專(zhuān)利名稱(chēng)：消減免疫法制備大腸桿菌0157∶h7抗原單克隆抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備單克隆抗體的免疫方法，特別是涉及一種消減免疫法制備大腸桿 0157:H7抗原單克隆抗體的方法。
技術(shù)背景1975年Kohler和Milstein發(fā)表了"分泌預(yù)定特異性抗體融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)"的論文， 單克隆抗體技術(shù)從此問(wèn)世。單克隆抗體技術(shù)已是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具。常規(guī)的雜 交瘤技術(shù)通常并不能獲得特定目的抗原的單克隆抗體。常規(guī)技術(shù)制備細(xì)菌抗原單克隆抗體， 通常采用生物化學(xué)方法分離純化天然蛋白質(zhì)作為免疫原，然后將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓 瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用免疫原篩選出分泌抗目的蛋白抗體的細(xì)胞株。由于絕大部分的天然蛋 白表達(dá)量很低，用生物化學(xué)方法分離純化難度大，成本高，現(xiàn)己很少使用。利用基因工程 技術(shù)可表達(dá)目的蛋白質(zhì)，但此方法存在制備周期長(zhǎng)和抗體親合力相對(duì)較弱等不足之處，主 要原因是因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)都采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)蛋白后無(wú)修飾，不具備天然蛋 白的構(gòu)象，尤其對(duì)那些需要糖基化、磷酸化等修飾作用的蛋白。實(shí)驗(yàn)證明用某些原核表達(dá) 蛋白免疫動(dòng)物制備的抗血清只能與變性蛋白反應(yīng)，而很難結(jié)合天然抗原，這種現(xiàn)象在用桿 狀病毒表達(dá)的蛋白中也存在。盡管這類(lèi)抗體能用于Western Blot實(shí)驗(yàn)，但研究天然蛋白的 結(jié)構(gòu)與功能及對(duì)病原微生物的檢測(cè)則受到很大的限制。而用真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母、昆蟲(chóng)和 哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)，存在著實(shí)驗(yàn)周期更長(zhǎng)、表達(dá)產(chǎn)量更低、技術(shù)難度更大等問(wèn)題。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種使免疫系統(tǒng)直接耙向目的抗原決定 簇，來(lái)大幅增加目的抗原單抗的產(chǎn)生數(shù)目，并減少單抗篩選的工作量的消減免疫法制備大 腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟 (1 )選取4-8周齡雌性BALB/c小鼠；(2) 用除大腸桿菌0157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為耐受原腹腔 注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的6-16min、 18-30 h和40-60 h，按每 公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環(huán)磷酰胺50-150 mg，用間接ELISA檢測(cè)小鼠耐受情 況；(3) 每隔兩周重復(fù)步驟(2)，直至BALB/c小鼠對(duì)所述耐受原耐受；(4) 在使所述BALB/c小鼠出現(xiàn)耐受的末次免疫后的7-14d、 14-21d、 28-35d，以大腸 桿菌0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對(duì)耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測(cè)效價(jià)，取與所述耐受原反應(yīng)效價(jià)低而與大腸桿菌 0157:H7反應(yīng)效價(jià)高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。 所述歩驟(1)優(yōu)選的是選取5-6周齡雌性BALB/c小鼠。所述步驟(2)為用除大腸桿菌0157:H7以外的、己分離鑒定的、商品化的大腸桿菌 為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的8-12 min、 22-26 h和 46-50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環(huán)磷酰胺50-150 mg，用間接ELISA檢測(cè)小鼠耐受情況。