一種檢測(cè)大腸桿菌o157:h7的試紙盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種基于菌體熒光染色技術(shù)，并利用單一抗體對(duì)染色的大腸桿菌O157：H7菌體進(jìn)行檢測(cè)的免疫層析試紙盒，包括單一抗體試紙條、熒光染料盒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：使用熒光染料對(duì)大腸桿菌O157：H7菌體進(jìn)行預(yù)染色，再利用大腸桿菌O157：H7的特異性抗體噴涂于試紙條T線捕獲混合樣本中的大腸桿菌O157：H7菌體，達(dá)到對(duì)樣本中菌體的快速、特異性地檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種檢測(cè)大腸桿菌0157:^7的試紙盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)菌學(xué)與免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及單抗體檢測(cè)細(xì)菌的免疫層析試紙條及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]免疫層析技術(shù)(1臟11110。111~0111811:081'即1七)是20世紀(jì)80年代末90年代初在免疫滲濾的基礎(chǔ)上建立的一種快速檢測(cè)技術(shù)，其技術(shù)特征為:將能與待檢樣本中的抗原(或抗體)起抗原抗體反應(yīng)的抗體(或抗原)以帶狀預(yù)先涂敷在免疫層析試紙片的特定位置上，待檢樣本中的抗原(或者抗體)在利用展開(kāi)液展開(kāi)的過(guò)程中預(yù)先被色素標(biāo)識(shí)上，被色素標(biāo)識(shí)上的待檢樣本中的抗原(或者抗體)展開(kāi)特定位置(即帶狀涂敷有抗體(或抗原)的位置)時(shí)，被色素標(biāo)識(shí)上的待檢樣本中的抗原(或者抗體)通過(guò)抗原抗體反應(yīng)被捕捉，因此，在特定位置上形成通過(guò)色素而發(fā)色的顯色線。由于免疫層析技術(shù)不須進(jìn)行結(jié)合標(biāo)記物與自由標(biāo)記物的分離，因而操作簡(jiǎn)單、快速，非常適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)之用。因此，基于免疫層析技術(shù)研制的免疫層析試紙條發(fā)展很快，能通過(guò)免疫反應(yīng)的檢測(cè)都能通過(guò)免疫層析技術(shù)進(jìn)行。
[0003]目前廣泛采用的免疫膠體金層析法試紙條存在以下不足之處:
1.膠體金是一種納米顆粒，制備膠體金納米顆粒較難，且顆粒直徑較難控制均勻；
2.膠體金標(biāo)記過(guò)程中用到強(qiáng)還原劑，同時(shí)要接觸重金屬者離子，對(duì)人體健康和安全有一定影響；
3.膠體金標(biāo)記過(guò)程是物理吸附過(guò)程，故液相時(shí)穩(wěn)定性較差；
4.只有當(dāng)金顆粒集聚到一定量時(shí)，人肉眼才能觀察到紫紅的條帶，且該顏色條帶與背景對(duì)比度不大，從而限制了檢測(cè)靈敏度；
5.不同的材料基質(zhì)效應(yīng)明顯，背景干擾非常大。
[0004]傳統(tǒng)試紙條均采用雙抗體夾心法((1011)316 8111:1130(17 85111(1^1011 ？01~胍1:)檢測(cè)細(xì)菌和、病毒、蛋白質(zhì)、等。此方法特點(diǎn)在于將已知的特異性抗體以一定的量包被于膜上作為檢測(cè)帶，可與金標(biāo)物結(jié)合的二抗作為質(zhì)控帶。而大的抗原分子有多個(gè)抗原位點(diǎn)，試紙條所用抗體不能選擇同一位點(diǎn)，需要進(jìn)行抗體配對(duì)。抗原配對(duì)過(guò)程耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，增加研發(fā)成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種靈敏度高，操作簡(jiǎn)便的定性和定量檢測(cè)混合樣本中檢測(cè)大腸桿菌0157:??！7的試紙盒，為我國(guó)致病菌的檢測(cè)和預(yù)防提供一種簡(jiǎn)便的檢測(cè)和診斷方法及工具。
