包括活性增加(即上調(diào)或激動(dòng)劑活性)、活性降低(即下調(diào)或抑制)或者活性的任何其它改變(如周期性、頻率、持續(xù)時(shí)間、動(dòng)力學(xué)或者其它參數(shù)的改變)。調(diào)節(jié)可以根據(jù)情況而定，典型地，調(diào)節(jié)是與指定狀態(tài)相對(duì)比，例如與野生型蛋白質(zhì)、組成型狀態(tài)的蛋白質(zhì)或者在指定細(xì)胞類型或條件中表達(dá)的蛋白質(zhì)相對(duì)比。如本文所用，抑制是指相對(duì)于未被抑制的活性，活性降低。如本文所用，組合物是指任何混合物。其可以是溶液、懸浮液、液體、粉末、糊劑、水溶液、非水溶液或者其任意組合。如本文所用，組合是指兩或多個(gè)項(xiàng)目(items)之間或之中的任何結(jié)合。所述組合可以是兩或多個(gè)單獨(dú)項(xiàng)目，如兩個(gè)組合物或兩個(gè)集合，可以是其混合物，如兩或多個(gè)項(xiàng)目的單一混合物，或者其任何變體。組合的元件通常是功能關(guān)聯(lián)或相關(guān)的。試劑盒是包裝的組合，其任選包括使用所述組合或其元件的說明書。如本文所用，"疾病或失調(diào)"是指生物體由于一些原因或條件而引起的病理學(xué)病癥，所述原因和條件包括但非限于感染、后天獲得的病癥、遺傳病癥，及特征在于可鑒別的癥狀。本發(fā)明感興趣的疾病或失調(diào)是涉及補(bǔ)體激活的那些，包括由補(bǔ)體激活介導(dǎo)的那些及其中補(bǔ)體激活在病因?qū)W和病理學(xué)中起作用的那些。疾病和失調(diào)也包括由于蛋白質(zhì)的缺乏而引起的那些，如免疫缺陷，本發(fā)明感興趣的疾病和失調(diào)是其中由于補(bǔ)體蛋白的缺陷而不發(fā)生補(bǔ)體激活的那些失調(diào)。如本文所用，"治療"患有疾病或病癥的對(duì)象是指在治療后所述對(duì)象的癥狀部分或全部減輕，或者保持穩(wěn)定狀態(tài)。因此，治療包含預(yù)防、治療和/或治愈。預(yù)防是指預(yù)防潛在的疾病和/或預(yù)防癥狀惡化或者疾病進(jìn)展。治療還包含本文提供的修飾的干擾素和組合物的藥物學(xué)應(yīng)用。如本文所用，治療劑、治療方案、放射防護(hù)劑或者化學(xué)療法是指常規(guī)的藥物和藥物治療，包括疫苗，這些為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。放射療法為本領(lǐng)域所熟知。如本文所用，治療是指其中病癥、失調(diào)或疾病的癥狀或者其它指征得以改善或者另外得以有益改變的任何方式。如本文所用，治療作用是指對(duì)對(duì)象進(jìn)行治療后獲得的改變、典型為改善或者減輕疾病或病癥的癥狀或者治愈疾病或病癥的作用。治療有效量是指在給予對(duì)象之后產(chǎn)生治療作用的組合物、分子或者化合物的量。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"對(duì)象"是指動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，如人類。如本文所用，患者是指人對(duì)象。如本文所用，通過例如給予藥物組合物或者其它治療方法進(jìn)行處理而改善特定疾病或失調(diào)的癥狀是指由于給予所述組合物或者治療方法引起的或者與之相關(guān)的癥狀的任何減輕，無(wú)論是永久或暫時(shí)、長(zhǎng)期或短暫的。如本文所用，預(yù)防是指降低發(fā)生疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)的方法。61如本文所用，有效量是預(yù)防、治愈、改善、阻止或部分阻止疾病或失調(diào)的癥狀必需的治療劑的量。如本文所用，給予蛋白酶如修飾的蛋白酶是指將所述蛋白酶與其底物接觸的任何方法?？梢栽隗w內(nèi)或離體或在體外給予。例如，對(duì)于離體給予，將體液如血液從對(duì)象體內(nèi)取出，并且在機(jī)體之外與修飾的非補(bǔ)體蛋白酶接觸。對(duì)于體內(nèi)給予，可以將修飾的蛋白酶導(dǎo)入機(jī)體中，如通過局部、表面、全身和/或其它導(dǎo)入途徑。體外給予包含如細(xì)胞培養(yǎng)方法等方法。如本文所用，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，單位劑量形式是指適于人和動(dòng)物對(duì)象且單獨(dú)包裝的物理分立單位。如本文所用，單一劑量制劑是指直接給予的制劑。如本文所用，"制造品"是生產(chǎn)和銷售的產(chǎn)品。如本說明書中所用，該術(shù)語(yǔ)包含包裝物品中包含的修飾的蛋白酶多肽及核酸。如本文所用，流體是指可以流動(dòng)的任何組合物。因此，流體包含半固體、糊劑、溶液、水溶液混合物、凝膠、洗劑、乳液及其它這種組合物形式的組合物。如本文所用，"試劑盒"是指本發(fā)明提供的修飾的蛋白酶多肽或者核酸分子與另一項(xiàng)目的組合，所述另一項(xiàng)目用于包括但非限于給予、診斷和評(píng)定生物學(xué)活性或性質(zhì)的項(xiàng)目。試劑盒典型包括使用說明書。如本文所用，細(xì)胞提取物或者溶解產(chǎn)物是指從溶解或破壞的細(xì)胞中制備的制備物或級(jí)分。如本文所用，動(dòng)物包括任何動(dòng)物，例如但非限于靈長(zhǎng)類動(dòng)物包括人、大猩猩和猴子；嚙齒類動(dòng)物如小鼠和大鼠；禽類如雞；反芻動(dòng)物如山羊、牛、鹿、綿羊；豬類如豬，及其它動(dòng)物。非人動(dòng)物是除了人之外的動(dòng)物。本發(fā)明提供的蛋白酶來(lái)自任何來(lái)源，動(dòng)物、植物、原核生物和真菌。大多數(shù)蛋白酶源于動(dòng)物，包括源于哺乳動(dòng)物。如本文所用，對(duì)照是指與測(cè)試樣品基本相同的樣品，不同之處是其未用測(cè)試參數(shù)處理，或者如果樣品是血漿樣品，則其可以來(lái)自未受所述感興趣病癥影響的正常志愿者。對(duì)照也可以是內(nèi)部對(duì)照。如本文所用，除非特別指出，則單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"包括復(fù)數(shù)形式。因此，例如包含"一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域"的化合物包括具有一或多個(gè)胞62外結(jié)構(gòu)域的化合物。如本文所用，范圍和數(shù)量可以用"大約"的特定數(shù)值或范圍表示。大約也包括精確量。因此，"大約5個(gè)堿基"是指"大約5個(gè)堿基"也指"5個(gè)堿基"。如本文所用，"任選"是指隨后描述的事件或情況發(fā)生或不發(fā)生，且所述描述包括其中所述事件或情況發(fā)生及不發(fā)生的情況。例如，任選取代的基團(tuán)是指該基團(tuán)不被取代或者被取代。如本文所用，除非特別指出，則任何保護(hù)基團(tuán)、氨基酸及其它化合物均根據(jù)其常用的公認(rèn)縮寫形式或者根據(jù)IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature(見(1972)Biochem.ii:1726)所述進(jìn)行縮寫。B.篩選蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了篩選性質(zhì)改變、特別是底物特異性和選擇性改變的蛋白酶的方法。所述方法還提供了這種改變的蛋白酶，其對(duì)于治療用途呈現(xiàn)出基本未改變的活性或者具有足夠活性。本發(fā)明提供的方法可以使用蛋白酶修飾及設(shè)計(jì)修飾的蛋白酶的任何方法。這種方法包括產(chǎn)生文庫(kù)、使用現(xiàn)有文庫(kù)的隨機(jī)方法，也包括定向進(jìn)化方法。已經(jīng)應(yīng)用了許多選擇方案以鑒別具有改變的底物特異性/選擇性的蛋白酶，但是每種方法均有限制。本發(fā)明提供的方法克服了這種限制。通常，選擇方案包括l)根據(jù)蛋白酶結(jié)合進(jìn)行選擇或者2)根據(jù)蛋白酶催化作用進(jìn)行選擇。利用蛋白酶結(jié)合的策略的例子包括例如使用過渡態(tài)類似物(TSA)及應(yīng)用小分子自殺底物的那些策略。TSA是穩(wěn)定的化合物，其模擬蛋白酶底物反應(yīng)的過渡態(tài)的電子和結(jié)構(gòu)特征。蛋白酶與底物之間最強(qiáng)的相互作用典型發(fā)生在反應(yīng)的過渡態(tài)。TSA用作模型底物以選擇具有高度結(jié)合親和性的蛋白酶。TSA不是真正過渡態(tài)的理想模擬物且其合成困難(Bertschinger"a/.(2005)in尸/zage/"Z>wgZ)/sc0v^7(SidhuS,ed)，pp.461-491)。