所述除大腸桿菌0157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為大腸桿菌44752、 大腸桿菌44186、大腸桿菌44824、大腸桿菌44336或大腸桿菌44102，還可以選用其它的 大腸桿菌。所述步驟(4)為在使所述BALB/c小鼠出現(xiàn)耐受的末次免疫后的9-lld、 16-18d、 30-32d ，以大腸桿菌0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對(duì)耐受原耐受的BALB/c小鼠， 在用所述大腸桿菌0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測(cè)效價(jià)，取與所述耐受原反應(yīng)效價(jià)低而 與大腸桿菌0157:H7反應(yīng)效價(jià)高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌0157:H7的單克 隆抗體。本發(fā)明的方法可在不純化抗原的基礎(chǔ)上，較容易的獲得細(xì)菌抗原的單克隆抗體；本發(fā) 明的方法能提高免疫效果，減少單抗篩選的工作量獲得預(yù)期的單克隆抗體。


圖1為常規(guī)免疫法雜交瘤技術(shù)示意圖； 圖2為消減免疫法雜交瘤技術(shù)示意圖； 圖3為BALB/c獲得了對(duì)大腸桿菌44752的耐受情況；圖4為消減免疫效果。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的方法中，由于BALB/c小鼠在注射耐受原后注射烷化劑環(huán)磷酰胺，使得BALB/c 小鼠對(duì)耐受原表面暴露的抗原決定簇耐受，注射免疫原后，BALB/c小鼠選擇性的針對(duì)免疫 原表面特有的抗原決定簇發(fā)生免疫反應(yīng)，特異性抗體隨之產(chǎn)生。本發(fā)明用的菌體抗原免疫 和篩選，這有利于得到抗天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的單克隆抗體，有利于單克隆抗體與不同分離毒 株的結(jié)合，減少應(yīng)用中可能受到的限制。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。常規(guī)雜交瘤技術(shù)(見(jiàn)圖l)為免疫小鼠后直接進(jìn)行融合篩選，由于菌體為細(xì)胞型抗原，其 抗原決定簇十分豐富，并且與其同種屬的細(xì)菌有嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，致使篩選菌體特異性單 克隆抗體的工作量巨大；而消減免疫使部分相同的抗原決定簇在體內(nèi)被抑制，從而減少單 抗篩選的工作量，增加獲得預(yù)期的抗體的機(jī)會(huì)(見(jiàn)圖2)。消減免疫法可排除針對(duì)非本細(xì)菌特異性抗原單克隆抗體株。從而巧妙的回避了沒(méi)有比 較純的抗原的問(wèn)題，使得試驗(yàn)成功排除了很多非特異性單抗，獲得與其他相近屬的菌種不 產(chǎn)生交叉反應(yīng)的單抗株。并且采用菌體抗原免疫可以避免小分子蛋白免疫原免疫效果不佳、產(chǎn)生的抗體不穩(wěn)定等弊端，從而使試驗(yàn)獲得的單抗具有很好的穩(wěn)定性。實(shí)施例1制備抗原生理鹽水溶解凍干菌種大腸桿菌0157:H7、大腸桿菌44752，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 37。C培養(yǎng)18h，然后劃線接種于選擇性培養(yǎng)基(遠(yuǎn)藤培養(yǎng)萄37。C培養(yǎng)18h，挑選其中的典型 菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37C培養(yǎng)18h，用PBS洗下菌落，4000r/min離心20min， 用PBS洗滌2次后經(jīng)0.4n/。甲醛固定，配制為抗原濃度為108cfu/mL的菌懸液，4'C保存。 消減免疫法免疫小鼠消減免疫法免疫BALB/c小鼠的步驟消減免疫法以大腸桿菌44752為耐受原，大 腸桿菌0157:H7為免疫原，采用5-6周齡雌性BALB/c小鼠。先用耐受原腹腔注射0.5mL 抗原免疫小鼠，分別在注射耐受原后10min， 24h和48h，再腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cy) (100 mg/kg體重)；每次免疫后三天后眼睚靜脈叢采血，間接ELISA檢測(cè)小鼠耐受情況，每隔兩 周重復(fù)此免疫及檢測(cè)過(guò)程，直至小鼠對(duì)耐受原耐受。然后，再用免疫原在免疫耐受階段末 次免疫后10d、 17d、 31d免疫小鼠，依次腹腔注射免疫原0.2mL， 0.5mL， 0.8mL。末次免 疫3d時(shí)取鼠尾血檢測(cè)效價(jià)，取與大腸桿菌44752反應(yīng)效價(jià)低而與大腸桿菌0157:H7反應(yīng) 效價(jià)高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備免疫原的單克隆抗體。