[0006]一種檢測(cè)大腸桿菌0157出7的試紙盒，包括單一抗體試紙條、熒光染料盒；所述單一抗體試紙條，包括樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和？卩？底板，其具體結(jié)構(gòu)特征是:硝酸纖維素膜粘貼在底板上；在底板的一端為樣品墊，另一端為吸水墊；以寬度為3-4./條切條后即為單一抗體試紙條；所述的硝酸纖維素膜噴有噴有大腸桿菌0157:！！7抗體作為檢測(cè)線I線，抗熒光染料抗體噴質(zhì)控線線； 所述熒光染料盒裝有的熒光染料為碘化丙啶、熒光素雙醋酸酯(印八)、吖啶橙、或318尺61-6611 ；所述抗熒光染料抗體噴涂濃度為質(zhì)量濃度0.01% ；
所述大腸桿菌0157:??！7抗體噴涂濃度為11^/1^。
[0007]檢測(cè)大腸桿菌0157出7的試紙盒進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)的方法，其特征在于包括如下步驟:取待測(cè)樣品，離心后用熒光染料盒中熒光染料進(jìn)行染色5 用IX？”洗3遍并重懸沉淀；取20 111,與1 乂？83混合后加至單一抗體試紙條的樣品墊,反應(yīng)15111111后單一抗體試紙條在紫外燈下判定定性結(jié)果，檢測(cè)線處有條帶，說(shuō)明待測(cè)樣品中有目標(biāo)菌，結(jié)果為陽(yáng)性；檢測(cè)線無(wú)亮帶，說(shuō)明待測(cè)樣品中無(wú)目標(biāo)菌，結(jié)果為陰性；
利用標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度的目標(biāo)菌分別加入到不同的樣品墊上，檢測(cè)線上熒光強(qiáng)度利用熒光定量光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)梯度濃度的目標(biāo)菌在檢測(cè)線上的熒光強(qiáng)度作成標(biāo)準(zhǔn)曲線；讀出待測(cè)樣品在檢測(cè)線上的熒光強(qiáng)度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待測(cè)樣品中的目標(biāo)菌濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。該方法優(yōu)選用于食品樣品中的大腸桿菌0157:！！7檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:
1.單一抗體紙條只需要單一抗體即可完成一種菌的檢測(cè)，避免了抗體配對(duì)問(wèn)題，使用熒光染料抗體制作線；
2.由于不需要氯金酸，也不需要考慮抗體配對(duì)問(wèn)題，且工藝簡(jiǎn)便，制備方便，比傳統(tǒng)膠體金試紙條更節(jié)約成本；
3.一個(gè)菌可以結(jié)合的染料分子比該菌可結(jié)合的抗體要多很多，因此多重試紙條比普通試紙條的靈敏度更高；
4.相對(duì)普通免疫試紙條，不需要膠體金等顯色劑的偶聯(lián)制備步驟，甚至不需要膠金墊，因此更簡(jiǎn)便。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1普通膠體金試紙條結(jié)構(gòu)示意圖圖2本發(fā)明單一抗體試紙條的示意圖圖3其他染料染色菌體后的試紙條檢測(cè)
1.番紅，2.結(jié)晶紫，3.沙黃，4.010(^ (3) ,5.異硫氰酸熒光素圖4大腸桿菌0157:?。?膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果
大腸桿菌 0157 出7 體數(shù)量分別是:1.10^,2.10^,3.106，4 10^,5.10^,6.10^,7.10^,8.空白對(duì)照
圖5大腸桿菌0157:！！7單一抗體試紙條檢測(cè)結(jié)果
大腸桿菌0157出7體數(shù)量分別是:1.空白對(duì)照，2.10^,3.107，4 10^,5.10^,6.104，7.1()3,8.102。

【具體實(shí)施方式】
[0010]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1:本發(fā)明單一抗體試紙條結(jié)構(gòu)描述、制備方法
1.本發(fā)明試紙盒