這種策略鑒別了具有改變的底物特異性的蛋白酶變體，但是這種蛋白酶通常呈現(xiàn)出活性降低，因?yàn)榈鞍酌复呋饔玫男枨蟛皇窃撨x擇方案的一部分。在另一種策略中，小分子自殺底物(也稱作基于機(jī)制的抑制劑)用于基于結(jié)合而選擇蛋白酶。這種自殺底物典型是小分子抑制劑，其共價(jià)結(jié)合酶的活性位點(diǎn)。這些自殺底物含有反應(yīng)性親電體，其與酶親核體反應(yīng)形成共價(jià)鍵。這個(gè)反應(yīng)不需要蛋白酶對(duì)天然肽鍵的裂解。典型地，這種抑制劑僅在結(jié)合正確的酶及經(jīng)歷正常催化步驟時(shí)才產(chǎn)生反應(yīng)性親核體(見例如Bertschinger&a/.(2005)in尸/2agecfc^/ay丑/o&c/z.awe/Z>wg_D&cove^y(SidhuS,ed)，pp.461-491)。在許多情況中，底物抑制劑模擬催化作用中涉及的第一過渡態(tài)的構(gòu)象，但是不允許催化循環(huán)的完成。結(jié)果，這種抑制劑的使用是針對(duì)強(qiáng)結(jié)合而不是催化作用進(jìn)行有效選擇，導(dǎo)致選擇了底物解離減弱的失活酶(Droge"a/.(2006)ChemBioChem，7:149-157)。同樣，由于其大小和缺乏底物裂解的需求，因此其未重現(xiàn)蛋白酶與天然蛋白質(zhì)底物的相互作用。己經(jīng)嘗試了針對(duì)催化作用而不是結(jié)合進(jìn)行選擇的蛋白酶選擇策略(見例如HeinisWa/.(2001)，尸rate/"五"&"een'"g，14:1043-1052)。針對(duì)催化作用進(jìn)行測(cè)定的一種主要限制是反應(yīng)產(chǎn)物在反應(yīng)完成后迅速擴(kuò)散，使得難以分離催化活性酶。因此，針對(duì)催化作用進(jìn)行選擇的策略依賴于將底物和酶錨定于噬菌體，由此使其緊密相鄰。例如，鈣調(diào)蛋白已經(jīng)用作固定劑(Demartis(1999)JMol.Biol.，286:617-633)。使用鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽衍生物將反應(yīng)底物非共價(jià)地錨定于鈣調(diào)蛋白標(biāo)記的噬菌體酶上。在催化反應(yīng)之后，使用抗產(chǎn)物親和性試劑從非催化活性噬菌體中分離展示反應(yīng)產(chǎn)物的噬菌體。然而由于底物附著于噬菌體顆粒，由此可以阻礙催化反應(yīng)。因此，選擇蛋白酶的這些及其它方法有一些限制，未鑒別出具有改變的特異性及基本未改變的具有足夠治療應(yīng)用活性的蛋白酶。本發(fā)明的方法解決了這些限制。本發(fā)明提供了選擇蛋白酶的方法，以鑒別具有改變的、優(yōu)化的或者改良的底物特異性的蛋白酶和/或蛋白酶變體。這種蛋白酶被鑒別用于優(yōu)化及用作治療性蛋白酶，其可裂解并失活(或者激活)希望的蛋白質(zhì)靶位，例如疾病或失調(diào)的病因?qū)W中涉及的蛋白質(zhì)靶位。在本發(fā)明提供的篩選蛋白酶的方法中，候選蛋白酶作為蛋白酶酶反應(yīng)的穩(wěn)定中間體復(fù)合物而被捕獲，然后得以鑒別。所述穩(wěn)定的中間體復(fù)合物典型是共價(jià)復(fù)合物或者其它復(fù)合物，可以從未復(fù)合的分子中分離。這種中間體包括例如酰基酶中間體，允許捕獲及最終鑒別具有選擇的或預(yù)定的底物特異性的蛋白酶。通過將蛋白酶集合與由所述蛋白酶裂解的蛋白酶捕獲多肽接觸，并在裂解時(shí)形成穩(wěn)定復(fù)合物而實(shí)現(xiàn)蛋白酶的捕獲。這種蛋白酶捕獲多肽的例子是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、Ct2巨球蛋白及其它這種分子。所述蛋白酶捕獲多肽可以是天然發(fā)生的和/或可以是修飾的以針對(duì)特定靶底物進(jìn)行選擇。在實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)，將蛋白酶、典型為修飾或突變體蛋白酶集合和/或天然蛋白酶集合與蛋白酶捕獲多肽接觸，在底物裂解之后所述蛋白酶捕獲多肽與蛋白酶反應(yīng)形成含有捕獲的中間體的復(fù)合物。這些方法可用于鑒別具有希望的底物特異性/選擇性的蛋白酶。為了鑒別具有希望的底物特異性/選擇性的蛋白酶，可以在蛋白酶捕獲多肽中修飾易斷裂鍵的氨基酸序列和/或反應(yīng)位點(diǎn)周圍序列如反應(yīng)環(huán)序列或者類似序列以模擬希望的靶底物的底物裂解序列。所述篩選反應(yīng)通過將蛋白酶集合與蛋白酶捕獲多肽在一定條件下接觸由此形成穩(wěn)定的復(fù)合物、典型為共價(jià)復(fù)合物而進(jìn)行。所述復(fù)合物具有足夠穩(wěn)定性，允許其從穩(wěn)定性較差的復(fù)合物和未反應(yīng)的蛋白酶捕獲多肽中分離。所述蛋白酶捕獲多肽可以是可鑒別地標(biāo)記的或者親和標(biāo)記的，以便于鑒別復(fù)合物。例如，通過熒光部分、親和標(biāo)記或其它這種標(biāo)記物質(zhì)對(duì)所述蛋白酶捕獲多肽進(jìn)行標(biāo)記，便于分離蛋白酶-抑制劑復(fù)合物及鑒別選擇的蛋白酶?？梢詫?duì)選擇的蛋白酶進(jìn)行活性分析以評(píng)定蛋白酶解效率和底物特異性。鑒別的或選擇的蛋白酶也可以例如通過測(cè)序或者其它鑒別方法包括質(zhì)譜分析法鑒別，或者通過其它標(biāo)記方法，以鑒別復(fù)合物中的選擇的蛋白酶。本發(fā)明提供的方法還包括任選地重復(fù)篩選步驟，由此對(duì)于希望的或預(yù)定的特異性/選擇性和/或裂解活性的蛋白酶可以進(jìn)行一次或者可以進(jìn)行多輪所述方法。例如，蛋白酶選擇可包括隨機(jī)或者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或者系統(tǒng)地修飾被選擇的蛋白酶(在靶定區(qū)域和/或沿著長(zhǎng)度修飾)及重復(fù)(一輪、兩輪、三輪、四輪或更多輪)將所述蛋白酶集合與一或多種蛋白酶捕獲多肽接觸的方法。本發(fā)明提供的方法可以是多重的，例如包括兩或多個(gè)差異標(biāo)記的或者可差異鑒別的蛋白酶捕獲多肽。在本發(fā)明提供的方法中，所述蛋白酶捕獲多肽非必需在復(fù)合反應(yīng)中呈現(xiàn)100%或者極高的效率，只要至少可檢測(cè)的百分比、典型為至少1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高百分比可形成穩(wěn)定的復(fù)合物，所述復(fù)合物可以從穩(wěn)定性較差的復(fù)合物或者未反應(yīng)的蛋白酶捕獲多肽中分離或者另外鑒別。因此，在反應(yīng)中發(fā)生分配的情況中可選擇蛋白酶，其中存在蛋白酶捕獲多肽的低于100%抑制作用，例如1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60°/。、70%、80%、90%、95%、99%或者更高的蛋白酶催化反應(yīng)的抑制。在本發(fā)明提供的方法中，可以調(diào)節(jié)選擇及其它參數(shù)的嚴(yán)格性，例如通過控制反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH、離子強(qiáng)度和/或文庫(kù)和底物濃度進(jìn)行。特異性限制也可以在選擇期間加以調(diào)節(jié)，通過包括競(jìng)爭(zhēng)劑如含有不希望的底物裂解序列的特定競(jìng)爭(zhēng)劑或者較廣泛類別的競(jìng)爭(zhēng)劑如人血漿而進(jìn)行。本發(fā)明提供的方法也可以通過將蛋白酶集合與一種蛋白酶捕獲多肽或者不同蛋白酶捕獲多肽的混合物接觸(例如通過多重)而進(jìn)行。在使用多個(gè)不同蛋白酶捕獲多肽的情況中，每個(gè)蛋白酶捕獲多肽均可以單獨(dú)及獨(dú)特地進(jìn)行標(biāo)記，由此其可以被可鑒別地檢測(cè)。這種方法使得可以在一個(gè)反應(yīng)中從蛋白酶集合中分離和鑒別多個(gè)蛋白酶。本發(fā)明提供的方法允許立即對(duì)多個(gè)蛋白酶集合進(jìn)行篩選以鑒別具有希望的或預(yù)定的底物特異性的那些蛋白酶。蛋白酶集合包括包含各種野生型蛋白酶、修飾的蛋白酶、其混合物及其蛋白酶解活性部分的集合的任何蛋白酶集合?？梢詰?yīng)用任何集合。所述集合也可以是一組突變體蛋白酶或者含有所述突變的其蛋白酶解活性部分。這種集合包括組合集合，其中所述集合的成員含有多樣的突變。所述突變可以是沿著蛋白酶(或其催化活性部分)長(zhǎng)度的隨機(jī)突變，或者靶向特定位置或區(qū)域的突變，例如靶向蛋白酶的特異性結(jié)合口袋的突變。本發(fā)明提供的方法可以鑒別和揭示先前未意識(shí)到作為特異性決定簇的非接觸的殘基(即埋沒的殘基)。