免疫耐受階段，以常規(guī)免疫方法免疫大腸桿菌44752菌體抗原作為對(duì)照，平行地每次 免疫0.5mL抗原。在免疫3天后，取小鼠眼眶血檢測(cè)，看受試小鼠是否獲得耐受，動(dòng)物耐 受則進(jìn)入免疫階段。耐受后免疫階段，以常規(guī)免疫方法免疫大腸桿菌0157:H7菌體抗原作為對(duì)照，平行地 依次免疫0.2mL,0.5mL，0.8mL。在末次免疫后3天，取鼠尾血檢測(cè)效價(jià)，取效價(jià)高的小鼠進(jìn) 行加強(qiáng)免疫，然后按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備免疫原大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。 免疫耐受情況免疫耐受階段末次免疫3d后，后眼睚靜脈叢采血，分離血清。圖3，用間接ELISA測(cè) 得不管是長(zhǎng)程還是短程消減免疫法的BALB/c小鼠血清效價(jià)在128x時(shí)都不足陰性對(duì)照(A值 為0.060)的2.1倍，而對(duì)照組(常規(guī)免疫法免疫)血清效價(jià)在104以上，我們認(rèn)為BALB/c獲 得了對(duì)大腸桿菌44752的耐受。消減免疫效果間接ELISA，分別包被大腸桿菌44752和大腸桿菌0157:H7菌體抗原，以常規(guī)方法免 疫大腸桿菌0157:H7菌體抗原的小鼠血清為對(duì)照，用未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，分別測(cè) 定其效價(jià)。由圖4可見(jiàn)常規(guī)免疫法得到的抗大腸桿菌0157:H7抗血清與大腸桿菌44752的反應(yīng) 比與大腸桿菌0157:H7抗原反應(yīng)的效價(jià)還高，交叉反應(yīng)枏當(dāng)嚴(yán)重；而消減免疫法得到的大 腸桿菌0157:H7抗血清與大腸桿菌44752的反應(yīng)明顯減少。即消減免疫使小鼠免疫系統(tǒng)對(duì) 大腸桿菌44752和大腸桿菌0157:H7菌體抗原的共有抗原決定簇的免疫應(yīng)答被抑制，而對(duì)大腸桿菌0157:H7抗原中目的抗原的免疫應(yīng)答則相對(duì)加強(qiáng)。長(zhǎng)程、短程兩種消減免疫方法所得的結(jié)果無(wú)明顯差異。所有小鼠都可獲得耐受，但由于個(gè)體差異，不是每只小鼠的血清都對(duì)目的抗原有較特異性的反應(yīng)，大約l/5小鼠的血清呈現(xiàn)特異性。單克隆抗體的制備按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備免疫原大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。PEG法進(jìn)行融合，間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆，有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行三次克隆化，最終得到19株能穩(wěn)定分泌抗大腸桿菌0157:H7抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別為4D7、 1D8、4A7、 3G12、 1C6、 1H6、 5D8、 5F10、 3F5、 5A2、 5C12、 5H4、 7F1、 6D12、 5F11、 5A5、5A9、 6C11、 7F8。間接ELISA檢測(cè)單克隆抗體的交叉反應(yīng)情況采用間接ELISA檢測(cè)，19株抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體與81株細(xì)菌抗原的交叉 反應(yīng)情況見(jiàn)表1和表2: 1D8、3F5、4A7、4D7、5A2、5C12、7F8與44752(大腸桿菌0157:H19) 呈陰性反應(yīng)，但與大腸桿菌0157:H7反應(yīng)為陽(yáng)性。1C6、 1D8、 1H6、 4A7、 5D8、 5A2雜 交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體特異性較好，且與4株分離株的大腸桿菌0157:H7(E11、E22、 北醫(yī)、天防)有很好的抗體反應(yīng)譜。其它株單克隆抗體均與其他大腸桿菌有在不同程度的交 叉反應(yīng)，其中5F11、 6C11、 6D12、 7F1雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體與所檢測(cè)的細(xì)菌株 均能反應(yīng)。