檢測(cè)大腸桿菌0157:??！7的試紙盒,包括單一抗體試紙條、突光染料盒；所述單一抗體試紙條，包括樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和？卩？底板，其具體結(jié)構(gòu)特征是:硝酸纖維素膜粘貼在底板上；在底板的一端為樣品墊，另一端為吸水墊；以寬度為3-4./條切條后即為單一抗體試紙條；所述的硝酸纖維素膜噴有噴有大腸桿菌0157:??！7抗體作為檢測(cè)線丁線，抗熒光染料抗體噴質(zhì)控線線；
熒光染料盒中裝有熒光染料碘化丙啶、熒光素雙醋酸酯(印八)、吖啶橙、或3181？ 61-6611.抗熒光染料抗體噴涂濃度為質(zhì)量濃度0.01% ；
所述大腸桿菌0157:??！7抗體噴涂濃度為11^/1^。
[0011]2.膠體金試紙條的制備
2.1膠體金溶液的制備
采用檸檬酸三鈉還原法進(jìn)行制備，具體步驟如下:取100此超純水裝入潔凈的燒杯中，向其中加入1此濃度為1%的撤11(?溶液，置于磁力攪拌器上邊攪拌邊加熱煮沸后，立即加入1%檸檬酸三鈉溶液。最后當(dāng)溶液顏色變?yōu)橥噶恋募t色后，繼續(xù)攪拌10 111111并停止加熱，待其自然冷卻至室溫后，4-(:保存?zhèn)溆谩?br> [0012]2.2金標(biāo)抗體的制備
吸取一定量的膠體金溶液于潔凈的小燒杯中，用0.2 I 1(?溶液將邱值調(diào)整為8.1 ；室溫條件下，邊攪拌邊逐滴加入抗體稀釋液至終濃度為20 9 反應(yīng)1卜后，逐滴加入1/10體積的1% ？26 20000，攪拌30 ―!!后，再逐滴加入1/10體積的封閉劑溶液；繼續(xù)攪拌30 111111^,41^5000 1^111離心30 0111,棄上清，沉淀用原體積1/10的膠體金重懸液重懸。
[0013]2.3膠體金試紙條的制備及組裝
按10 ^17(3111的噴金量噴于膠金墊上，301真空干燥2 11后，檢測(cè)線和控制線分別用2.0呢加[抗目的菌抗體體和1.0卜后用0.5% 07八進(jìn)行封閉，然后置于371條件下充分干燥；將濾紙、樣品墊、膠金墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次搭接粘于？乂？底板上，用810001切割機(jī)切成4臟寬條狀后裝入卡殼，置于包裝袋中，加干燥劑密封，于常溫下保存。具體如圖1。
[0014]3.檢測(cè)
搖床中取出培養(yǎng)好的細(xì)菌，用含5%吐溫20的1撲83洗3遍，期間用75%乙醇洗一遍，II印111離心5111111。用熒光染料盒中碘化丙啶(？1 )染色洗好后的菌體，直接加入？I即可，？1濃度25118加1染色5111111后用5%吐溫20的1彳？83洗3遍并重懸沉淀；
取20 111菌體染色后的混合液，與90 1115%吐溫20的1撲83混合后加入我們所制備的單一抗體試紙條和膠體金試紙條的加樣孔中，反應(yīng)15111111后單一抗體試紙條在紫外燈下判定結(jié)果，檢測(cè)線處有條帶，結(jié)果為陽(yáng)性。檢測(cè)線無(wú)亮帶，結(jié)果為陰性，并與所制備的膠體金試紙條作比較；
由普通膠體金試紙條與單一抗體試紙條的示意圖，圖1與圖2的比較可知，由以以上內(nèi)容可知，單一抗體試紙條1、單一抗體試紙條只需要單一抗體即可完成一種菌的檢測(cè)，避免了抗體配對(duì)問(wèn)題，使用熒光染料抗體制作線。2、一個(gè)菌可以結(jié)合的染料分子比該菌可結(jié)合的抗體要多很多，因此單一抗體試紙條比普通試紙條的靈敏度更高。3、相對(duì)普通免疫試紙條，不需要膠體金等顯色劑的偶聯(lián)制備步驟，甚至不需要金墊，因此更簡(jiǎn)便。4、由于不需要氯金酸，也不需要考慮抗體配對(duì)問(wèn)題，可以簡(jiǎn)化工藝，節(jié)約成本。
[0015]實(shí)施例2:其他染料染色菌體后的試紙條檢測(cè)用普通染料蕃紅、沙黃、結(jié)晶紫和常見(jiàn)熒光染料010(^(3),異硫氰酸熒光素([110對(duì)大腸桿菌0157:！！7進(jìn)行染色10 -11后，上樣到本發(fā)明的試紙條上。0線噴相應(yīng)的染料抗體；結(jié)果如圖3所示，其他染料發(fā)現(xiàn)均不能在試紙條上進(jìn)行顯色。推測(cè)原因可能是這些染料不適合應(yīng)用于試紙條，他們與菌體結(jié)合的同時(shí)，與試紙條的硝酸纖維素膜或樣品墊等也結(jié)合，導(dǎo)致染色的菌體不能在試紙條上遷移，最終不能顯色。而本發(fā)明篩選的碘化丙啶、熒光素雙醋酸酯(印八)、吖啶橙、或3181？ 61-66??！四種熒光染料可以較好的適合試紙條的使用，染色菌體可在試紙條上遷移，并在I線上顯色。
[0016]實(shí)施例3:本發(fā)明試紙盒檢測(cè)大腸桿菌0157:！！7 取實(shí)施例1制備的試紙盒；