因此，本發(fā)明提供的蛋白酶選擇技術(shù)方法可用于產(chǎn)生具有完全新的特異性和活性的蛋白酶和/或用于優(yōu)化現(xiàn)有蛋白酶的特異性或活性。C.蛋白酶捕獲多肽本發(fā)明提供的方法中使用的蛋白酶捕獲多肽是一種多肽或者含有反應(yīng)位點(diǎn)的多肽部分，其作為蛋白酶的底物在裂解時(shí)導(dǎo)致穩(wěn)定的蛋白酶-底物中間體復(fù)合物形成。通常，這種蛋白酶復(fù)合物需要通過所述蛋白酶裂解易斷裂鍵(pi-pr)以產(chǎn)生捕獲的底物-蛋白酶復(fù)合物。所述穩(wěn)定的復(fù)合物典型是在蛋白酶與蛋白酶捕獲多肽之間通過緊密的相互作用而形成的不可逆復(fù)合66物，如通過共價(jià)鍵、離子、疏水性或者其它緊密連接形成。由于這種復(fù)合物通常可以穩(wěn)定幾小時(shí)、幾天、幾周或者更長(zhǎng)時(shí)間，由此可以分離該復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)例中，穩(wěn)定的中間體復(fù)合物可以是?；钢虚g體，其是在絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶與蛋白酶捕獲多肽反應(yīng)時(shí)形成的。最通常地，在蛋白酶捕獲多肽裂解后，復(fù)合物中的快速構(gòu)象變化使得蛋白酶變形且阻止?；?酶復(fù)合物脫酰作用。因此，用蛋白酶捕獲多肽淘選蛋白酶容許針對(duì)催化作用的限速步驟(即P1-P1，鍵的裂解和酶的酰化)進(jìn)行選擇，同時(shí)形成易于從集合混合物中分離出非常緊密的(即共價(jià))復(fù)合物。典型地，這種蛋白酶捕獲多肽是較大的(ioo個(gè)氨基酸以上)單結(jié)構(gòu)域蛋白，含有由蛋白酶識(shí)別的反應(yīng)位點(diǎn)序列。通常，所述反應(yīng)位點(diǎn)裂解序列是柔性的、暴露的及較長(zhǎng)的大反應(yīng)環(huán)的一部分，使其成為靶底物(Otlewski(2005)77ze五M50丄24:1303-1310)，然而，只要蛋白酶捕獲劑含有可以由蛋白酶裂解的反應(yīng)位點(diǎn)序列，從而模擬底物裂解，則其可以用于本發(fā)明的方法中。因此，任何大的多肽或者合成產(chǎn)生的多肽均可以用于本發(fā)明的方法中，所述多肽含有由蛋白酶裂解的易斷裂鍵，導(dǎo)致在長(zhǎng)期穩(wěn)定復(fù)合物中捕獲蛋白質(zhì)。這種蛋白酶捕獲多肽的例子是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，如本文所述任何多肽。其它蛋白酶捕獲多肽也可以用于在本發(fā)明提供的方法中，如其作用機(jī)制與絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子相似的那些多肽。這些多肽包括例如合成或者重組產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白樣分子，或者含有絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的連續(xù)片段或者序列的多肽，包括絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)的足夠部分。另外，可以使用其抑制機(jī)制與絲氨酸蛋白酶抑制蛋白相似的其它蛋白酶抑制劑，例如抑制胱天蛋白酶的桿狀病毒p35蛋白(Xuaa/.(2001)A^wre,410:494-497;Otlewski"a/.(2005)772eEMBO24:1303-1310)。其它蛋白酶捕獲多肽包括捕獲穩(wěn)定復(fù)合物中蛋白酶的任何多肽，其可易于分離，例如但非限于a2巨球蛋白。l.絲氨酸蛋白酶抑制蛋白結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(絲氨酸蛋白酶抑制劑)與其它絲氨酸蛋白酶抑制劑(通常為大約少于60個(gè)氨基酸)相比是較大的蛋白質(zhì)分子(大約330-500個(gè)氨基酸)的蛋白酶抑制劑。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族是最大及最廣泛分布的蛋白酶抑制劑。目前在不同動(dòng)物、痘病毒、植物、細(xì)菌和古細(xì)菌中己經(jīng)鑒別了超過1500個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白家族成員(Law"(2006)Ge"owe歷o/ogv，7:216)，迄今為止已經(jīng)研究了超過30個(gè)不同的人絲氨酸蛋白酶抑制蛋白。大多數(shù)人絲氨酸蛋白酶抑制蛋白在血液中發(fā)現(xiàn)，在此其發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用，包括例如炎癥、補(bǔ)體、血液凝固和纖維蛋白溶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白也在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，例如調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性蛋白酶的不適當(dāng)釋放。盡管大多數(shù)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白對(duì)于蛋白酶活性具有抑制作用，但是一些絲氨酸蛋白酶抑制蛋白具有其它非抑制性作用，例如但非限于激素轉(zhuǎn)運(yùn)、皮質(zhì)類固醇激素結(jié)合球蛋白、及血壓調(diào)節(jié)作用(Silverman"a/.(2001)，/BC，276:33293-33296)。非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制蛋白是類固醇結(jié)合球蛋白和卵清蛋白。典型地，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制絲氨酸蛋白酶的作用，但是已經(jīng)鑒別出幾個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白是木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶或胱天蛋白酶的抑制劑(Whisstocketal.(2005)FEBSJournal,272:4868-4873)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白家族成員的序列相同性較差，然而，其結(jié)構(gòu)是高度保守的。例如，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白家族成員與絲氨酸蛋白酶抑制蛋白al-抗胰蛋白酶呈現(xiàn)大約30%氨基酸序列同源性，且具有保守的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)上，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白由三個(gè)卩折疊(A、B和C)和8-9個(gè)a-螺旋(A-I)組成，其組成上部|3-桶結(jié)構(gòu)域和下層螺旋結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由5鏈B-折疊A橋連，其是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的主要結(jié)構(gòu)特征(Huntingtonefa/.(2003),/777row6ow's//aemasfas7's,1:1535-1549)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白是亞穩(wěn)定蛋白，由此其在活性形式僅是部分穩(wěn)定的；其需要蛋白酶以采取完全穩(wěn)定構(gòu)象。稱作反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)(RSL)的環(huán)可以改變絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的構(gòu)象。RSL是一段大約17個(gè)氨基酸殘基的暴露序列，其在A和Cp-折疊之間的區(qū)域中從分子的頂部突出。RSL作為蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，通常含有唯一的蛋白酶特異性決定簇。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白結(jié)構(gòu)的最穩(wěn)定形式是RSL-裂解的形式。