_表1間接ELISA檢測(cè)抗大腸桿菌Q157:H7單克隆抗體與42株細(xì)菌的交叉反應(yīng)結(jié)果不同雜交瘤細(xì)胞株間接ELISA判別結(jié)果菌種名稱(chēng)及菌種號(hào)1D8 4A7 1C6 5D8 5A2 1H6 5C12 5H4 '5F10 3G12大腸桿菌8099 — — — — — 一 — _大腸桿菌44186 _ — — — — + —大腸桿菌44824 _ — — — — 一 _ _大腸桿菌44825 — — — — — — — __ —大腸桿菌44336 — — — — — — — — — —大腸桿菌44338 _ — — _ — — — — _ 一沙門(mén)氏菌50115 — 一 — — — — 一 + _ —沙門(mén)氏菌50303 — — — — — — — — — —沙門(mén)氏菌50309 — — — — — — — — 一 一沙門(mén)氏菌50312 — — — — — — — _ — —沙門(mén)氏菌50770 — — _ _ — 一 一 — — —沙門(mén)氏菌50781 — — — — — — — _ _ —志賀氏菌51510 — — — — _ — \ 一志賀氏菌51512志賀氏菌51513志賀氏菌51514志賀氏菌51515志賀氏菌51516志賀氏菌51517志賀氏菌51518志賀氏菌51519志賀氏菌51521志賀氏菌51522志賀氏菌51524志賀氏菌51361志賀氏菌51499 志賀氏菌51135 志賀氏菌51066 志賀氏菌51067 志賀氏菌51081 金黃色葡萄球菌26113 金黃色葡萄球菌29213 小腸結(jié)腸耶爾森氏菌52216 小腸結(jié)腸耶爾森氏菌52219 肺炎克雷伯氏菌分離株 肺炎克雷伯氏菌46012 弗勞地枸櫞酸菌分離株+大腸桿菌0157:H19 44752—_++_+—+++大腸桿菌0157:H7分離株El 1+_++++—+++大腸桿菌0157:H7分離株E22+—■++++++++大腸桿菌0157:H7分離株北醫(yī)++++++++—+大腸桿菌Q157:H7分離株天防++_+__——++續(xù)表1間接ELISA檢測(cè)抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體與42株細(xì)菌的交叉反應(yīng)結(jié)果菌種名稱(chēng)及菌種號(hào)不同雜交瘤細(xì)胞株間接ELISA判別結(jié)果4D73F55A57F85A97F16D125F11 6C11大腸桿菌8099 大腸桿菌44186 大腸桿菌44824 大腸桿菌44825 大腸桿菌44336 大腸桿菌44338 沙門(mén)氏菌50115 .沙門(mén)氏菌50303 沙門(mén)氏菌50309 沙門(mén)氏菌50312 沙門(mén)氏菌50770 沙門(mén)氏菌50781+++++ —+ + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + +++++++++++++志賀氏菌51510—\+—+\\\\志賀氏菌51512—\———\\\\志賀氏菌51513—\一——\\\\志賀氏菌51514—\——_\\\\志賀氏菌51515_\+—+\\\\志賀氏菌51516\\+\志賀氏菌51517+++++\\+\志賀氏菌51518\\+\志賀氏菌51519+++++\\+\志賀氏菌51521+++++\+\志賀氏菌51522_—一—_++++志賀氏菌51524_一——\\\\志賀氏菌51361—_\\\\\\志賀氏菌51499_一__+志賀氏菌51135++++志賀氏菌51066++++志賀氏菌51067_—\\++++志賀氏菌51081++++金黃色葡萄球菌26113—+\—+++—金黃色葡萄球菌+++小腸結(jié)腸耶爾森氏菌52216++++小腸結(jié)腸耶爾森氏菌52219++++肺炎克雷伯氏齒分離株++++肺炎克雷伯氏齒46012++++弗勞地枸櫞酸齒分離株++++大腸桿菌0157:HI9 44752—— +一 +++++大腸桿菌0157:H7分離株El 1—_ ++ +++++大腸桿菌CH57:H7分離株E22+— ++ _++++大腸桿菌0157:H7分離株北醫(yī)+十++人腸桿菌Q157:H7分離株天防+— —一 ■—++十+表2間接ELISA檢測(cè)抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體與39株細(xì)菌的交叉反應(yīng)結(jié)果,,工^爿^。 不同雜交瘤細(xì)胞株間接ELISA判別結(jié)果菌種名稱(chēng)及菌種號(hào) -~1C6 1D8 4A7 5A2 5D8 1H6 3G12 4D7大腸桿菌44102 — —— ———— —大腸桿菌44109 — —— ———— —大腸桿菌44110 — — — ———— —人腸桿菌44113 — — — — — — — —大腸桿菌44149 — _一__一一 —大腸桿菌44155 — — — — — — — +大腸桿菌44156 ——— —— —— —大腸桿菌44127 — 一一 ——一+ +大腸桿菌44216 — —— — — 一+ +大腸桿菌44505 — — _ — — _+ +大腸桿菌44561 — — — — — —— _大腸桿菌44813 '— 一一 — — 一一 +變形桿菌49001 — — — — — — — -變形桿菌49087 一 — 一 — 一一一 一變形桿菌49106 — — — — — — — —沙門(mén)氏菌50001 _ — — — —沙門(mén)氏菌50041 一一 — _ — — 一 一沙門(mén)氏菌50042 _______ —沙門(mén)氏菌50058 — _ — _ — _一 +沙門(mén)氏菌50061 — — — — — — — —沙門(mén)氏菌50062 — — — — — — — +沙門(mén)氏菌50065 — — — — — — — 一沙門(mén)氏菌50067 — — — — — — — 一沙門(mén)氏菌50136 — 一 — 一一一一 一沙門(mén)氏菌50306 一一一 — 一 — 一 一沙門(mén)氏齒50313 一一 — — 一 — — 一沙門(mén)氏菌50315 — 一一 — 一一一 一沙門(mén)氏菌50322 — 一一 — 一 — + +沙門(mén)氏齒50325 — 一一一 — 一一 一沙門(mén)氏菌50327 一一一一一 — — 一沙門(mén)氏菌50774 一一一一一 — 一 一沙門(mén)氏菌50798 — — — 一一一一 +沙門(mén)氏菌50825 一一 — 一一一一 +沙門(mén)氏菌50885 一一 — 一一 — 一 一沙門(mén)氏菌50866 一一一一一 — + +金黃色葡萄球菌26003 — 一一一一 — 一 一金黃色葡萄球菌26071 — 一一一一 — + +小腸結(jié)腸耶爾森氏菌52215 小腸結(jié)腸耶爾森氏菌52243注- "一"為陰性反應(yīng)，"+ "為陽(yáng)性及應(yīng)，"、"為未進(jìn)ff試驗(yàn)。 . 消減免疫法的優(yōu)勢(shì)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在19株單克隆抗體中，某些株與一些其它血清型的大腸埃希氏 菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌之間有交叉反應(yīng)，這與細(xì)菌之間存有共同抗原 的性質(zhì)相一致。尤其在同種不同型的細(xì)菌之間存在著大量的共同抗原，提示用大腸桿菌 057:H7作為免疫原以常規(guī)方法制備單克隆抗體，有極大的篩選工作量，很難獲得專(zhuān)一針 對(duì)大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。Luciani等在"Production and characterization of monoclonal antibodies specific foi Escherichia coli 0157:H7" —文中用常規(guī)免疫法制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體，獲得 101株分泌抗大腸桿菌OI57:H7的雜交瘤細(xì)胞株，間接ELISA檢測(cè)這些抗體與28株其他 細(xì)菌的交叉反應(yīng)性，結(jié)果有7株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體只與大腸桿菌0157:H7反應(yīng)， 而不與其他細(xì)菌抗原反應(yīng)，比率為7/101。我們?cè)跈z測(cè)與76株其他細(xì)菌交叉反應(yīng)性的基礎(chǔ) 上，獲得特異針對(duì)大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體比率為6/19。對(duì)比而言，我們篩選特異針對(duì)大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體的工作量要小得多。這 恰恰表明我們選用消減免疫法制備菌體表面蛋白專(zhuān)一性單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)。也正是消減免 疫法的這種優(yōu)勢(shì)使我們?cè)诎肽甑臅r(shí)間就獲得了6株特異針對(duì)大腸桿菌0157:H7的單克隆抗 體。目前，利用基因工程技術(shù)可表達(dá)目的蛋白質(zhì)，但此方法存在制備周期長(zhǎng)和抗體親合力相對(duì)較弱等不足之處，而且用表達(dá)蛋白免疫動(dòng)物制備的抗血清只能與變性蛋白反應(yīng)，而很難 結(jié)合天然抗原。我們用消減免疫法制備菌體表面蛋白優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在兩方面 一是回避了 找到、表達(dá)、純化目的蛋白等大量繁瑣的實(shí)驗(yàn)；另一方面采用菌體抗原免疫可以避免小分 子蛋白免疫原免疫效果不佳、產(chǎn)生的抗體反應(yīng)性低，不穩(wěn)定等弊端。 實(shí)施例2
消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟-
(1) 選取4周齡雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大腸桿菌44186為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐 受原的6min、 18h和40h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg，用間 接ELISA檢測(cè)小鼠耐受情況；