取菌體數(shù)量分別為102、103、104、105、106、107、1010大腸桿菌0157出7懸液使用0.01%熒光染料染溶液色5 111111.將染色結(jié)束的菌液滴加4滴樣品(約100 9 1)于試紙條加樣孔中。反應(yīng)1501=后在紫外燈下判定結(jié)果，檢測(cè)線處有兩條帶，結(jié)果為陽(yáng)性。檢測(cè)線無(wú)亮帶，結(jié)果為陰性；
與相同菌體數(shù)量大腸桿菌0157:！！7膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果比較，圖4大腸桿菌0157:117膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果表明其最底檢測(cè)限在菌體數(shù)量105至104之間。大腸桿菌0157:取單一抗體試紙條檢測(cè)結(jié)果表明其最底檢測(cè)限在菌體數(shù)量至少在103以下，由此我們可以得出本發(fā)明大腸桿菌0157 $7單一抗體試紙條(見(jiàn)圖5)比大腸桿菌0157出7膠體金試紙條(圖4)更加靈敏，高出1個(gè)以上數(shù)量級(jí)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)大腸桿菌0157:??！7的試紙盒，其特征在于包括單一抗體試紙條、熒光染料盒；所述單一抗體試紙條，包括樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和？卩？底板，其具體結(jié)構(gòu)特征是:硝酸纖維素膜粘貼在底板上；在底板的一端為樣品墊，另一端為吸水墊；以寬度為3-4^/條切條后即為單一抗體試紙條；所述的硝酸纖維素膜噴有噴有大腸桿菌0157:?。?抗體作為檢測(cè)線I線，抗熒光染料抗體噴質(zhì)控線 線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙盒，其特征在于所述熒光染料盒裝有的熒光染料為碘化丙啶、熒光素雙醋酸酯(印八)、吖啶橙、或3181？ &6611 ；所述抗熒光染料抗體噴涂濃度為質(zhì)量濃度0.01%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙盒，其特征在于所述大腸桿菌0157:?。?抗體噴涂濃度為1呢/⑴匕
4.一種利用如權(quán)利要求1所述檢測(cè)大腸桿菌0157:??！7的試紙盒進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)的方法，其特征在于包括如下步驟:取待測(cè)樣品，離心后用熒光染料盒中熒光染料進(jìn)行染色5…!!，用1 X？”洗3遍并重懸沉淀；取20 111,與1 X？”混合后加至單一抗體試紙條的樣品墊，反應(yīng)1501=后單一抗體試紙條在紫外燈下判定定性結(jié)果，檢測(cè)線處有條帶，說(shuō)明待測(cè)樣品中有目標(biāo)菌，結(jié)果為陽(yáng)性；檢測(cè)線無(wú)亮帶，說(shuō)明待測(cè)樣品中無(wú)目標(biāo)菌，結(jié)果為陰性；利用標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度的目標(biāo)菌分別加入到不同的樣品墊上，檢測(cè)線上熒光強(qiáng)度利用熒光定量光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)梯度濃度的目標(biāo)菌在檢測(cè)線上的熒光強(qiáng)度作成標(biāo)準(zhǔn)曲線；讀出待測(cè)樣品在檢測(cè)線上的熒光強(qiáng)度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待測(cè)樣品中的目標(biāo)菌濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的樣品為食品樣品。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104316686SQ201410533005
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】徐鋒, 魏華, 王登遠(yuǎn), 武曉麗, 葉若松, 甘敏, 陳星星, 楊棟, 劉琚珥, 許恒毅, 胡海寧 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)