在蛋白酶裂解之后，RSL的氨基末端部分插入P-折疊A的中心，成為六鏈P-折疊的第四鏈。這個(gè)構(gòu)象改變稱作從"緊張(stressed)"至"松弛(relaxed)"(或者S至R)轉(zhuǎn)換。這種構(gòu)象特征在于分子的熱穩(wěn)定性增加，這是由于五鏈P-折疊A向六鏈反平行形式的重構(gòu)所致(LawrenceWa/.(2000),/傷o/.C7^m.，275:5839-5844)。換句話說，68絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的天然結(jié)構(gòu)與潛在的中間體等價(jià)，所述潛在的中間體僅在經(jīng)蛋白酶裂解之后轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的結(jié)構(gòu)(LawW(2006)7:216)。典型地，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白耙向絲氨酸蛋白酶，但是一些絲氨酸蛋白酶抑制蛋白使用相似機(jī)制抑制半胱氨酸蛋白酶。RSL環(huán)決定哪種蛋白酶被靶向抑制，因?yàn)槠涮峁┝怂霭械鞍酌傅募俚孜铩?shí)質(zhì)上，特定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的抑制特異性由RSL序列介導(dǎo)，其是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白中的最可變區(qū)域(Travisd(1990)說o/.C&w.T/o/pe&_y/er，371:3-11)。RSL模擬蛋白酶的底物識(shí)別序列，因此含有以..^11-3-241-1，-2，-3，-，11...編號(hào)的反應(yīng)位點(diǎn)，其中所述反應(yīng)位點(diǎn)是Pi與P之間的易斷裂鍵。對(duì)于成熟的Otl-抗胰蛋白酶，在Met358-Sef359鍵(相應(yīng)于SEQIDNO:l所示氨基酸序列的Met啦和Ser389氨基酸)發(fā)生P1-P1，鍵的裂解。所述蛋白酶上殘基的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)是...811-83-82-81-81'，S2，,S3，,Sn，-...。在本發(fā)明提供的方法中，對(duì)RSL序列進(jìn)行修飾以從展示文庫(kù)中選擇底物特異性改變的蛋白酶，如下文詳細(xì)論述。2.蛋白酶催化、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的抑制機(jī)制及酰基酶中間體的形成本發(fā)明提供的蛋白酶選擇方法利用多肽捕獲蛋白酶的能力鑒別具有改變的底物特異性的蛋白酶，如通過絲氨酸蛋白酶抑制蛋白所例證。蛋白酶催化機(jī)制在蛋白酶解酶的不同類別之間略為不同，所述蛋白酶例如是絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶或者金屬蛋白酶。例如，絲氨酸肽酶具有包含在活性中心內(nèi)的絲氨酸殘基，天冬氨酸肽酶催化中心內(nèi)具有兩個(gè)天冬氨酸，半胱氨酸型肽酶具有半胱氨酸殘基，蘇氨酸型肽酶具有蘇氨酸殘基，金屬肽酶在催化機(jī)制中使用金屬離子。通常，形成共價(jià)中間體的那些蛋白酶家族是本發(fā)明提供的蛋白酶選擇方法的耙。這些包括例如絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶家族的成員。例如，對(duì)于絲氨酸蛋白酶而言，催化作用的第一步是在底物與蛋白酶的催化中心內(nèi)的絲氨酸之間形成?；钢虚g體。這種共價(jià)中間體的形成通過負(fù)電荷四面體過渡態(tài)中間體行進(jìn)，然后底物的P1-P1'肽鍵被裂解。在第二步或脫酰作用期間，酰基-酶中間體由水分子水解，釋放肽及恢復(fù)所述酶的Ser-羥基。也包含四面體過渡態(tài)中間體形成的脫酰作用通過?；姆聪蚍磻?yīng)途徑行進(jìn)。對(duì)于脫酰作用，水分子代替Ser殘基成為攻擊親核體。絲氨酸蛋白酶催化中心的His殘基提供了通用堿，并接受反應(yīng)性Ser的OH基團(tuán)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白使用上述S至R轉(zhuǎn)換抑制絲氨酸和半胱氨酸靶蛋白酶的催化反應(yīng)。其作用機(jī)制在蛋白酶抑制劑中是獨(dú)特的，通過在脫?；捌茐牡鞍酌傅幕钚晕稽c(diǎn)，從而不可逆地阻礙蛋白酶解，隨后形成酰基-酶中間體(Otlewski"a/.(2005)7Txe五MBOJowr"a/，24:1303)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與蛋白酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型與底物的蛋白酶解的相同(見例如圖1;Zhouefa/.(2001)j:所o/.CTzew.，276:27541-27547)。在與靶蛋白酶相互作用之后，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白最初通過P1-P1'易斷裂鍵兩側(cè)RSL中的的殘基的相互作用而形成非共價(jià)Michaelis樣復(fù)合物(Silverman"(2001),/歷o/.C7ze肌，276:33293-33296)。蛋白酶活性位點(diǎn)中的絲氨酸殘基(對(duì)于絲氨酸蛋白酶而言)攻擊P1-P1，鍵，促進(jìn)肽鍵裂解及絲氨酸殘基與Pl殘基的主鏈羰基之間共價(jià)酯鍵的形成。在RSL被裂解之后，RSL插入絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的(3-折疊A中。插入的第一個(gè)殘基是P14(即成熟od-抗胰蛋白酶中第345位氨基酸，其相應(yīng)于SEQIDNO:l所示氨基酸序列中的T369氨基酸)，隨后是RSL的柔性鉸鏈區(qū)(P15-P9)(Buck"(2005)M/.說o/.五w/.，22:1627-1634)。RSL的插入轉(zhuǎn)運(yùn)與其共價(jià)結(jié)合的蛋白酶，導(dǎo)致蛋白酶的構(gòu)象改變，特征在于變形的活性位點(diǎn)(見圖l)以及絲氨酸蛋白酶抑制蛋白轉(zhuǎn)換為"松弛"狀態(tài)。蛋白酶的構(gòu)象變化改變了活性位點(diǎn)的催化三聯(lián)體，由此P1側(cè)鏈從S1口袋中除去。構(gòu)象重排的最終結(jié)果是捕獲酰基酶中間體(SilvermanWa/.(2001),/所o/.C/ze附.，276:33293-33296)。?；傅男纬蓪?duì)于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白相互作用是重要的，因此絲氨酸蛋白酶抑制蛋白典型特異于在催化作用中具有?；钢虚g體的蛋白酶類別。這些類別的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶家族的主要成員，包括胰凝乳蛋白酶超家族中的那些蛋白酶及蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶超家族中的那些蛋白酶，這些蛋白酶在下文詳細(xì)描述。此外，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白對(duì)于半胱氨酸蛋白酶也具有反應(yīng)性，所述半胱氨酸蛋白酶包括例如絲氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶家族和胱天蛋白酶家族中的那些蛋白酶。典型地，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白不抑制金屬-、蘇氨酸或天冬氨酸家族的蛋白酶。例如，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與金屬蛋白酶的相互作用不產(chǎn)生共價(jià)捕獲的中間體，而是金屬蛋白酶使所述抑制劑裂解而不形成任何復(fù)合物(Li"a/.(2004)Ca騰r7^.64:8657-8665)。因此，盡管大多數(shù)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制胰凝乳蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶，但是確實(shí)存在抑制半胱氨酸蛋白酶的跨類別(cross-class)抑制劑。