(3) 每隔兩周重復(fù)步驟(2)，直至BALB/c小鼠對(duì)所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出現(xiàn)耐受的末次免疫后的7d、14d、28d，以大腸桿菌0157:H7 為免疫原腹腔注射免疫所述對(duì)耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌0157:H7末 次免疫3d取鼠血檢測(cè)效價(jià)，取與所述耐受原反應(yīng)效價(jià)低而與大腸桿菌0157:H7反應(yīng)效價(jià) 高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。
實(shí)施例3
消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟 (1 )選取8周齡雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大腸桿菌44824為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐 受原的16 min、 30h和60 h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環(huán)磷酰胺80mg，用 間接ELISA檢測(cè)小鼠耐受情況；
(3) 每隔兩周重復(fù)步驟(2)，直至BALB/c小鼠對(duì)所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出現(xiàn)耐受的末次免疫后的14dd、 21d、 35d，以大腸桿菌 0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對(duì)耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌 0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測(cè)效價(jià)，取與所述耐受原反應(yīng)效價(jià)低而與大腸桿菌0157:H7 反應(yīng)效價(jià)高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。
實(shí)施例4
消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟
(1) 選取5周齡雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大腸桿菌44336為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐 受原的8min、 22h和46h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg，用 間接ELISA檢測(cè)小鼠耐受情況；
(3) 每隔兩周重復(fù)步驟(2)，直至BALB/c小鼠對(duì)所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出現(xiàn)耐受的末次免疫后的9d 、 16d、 30d，以大腸桿菌 0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對(duì)耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌 0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測(cè)效價(jià)，取與所述耐受原反應(yīng)效價(jià)低而與大腸桿菌0157:H7反應(yīng)效價(jià)高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。 實(shí)施例5
消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟
(1) 選取6周齡雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大腸桿菌44102為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐 受原的12 min、 26h和50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環(huán)磷酰胺150 mg， 用間接ELISA檢測(cè)小鼠耐受情況；
(3) 每隔兩周重復(fù)步驟(2)，直至BALB/c小鼠對(duì)所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出現(xiàn)耐受的末次免疫后的lld、 18d、 32d，以大腸桿菌 0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對(duì)耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌 0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測(cè)效價(jià)，取與所述耐受原反應(yīng)效價(jià)低而與大腸桿菌0157:H7 反應(yīng)效價(jià)高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。