所述跨類別抑制劑是抑制胱天蛋白酶1的病毒絲氨酸蛋白酶抑制蛋白CrmA和PI9(SEPRINB9)及抑制木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶L、K和S)的SCCA1(SEPRINB3)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白介導(dǎo)的絲氨酸蛋白酶抑制機(jī)制看起來(lái)適于半胱氨酸蛋白酶。然而，差異之處是動(dòng)力學(xué)捕獲的中間體是硫羥酸酯而不是在絲氨酸蛋白酶情況中的氧酯(oxyester)(Silverman"a/.(2001)所o/.Ozem.，276:33293-33296)。穩(wěn)定的共價(jià)硫羥酸酯型鍵的存在通過檢測(cè)到SCCA1與組織蛋白酶S之間SDS穩(wěn)定復(fù)合物而支持(SilvermanWa/.(2001)/5z'o/.C/^m.，276:33293-33296;Schick"(1998)傷oc/z畫勿，37:5258-5266)。根據(jù)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白-蛋白酶對(duì)，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白-蛋白酶對(duì)高度穩(wěn)定持續(xù)幾周至幾年，然而最后終會(huì)發(fā)生解離以產(chǎn)生正常蛋白酶解產(chǎn)物(即裂解的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白和活性蛋白酶；見例如Zhou"(2001)J!Ao/.276:27541-27547)。另外，如果RSL環(huán)未足夠快地插入蛋白酶中，則反應(yīng)直接行進(jìn)至裂解產(chǎn)物。這個(gè)現(xiàn)象稱作分配(partitioning)且反映出可以發(fā)生的分支途徑的存在，導(dǎo)致穩(wěn)定抑制復(fù)合物或者絲氨酸蛋白酶抑制蛋白至底物的轉(zhuǎn)換，如圖1所示，抑制復(fù)合物的形成相對(duì)非抑制途徑(Lawrence"(2000)，/說o/.Ozem.,275:5839-5844)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的分配可以通過改變RSL環(huán)、特別是起始環(huán)插入的RSL的鉸鏈區(qū)中的殘基(即P14)而調(diào)節(jié)，或者通過改變絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與其最佳相互作用的蛋白酶而調(diào)節(jié)。例如，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)的抑制活性在蛋白酶uPA、tPA與凝血酶之間不同，靶向偏愛uPA和tPA。另夕卜，RSL環(huán)在例如鉸鏈區(qū)的P14位置的變化改變了PAI-1的耙向偏愛性突變?yōu)閹щ姾傻陌被?即Arg、Lys、Asp、Glu)降低了PAI-1對(duì)于uPA、tPA和凝血酶的抑制活性；突變?yōu)橹行园被?即His、Tyr、Gln、Asn)或者突變?yōu)闊o(wú)側(cè)鏈的Gly導(dǎo)致PAI-1對(duì)于tPA和凝血酶的抑制活性與對(duì)于uPA相比降低10-100倍；突變?yōu)槭杷园被崤c野生型PAI-1相比不改變PAI-1的抑制活性(LawrenceW"/.(2000),/CTzem.,275:5839-5844)。在絲氨酸蛋白酶抑制蛋白介導(dǎo)的對(duì)蛋白酶催化的成功抑制中重要的因子是RSL環(huán)的長(zhǎng)度，其必須是精確長(zhǎng)度以保證絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與蛋白酶的相互作用提供了絲氨酸蛋白酶抑制蛋白本體(body)與蛋白酶之間的杠桿作用，允許催化性絲氨酸從活性位點(diǎn)的位移及蛋白酶的變形(Zhou"(2001)/5〖o(jì)/.CZzem.，276:27541-27547;Huntington&(2000)A^^wre，407:923-926)。實(shí)際上，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白本體使得所述蛋白酶被變形。大多數(shù)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白具有RSL，所述RSL長(zhǎng)度為17個(gè)殘基，而僅幾個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白經(jīng)鑒別具有16個(gè)殘基的環(huán)(即oc2-抗纖溶酶、Cl-抑制劑和CrmA)。具有18個(gè)殘基環(huán)的a2-抗纖溶酶變體絲氨酸蛋白酶抑制蛋白已經(jīng)從出血性疾病患者中鑒別，但是這種變體不是有功能的抑制性絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(Zhou"a/.(2001)/歷o/.C7zem.，276:27541-27547)。因此，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制機(jī)制可以適應(yīng)縮短的RSL，但是不適應(yīng)加長(zhǎng)的RSL(ZhouWa/.(2001)/歷o/.C/zem.,276:27541-27547)。除了絲氨酸蛋白酶抑制蛋白家族成員的環(huán)長(zhǎng)度的保守性之外，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL通常也保留保守的鉸鏈區(qū)(P15-P9)組成，且典型不含有帶電荷的或大的P殘基。a.絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的例子本發(fā)明提供的方法中使用的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白可以是任何絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽，包括但非限于重組產(chǎn)生的多肽、合成產(chǎn)生的多肽和從細(xì)胞、組織和血液中提取的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白還包括等位基因變體及來(lái)自不同物種的多肽，包括但非限于來(lái)自人及非人動(dòng)物、痘病毒、植物、細(xì)菌和古細(xì)菌。典型地，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的等位基因或物種變體與天然或野生型絲氨酸蛋白酶抑制蛋白具有大約或者至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的不同。人絲氨酸蛋白酶抑制蛋白包括本發(fā)明提供的任何絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(例如下表2所示)、等位基因變體同工型、從核酸合成的分子、從人組織、細(xì)胞或血液分離的蛋白質(zhì)，及任何人絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的修飾形式。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白還包括截短的多肽片段，只要存在足夠的RSL環(huán)部分以介導(dǎo)與蛋白酶的相互作用及形成共價(jià)?；钢虚g體。表2:絲氨酸蛋白酶抑,紂蛋白的例子絲氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白質(zhì)名稱別名功能Acc.#成熟多肽(aa)SEQIDNO胞外抑制性絲氨酸蛋白酶抑制蛋白SERP腿1a-l-抗胰蛋白酶AIAT抑制彈性蛋白酶P0100925-4181SERPINA2a-l-抗胰蛋白酶相關(guān)蛋白A1AU也許是假基因P2084822-4202SERP證2a-2-抗纖溶酶A2AP抑制纖溶酶和胰蛋白酶P0869740-491SERP脆3a-l-抗胰凝乳蛋白酶AACT抑制嗜中性細(xì)胞組織蛋白酶G和肥大細(xì)胞cymassP0101124-4234SERPINC1抗凝血酶-IIIANT3調(diào)節(jié)血液凝固級(jí)聯(lián)；凝血酶和因子Xa抑制劑P0100833-4645SERP腸1肝素輔因子IIHEP2調(diào)節(jié)血液凝固級(jí)聯(lián)；凝血酶抑制劑P0554620-4996SERPING1血漿蛋白酶Cl抑制劑IC1調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活、血液凝固、纖維蛋白溶解及激肽產(chǎn)生；C1酯酶抑制劑P0515523-500SERP脆5血漿絲氨酸蛋白酶抑制齊U，c蛋白抑制劑IPSP,PAI-3抑制激活的c蛋白和纖溶酶原激活物P0515420-4068SERPINA4KallistatinKAIN,PI4抑制人組織激肽釋放酶的酰胺裂解和激肽原酶活性P2962221-4279SERP畫神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白NEUS,PII2突觸連接與突觸可塑性的形成與重構(gòu)；Q9957417-4101073<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>典型地，本發(fā)明提供的方法中使用的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白是抑制性絲氨酸蛋白酶抑制蛋白或其片段，能在絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與蛋白酶之間形成共價(jià)?；钢虚g體。通常，這種絲氨酸蛋白酶抑制蛋白用于選擇由絲氨酸蛋白酶抑制蛋白正常靶向的蛋白酶，在此發(fā)生接近于蛋白酶的完全抑制并且在抑制性復(fù)合物與裂解的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白底物之間的分配被最小化。表3示出絲氨酸蛋白酶及其關(guān)聯(lián)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制劑的實(shí)例。預(yù)期這種絲氨酸蛋白酶抑制蛋白/蛋白酶對(duì)具有高締合常數(shù)或者抑制作用二級(jí)速率常數(shù)并且低或不分配為非抑制性復(fù)合物。例如，t-PA的主要生理抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白PAI-l,—種大約50kD的糖蛋白(Pa皿ekoek"a/.(1986)丄，5:2539-2544;Ginsbergefa/.，(1980)/C7/"./"veW"78:1673-1680;andCarrell/Vofez'wose/"/h'6"o/^,Ed.Barrett,A丄etal.，Elsevier,Amsterdam,pages403-420(1986)。然而，其它絲氨酸蛋白酶抑制蛋白/蛋白酶對(duì)也可以用于本發(fā)明提供的方法中，即使締合常數(shù)較低而分配較高。例如，其他絲氨酸蛋白酶抑制蛋白如Cl酯酶抑制劑和a-2-抗纖溶酶與tPA的締合常數(shù)較PAI-1的低幾個(gè)數(shù)量級(jí)(RanbyWa/.(1982)77znm.i^s,，27:175-183;Hekmanefa/.(1988)Jrc/z.丑/o//7j^.，262:199-210)，但是這些絲氨酸蛋白酶抑制蛋白仍抑制tPA(見例如LucoreWa/.(1988)Cz>c.77:660-669)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>彈性蛋白酶a-l-抗胰蛋白酶激肽釋放酶Cl酯酶抑制劑a-l-抗胰蛋白酶纖溶酶a-2-抗纖溶酶凝血酶抗凝血酶III肝素輔因子IItPAPAI-1,PAI-2,PAI-3胰蛋白酶a-l-抗胰蛋白酶生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)蛋白胰蛋白酶樣蛋白酶蛋白酶微管連接蛋白Iu-PAPAI-1,PAI-2,PAI-3因此，在本發(fā)明提供的方法中用于選擇蛋白酶的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白通常產(chǎn)生這樣的反應(yīng)產(chǎn)物，其中80%、90%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%、99%或100%所述反應(yīng)產(chǎn)物是抑制性復(fù)合物的形成。在一些情況中，在本發(fā)明提供的方法中可以發(fā)生絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與蛋白酶之間的分配增加，例如如果本發(fā)明方法中使用的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白不是最佳靶向蛋白酶。因此，在本發(fā)明提供的方法中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白可用于選擇蛋白酶，其中所得反應(yīng)導(dǎo)致為或大約為20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%或更多的穩(wěn)定抑制性復(fù)合物，其余的產(chǎn)物是裂解的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白底物。當(dāng)發(fā)生分配時(shí)可被改變以優(yōu)化蛋白酶選擇的因素包括例如增加的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白濃度和增加的反應(yīng)時(shí)間。在一些情況中，如下文討論的其它非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制蛋白或其突變體可以用于本發(fā)明提供的方法中，只要進(jìn)行選擇的靶蛋白酶能與絲氨酸蛋白酶抑制蛋白底物相互作用產(chǎn)生可以被捕獲的共價(jià)抑制性復(fù)合物。i.PAI-1蛋白酶選擇方法中使用的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白例如是纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)或其變體。PAI-1是組織纖溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶或者尿纖溶酶原激活物(u-PA)的主要抑制劑，其是參與由纖溶酶原激活所致的纖維蛋白溶解中的蛋白酶。PAI-1對(duì)于t-PA和u-PA具有大約2X107M"s'1的二級(jí)速率常數(shù)。PAI-1參與腫瘤浸潤(rùn)、纖維蛋白溶解、細(xì)胞遷移、組織重塑、組織內(nèi)巻、排卵、炎癥、滋養(yǎng)層浸潤(rùn)及惡性轉(zhuǎn)化(Salonen"a/.(1988)/5/o/.CAem.，264:6339-6343)。PAI-1主要由內(nèi)皮產(chǎn)生，但是也由其它組織類型例如脂肪組織分泌。其它相關(guān)的纖溶酶原激活物抑制劑包括PAI-2和PAI-3。例如，PAI-2也是一種u-PA和t-PA抑制齊U，但是由胎盤分泌，且典77型僅在妊娠期間大量存在。PAI-1是具有SEQIDNO:ll所示前體序列的單鏈糖蛋白，包括23個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，當(dāng)裂解時(shí)產(chǎn)生379個(gè)氨基酸的成熟序列。與其它絲氨酸蛋白酶抑制蛋白一樣，PAI-1在由蛋白酶在其位于Arg346-Met347(即相應(yīng)于SEQIDNO:11所示前體序列的Arg^和Met37e氨基酸)的Pl-Pl'反應(yīng)位點(diǎn)裂解之后由潛伏形式轉(zhuǎn)換為活性形式，從而導(dǎo)致穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物形成及結(jié)合的蛋白酶失活。然而，與其它絲氨酸蛋白酶抑制蛋白不同，PAI-1采用潛伏過渡態(tài)自發(fā)產(chǎn)生失活的、高度穩(wěn)定的但共價(jià)完整的形式，從而RSL的殘基P15至P4插入P-折疊A中形成(3-折疊的第四鏈(g卩s4A)，殘基P3至P10'在分子表面形成突出的環(huán)(DeTaeye"a/.(2003)/所o/.CTzem.，278:23899-23905)。因此，活性PAI-1在37。C相對(duì)不穩(wěn)定，呈現(xiàn)僅2.5小時(shí)的半衰期，之后自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)闈摲鼧?gòu)象。然而，這種潛伏形式可以通過變性而再激活，例如通過十二烷基硫酸鈉、胍氯化物(guanidiniumchloride)和脲變性(Declerekda/.(1992)/說o/.C/zem.,267:11693-11696)及加熱(Katagirietal.(1988)EurJ.Biochem.，176:81-87)變性。PAI-1的活性形式也通過與玻連蛋白相互作用而穩(wěn)定化。已經(jīng)鑒別了不能經(jīng)歷轉(zhuǎn)變?yōu)闈摲鼧?gòu)象及因此在溫度和pH升高時(shí)更長(zhǎng)期更穩(wěn)定的突變PAI-1(見例如Berkenpas"a/.(1995)7T^五MBO丄，14:2969-2977)。