用于做耐受原的大腸桿菌除了上述幾個(gè)實(shí)施例所舉出的，還可以選其它的除大腸桿菌 0157:H7以外的商品化的大腸桿菌。
權(quán)利要求
1.消減免疫法制備大腸桿菌O157:H7抗原單克隆抗體的方法，其特征是包括如下步驟(1)選取4-8周齡雌性BALB/c小鼠；(2)用除大腸桿菌O157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的6-16min、18-30h和40-60h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環(huán)磷酰胺50-150mg，用間接ELISA檢測(cè)小鼠耐受情況；(3)每隔兩周重復(fù)步驟(2)，直至BALB/c小鼠對(duì)所述耐受原耐受；(4)在使所述BALB/c小鼠出現(xiàn)耐受的末次免疫后的7-14d、14-21d、28-35d，以大腸桿菌O157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對(duì)耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌O157:H7末次免疫3d取鼠血檢測(cè)效價(jià)，取與所述耐受原反應(yīng)效價(jià)低而與大腸桿菌O157:H7反應(yīng)效價(jià)高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求所述消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，其特 征是所述步驟(1)為選取5-6周齡雌性BALB/c小鼠。
3. 根據(jù)權(quán)利要求所述消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，其特 征是所述步驟(2)為用除大腸桿菌0157:H7以外的、己分離鑒定的、商品化的大腸桿 菌為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的8-12 min、 22-26 h 和46-50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環(huán)磷酰胺50-150 mg，用間接ELISA 檢測(cè)小鼠耐受情況。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法， 其特征是所述除大腸桿菌0157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為大腸桿菌 44752、大腸桿菌44186、大腸桿菌44824、大腸桿菌44336或大腸桿菌44102
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，其 特征是所述步驟(4)為在使所述BALB/c小鼠出現(xiàn)耐受的末次免疫后的9-lld、 16-18d、 30-32d ，以大腸桿菌0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對(duì)耐受原耐受的BALB/c小鼠， 在用所述大腸桿菌0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測(cè)效價(jià)，取與所述耐受原反應(yīng)效價(jià)低而 與大腸桿菌0157:H7反應(yīng)效價(jià)高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌0157:H7的單克 隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種消減免疫法制備大腸桿菌O157∶H7抗原單克隆抗體的方法，步驟為(1)選BALB/c小鼠；(2)用除大腸桿菌O157∶H7以外的大腸桿菌為耐受原免疫BALB/c小鼠，在注射耐受原后，腹腔注射環(huán)磷酰胺，檢測(cè)小鼠耐受情況；(3)隔兩周重復(fù)步驟(2)，直至BALB/c小鼠對(duì)耐受原耐受；(4)在使BALB/c小鼠出現(xiàn)耐受后，以大腸桿菌O157∶H7免疫BALB/c小鼠，取與耐受原反應(yīng)效價(jià)低而與大腸桿菌O157∶H7反應(yīng)效價(jià)高的小鼠按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌O157∶H7的單克隆抗體。本發(fā)明的方法在不純化抗原的基礎(chǔ)上，較易獲得細(xì)菌抗原的單克隆抗體，提高免疫效果，減少單抗篩選工作量。
文檔編號(hào)C07K16/12GK101323642SQ20081005395
公開(kāi)日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者李君文, 王新為, 王景峰, 諶志強(qiáng), 邱志剛, 婧 郎, 敏 金, 陳照立 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所