己經(jīng)對(duì)絲氨酸蛋白酶(即t-PA或u-PA)和/或抑制性絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(即PAI-1)進(jìn)行修飾以調(diào)節(jié)或改變抑制作用的二級(jí)速率常數(shù)以便使得蛋白酶對(duì)其關(guān)聯(lián)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制劑或其變體具有抗性，例如用于需要野生型蛋白酶活性的治療應(yīng)用中(見例如U.S.PatentSerialNos.5，866，413;5,728,564;5,550,042;5,486602;5,304,482)。ii.抗凝血酶(AT3)用于本發(fā)明方法中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白或其變體的另一例子是抗凝血酶(AT3)。AT3也是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白家族的成員，使得許多酶失活，包括例如來(lái)自凝血系統(tǒng)的那些酶，例如但非限于因子X、因子IX、因子II(凝血酶)、因子VII、因子XI和因子XII。典型地，抗凝血酶主要在血液中發(fā)現(xiàn)，在此其通過阻斷凝血酶的功能而防止或抑制血液凝固。AT3的活性通過一或多種輔因子、典型為肝素的存在而增加。在與肝素相互作用78時(shí)，AT3經(jīng)歷構(gòu)象重排，包括環(huán)從絲氨酸蛋白酶抑制蛋白結(jié)構(gòu)中排出及P1暴露，導(dǎo)致形成具有暴露的蛋白酶可及構(gòu)象的AT3結(jié)構(gòu)。另外，肝素既可結(jié)合蛋白酶也可結(jié)合抑制劑，從而加速抑制機(jī)制(LawWfl/.(2006)Ge"ome5油gy，7(216):l國(guó)ll)。AT3的基因序列編碼跨越七個(gè)外顯子的DNA，所述DNA編碼SEQIDNO:5所示前體蛋白。相應(yīng)于SEQIDNO:5所示序列1-32位氨基酸的信號(hào)序列的裂解導(dǎo)致產(chǎn)生432個(gè)氨基酸的、分子量為大約58000道爾頓的成熟蛋白質(zhì)。其中6個(gè)氨基酸是半胱氨酸，其導(dǎo)致三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵形成。AT3的RSL中P4-P2，位含有氨基酸殘基IAGRSL(SEQIDNO:478)，其相應(yīng)于SEQIDNO:5所示氨基酸序列中第422-427位氨基酸，其中在反應(yīng)位點(diǎn)P1-P1'的裂解發(fā)生在Arg425-Ser426氨基酸之間。3.其它蛋白酶捕獲多肽本領(lǐng)域己知或者可以鑒別其它蛋白酶捕獲多肽，其呈現(xiàn)與絲氨酸蛋白酶抑制蛋白相似的抑制機(jī)制(例如靶底物由蛋白酶裂解產(chǎn)生穩(wěn)定的中間體及蛋白酶結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化)。這種蛋白酶捕獲多肽預(yù)期用于本發(fā)明提供的方法中。這種蛋白酶捕獲多肽的例子是p35。另外，本發(fā)明提供的方法中可以使用由蛋白酶裂解導(dǎo)致在長(zhǎng)期穩(wěn)定復(fù)合物中捕獲蛋白酶的任何其它分子。a.p35例如，桿狀病毒p35蛋白(SEQIDNO:473)是廣譜胱天蛋白酶抑制劑，其可以這種方式抑制胱天蛋白酶(Xu"a/.(2001)A^ww410:494-497;Xu"a/.(2003)J!&o/.278(7):5455-5461)。胱天蛋白酶對(duì)p35的P廣P!，鍵的裂解(在胱天蛋白酶裂解位點(diǎn)DQMD")在p35環(huán)的氨基節(jié)段(Asp87)與胱天蛋白酶催化三聯(lián)體的半胱氨酸殘基(胱天蛋白酶-8中Cys350)之間產(chǎn)生共價(jià)硫酯中間體。在硫酯鍵形成時(shí)，所述蛋白酶經(jīng)歷構(gòu)象改變，允許裂解的環(huán)的氨基節(jié)段埋入胱天蛋白酶中，而在第2位含有Cys殘基的p35的N末端插入胱天蛋白酶活性位點(diǎn)中，因此阻斷胱天蛋白酶-8中His317殘基的溶劑可及性。對(duì)水解性水分子的不可及性因此防止隨后的硫酯鍵水解。除了p35之外，相似的病毒胱天蛋白酶抑制劑包括但非限于p49(SEQIDNO:491)和絲氨酸蛋白酶抑制蛋白CrmA牛痘基因(SEQIDNO:492)。p49抑制劑呈現(xiàn)與p35相似的胱天蛋白酶抑制機(jī)制，其中在p49胱天蛋白79酶識(shí)別序列TVTD^裂解時(shí)與胱天蛋白酶的活性位點(diǎn)形成穩(wěn)定的硫酯鍵。使用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行篩選的靶底物可以包括病毒胱天蛋白酶抑制劑多肽，如p35、p49或CrmA多肽。修飾本發(fā)明提供的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL環(huán)的方法可以容易地適應(yīng)于病毒胱天蛋白酶抑制劑多肽的修飾。例如，可以對(duì)p35RSL中裂解的耙位點(diǎn)進(jìn)行修飾，以選擇對(duì)于耙底物具有改變的反應(yīng)性或特異性的蛋白酶。在野生型p35中，在84-87(DQMD87)氨基酸位置發(fā)現(xiàn)胱天蛋白酶識(shí)別。對(duì)于病毒胱天蛋白酶抑制劑多肽進(jìn)行的修飾因此可包括改變裂解序列和/或周圍氨基酸殘基的修飾。例如，這種修飾的胱天蛋白酶抑制劑多肽例如p35、p49或CrmA多肽可以設(shè)計(jì)為模擬希望的靶底物的裂解序列，例如疾病或病癥的病因?qū)W中涉及的靶底物。在本發(fā)明提供的方法中可以對(duì)病毒胱天蛋白酶抑制劑多肽的RSL環(huán)序列進(jìn)行任何修飾。本發(fā)明提供的方法中使用的病毒胱天蛋白酶抑制劑多肽如p35、p49或CrmA多肽可以是任何病毒胱天蛋白酶抑制劑多肽，包括但非限于重組產(chǎn)生的多肽、合成產(chǎn)生的多肽及通過桿狀病毒純化方法產(chǎn)生的p35或p49多肽。病毒胱天蛋白酶抑制劑多肽也包括多肽的等位基因變體，如p35、p49或CrmA多肽變體。b.ct巨球蛋白(aM)蛋白酶的a巨球蛋白(aM)家族包括蛋白酶抑制劑，如舉例的蛋白酶抑制劑oc-2-巨球蛋白(a2M，SEQIDNO:490)，預(yù)期在本發(fā)明提供的方法中用作蛋白酶捕獲劑。aM分子抑制所有類別的蛋白酶。aM蛋白酶捕獲劑特征在于相似的抑制機(jī)制，包括蛋白酶對(duì)抑制劑誘餌區(qū)域的裂解。所述誘餌區(qū)域是對(duì)蛋白酶解敏感的節(jié)段，在裂解時(shí)aM分子中發(fā)生構(gòu)象改變，導(dǎo)致蛋白酶周圍結(jié)構(gòu)折攏(collapse)。例如在SEQIDNO:490所示a2M序列中的誘餌區(qū)域相應(yīng)于第6卯-728位氨基酸。在獲得的aM-蛋白酶穩(wěn)定復(fù)合物中，蛋白酶的活性位點(diǎn)在空間上被隔離，從而降低對(duì)正常蛋白酶底物的可及性。典型地，捕獲的蛋白酶保留對(duì)于小肽底物的活性，但是喪失其與大蛋白質(zhì)底物或抑制劑相互作用的能力。另外，aM分子特征在于存在反應(yīng)性硫羥酸酯，通過硫羥酸酯與胺的反應(yīng)使得抑制能力失活。另外，在誘餌區(qū)域裂解時(shí)發(fā)生的構(gòu)象變化暴露了保守的COOH-末端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)。RBD序列的暴露便于從循環(huán)中除去aM-蛋白酶復(fù)合物。4.蛋白酶捕獲競(jìng)爭(zhēng)劑在本發(fā)明提供的方法中可以使用競(jìng)爭(zhēng)劑，以調(diào)節(jié)被選擇的蛋白酶對(duì)于靶底物的特異性和選擇性限制?？梢詫⒏?jìng)爭(zhēng)劑在任何時(shí)間與蛋白酶或其集合接觸，如在蛋白酶與希望的蛋白酶捕獲多肽接觸之前或之后進(jìn)行接觸，或者競(jìng)爭(zhēng)劑與希望的蛋白酶捕獲多肽可以同時(shí)與蛋白酶接觸。競(jìng)爭(zhēng)劑可以是特異性競(jìng)爭(zhēng)劑或者廣譜競(jìng)爭(zhēng)劑。特異性競(jìng)爭(zhēng)劑被設(shè)計(jì)為模擬預(yù)定的非靶底物，從而作為預(yù)定的潛在脫耙物(off-target)。典型地，這種競(jìng)爭(zhēng)劑未被標(biāo)記，以便不選擇形成的穩(wěn)定蛋白酶復(fù)合物。另外，這種競(jìng)爭(zhēng)劑以大大超過選擇方案中使用的設(shè)計(jì)的蛋白酶捕獲多肽的量加入，典型以過量的摩爾量加入，由此所述競(jìng)爭(zhēng)劑結(jié)合所述集合中不希望的蛋白酶。在特異性競(jìng)爭(zhēng)的一個(gè)實(shí)例中，將兩個(gè)不同的蛋白酶捕獲多肽(每個(gè)多肽均設(shè)計(jì)為模擬不同的底物識(shí)別)與蛋白酶集合接觸，其中僅一個(gè)蛋白酶捕獲多肽是可檢測(cè)地標(biāo)記的。例如，競(jìng)爭(zhēng)劑可包括設(shè)計(jì)為具有模擬非靶底物的裂解序列的反應(yīng)位點(diǎn)的多肽蛋白酶捕獲劑。因此，競(jìng)爭(zhēng)劑如絲氨酸蛋白酶抑制蛋白可以設(shè)計(jì)為其P4-P1'RSL殘基由預(yù)定的非靶底物的裂解序列置換。所述競(jìng)爭(zhēng)劑可以與蛋白酶捕獲多肽組合用于本發(fā)明方法中，例如與另一種絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽組合使用，其RSL序列已經(jīng)修飾為在P4-P1'位含有模擬希望的或預(yù)定的耙底物的裂解序列的氨基酸，且被標(biāo)記以進(jìn)行分離。因此，這兩種蛋白酶捕獲多肽均選擇對(duì)靶裂解序列或非靶裂解序列呈現(xiàn)選擇性的蛋白酶，但是僅那些呈現(xiàn)希望的靶底物特異性且被可檢測(cè)地標(biāo)記的穩(wěn)定的蛋白酶復(fù)合物可以從反應(yīng)中分離。特異性競(jìng)爭(zhēng)劑的其它實(shí)例包括例如天然蛋白酶捕獲多肽，其反應(yīng)位點(diǎn)已經(jīng)在本發(fā)明提供的方法中被修飾。實(shí)施例6例證了這種策略，其中血漿純化的AT3絲氨酸蛋白酶抑制蛋白用作修飾的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白AT3SU1R-KI的競(jìng)爭(zhēng)劑。廣譜競(jìng)爭(zhēng)劑也可以用于本發(fā)明提供的方法中，以限制被選擇的蛋白酶的特異性和選擇性。廣譜競(jìng)爭(zhēng)劑的例子包括例如含有多種天然蛋白酶抑制劑的人血漿或人血清?；蛘撸梢援a(chǎn)生蛋白酶捕獲多肽的廣泛小分子文庫(kù)，其中P2、P3或P4的每個(gè)位置均是不同的，例如Acxxx-Thiaphine文庫(kù)。5.變體蛋白酶捕獲多肽已經(jīng)修飾為在其反應(yīng)位點(diǎn)具有改變的裂解序列的蛋白酶捕獲多肽可以用于本發(fā)明提供的方法中，以用希望的或預(yù)定的耙底物選擇蛋白酶。因此，蛋白酶捕獲劑在其作為公認(rèn)的蛋白酶裂解位點(diǎn)的序列區(qū)域被修飾，以選擇對(duì)于靶底物具有改變的反應(yīng)性或特異性的蛋白酶。例如，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白可以被修飾為在RSL環(huán)的易斷裂鍵或其周圍具有改變的裂解序列。在另一實(shí)例中，a2M可以在其誘餌區(qū)域中被修飾以具有改變的裂解序列。這種修飾的蛋白酶捕獲劑可以設(shè)計(jì)為模擬希望的靶底物的裂解序列，例如疾病或病癥的病因?qū)W中涉及的靶底物。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的RSL環(huán)序列中的任何修飾均可以在本發(fā)明提供的方法中產(chǎn)生。舉例的野生型絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL序列的對(duì)比在下表4中示出。在下表中，P15至P5'位的編號(hào)是就成熟otl-抗胰蛋白酶分子而言(相應(yīng)于SEQIDNO:l所示氨基酸序列的第367-387位氨基酸)。RSL環(huán)序列的特性為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知和/或可以通過序列對(duì)比而確定，例如通過與下表4示出的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白對(duì)比。表4:RSL環(huán)序列對(duì)比A絲氨酸蛋白酶抑制蛋白R(shí)SL環(huán)序列SEQIDNO3"Pl5PlOP4PlPl'Ps'3S3Manducasexta絲氨酸蛋白酶EGAEAAAANAFGIVPKSLILY397抑制蛋白1BManducasexta絲氨酸蛋白酶EGAEAAAANAFKITTYSFHFV398抑制蛋白1Kal-抗胰凝乳蛋白酶EGTEASAATAVKITLIiSALVE399抗凝血酶-IIIEGSEAAASTAWIAGRSLNPN400PAI-IIEGTEAAAGTGGVMTGRTGHGG401al-抗胰蛋白酶KGTEAAGAMFIiEA工PMSIPPE402PAI-ISGTVASSSTAVIVSARMAPEE403PAI-IIISGTRAAAATGTIFTFRSARLN404卵清蛋白AGREWGSAEAGVDAASVSEE405*根據(jù)Yeetal.(2001)NatureStructuralBiology8:979所述改編因此，可以修飾絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL環(huán)中相應(yīng)于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白反應(yīng)位點(diǎn)中的任一或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列(即相應(yīng)于如上表4示出的P15至P5'位的任一或多個(gè)氨基酸)。典型地，作為RSL環(huán)序列的82鉸鏈區(qū)一部分的氨基酸(即相應(yīng)于P15-P9位的氨基酸)未被修飾。在一個(gè)實(shí)例中，Pl和/或pr位中的一或多個(gè)氨基酸被修飾以相應(yīng)于在易斷裂鍵兩側(cè)的那些氨基酸。在另一實(shí)例中，相應(yīng)于反應(yīng)位點(diǎn)位置P4-P2，的任一或多個(gè)氨基酸被修飾。例如，PAI-1的P4-P1，是VSARM(SEQIDNO:378)，其中在R(Pl)與M(Pl，)氨基酸之間發(fā)生裂解。可以修飾VSARM序列的任一或多個(gè)氨基酸以修飾PAI-I的裂解序列以選擇具有改變的特異性的蛋白酶。實(shí)施例1例證了PAI-I的修飾，其中反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)中的VSARM序列被修飾為RRARM(SEQIDNO:379)。在另一實(shí)例中，反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)VSARM序列可以被修飾為已知的有效肽底物PFGRS(SEQIDNO:389)。這種突變PAI-1的例子如SEQIDNO:610和611示出。在另一實(shí)例中，可以在抗凝血酶III(AT3)的RSL中產(chǎn)生修飾。例如，AT3的P4-P1，是IAGRSL(SEQIDNO:478)，其中裂解發(fā)生在R(Pl)與S(Pl，)氨基酸之間?？梢詫?duì)IAGRSL序列的任一或多個(gè)氨基酸進(jìn)行修飾以修飾AT3的裂解序列以選擇具有改變的特異性的蛋白酶。實(shí)施例6和7例證了AT3的修飾，其中反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)中的IAGRSL序列被修飾為RRVRKE(SEQIDNO:498)。在另一實(shí)例中，反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)中的IAGRSL氨基酸序列可以被修飾為SLGRKI(SEQIDNO:479)。其它修飾的AT3多肽含有IAGRSL氨基酸序列由氨基酸序列SKGRSL(SEQIDNO:501)或者氨基酸序列PRFKII(SEQIDNO:503)置換。這種突變AT3分子的例子以SEQIDNO:497、499、500和502示出?；蛘呒叭绻枰?，則可以以一次一個(gè)、一次兩個(gè)、一次三個(gè)等方式對(duì)P4-P2，位置的任一或多個(gè)氨基酸進(jìn)行修飾，獲得的修飾的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白可以在連續(xù)輪的選擇中單獨(dú)檢測(cè)，以優(yōu)化在每個(gè)修飾的位置呈現(xiàn)底物特異性和/或選擇性的蛋白酶。在大多數(shù)情況中，置換野生型絲氨酸蛋白酶抑制蛋白反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)或者另一蛋白酶捕獲劑中類似序列中的氨基酸殘基的氨基酸殘基是基于在希望的靶底物中的裂解序列而選擇。靶底物蛋白是正常參與病理學(xué)中的底物，其中在指定底物序列裂解靶蛋白作為對(duì)病理進(jìn)行治療的方式(見例如美國(guó)專利發(fā)明者E·L·麥迪遜申請(qǐng)人:催化劑生物科學(xué)公司;托里派因斯分子研究院