抗krs單克隆抗體及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種選擇性地與KRS(Lysyl?tRNA synthetase，賴氨酰?tRNA合成酶)結合的抗KRS抗體及其用途，具體而言，本發(fā)明涉及與人KRS結合的抗體或其片段、該抗體或其片段的生產方法、以及包含該抗體或其片段的癌或自身免疫性疾病和炎性疾病診斷用組合物。本發(fā)明的抗體或其片段與人KRS特異性結合，與包含相同的ARS家族的其它蛋白質無交叉反應性，能夠進行KRS檢測和抑制，因而能夠用于KRS檢測和KRS相關疾病的癌或自身免疫性疾病和炎性疾病診斷目的。
【專利說明】
抗KRS單克隆抗體及其用途
技術領域
[0001] 本申請要求2013年12月30日提交的韓國專利申請第10-2013-0166791號的優(yōu)先 權，上述說明書整體為本申請的參考文獻。
[0002] 本發(fā)明設及選擇性地與KRS(Lysyl-tRNA synthetase,賴氨酷-tRNA合成酶）結合 的抗KRS抗體及其用途，更具體而言，本發(fā)明設及與人KRS結合的抗體或其片段、該抗體或其 片段的生產方法、W及包含該抗體或其片段的癌或自身免疫性疾病和炎性疾病診斷用組合 物。
【背景技術】
[0003] 氨酷-tRNA合成酶(ARS)是發(fā)揮使特定氨基酸與其對應的tRNA結合的作用的酶，在 高等生物的情況下，由包括基于氨基酸種類的20種酶、W及AIMP1 (p43)、AIMP2(p38)、AIMP3 (pl8)等與多合成酶復合物形成有關的巧巾酶在內的23種酶構成，除了參與多合成酶復合物 的酶W外，還有若干種也W自由形態(tài)存在。但是，近來，據報道，運些酶除了基本的功能W 夕h在特定環(huán)境下還具有多種多樣不同的活性功能，KRS(賴氨酷-tRNA合成酶)就是其中之 一。已經明確KRS通過活化巨隧細胞而誘導免疫反應，據報道，由TNF-a促進分泌到細胞外的 KRS通過基于p38絲裂原活化蛋白激酶等的信號轉導而使巨隧細胞的基于TNF-a的活性增 加，或者促進細胞的遷移。另外，近來還明確了 KRS與各種各樣的疾病有關?；谘仔约∪饧?病患者報道了存在針對KRS的自身抗體;基于作為盧伽雷氏化OU Gehrig)病的原因的S0D1 基因突變患者報道了 KRS與該酶結合而參與該疾病;近來，基于癌細胞報道了憐酸化的KRS 有助于層粘連蛋白受體的穩(wěn)定化，因而促進癌細胞的轉移。由運樣的結果表明，KRS可W存 在于自身免疫性疾病和癌患者的血清內，能夠用作重要的生物診斷標記物。
[0004] 但是，盡管作為針對WKRS為代表的ARS等的生物標記物具有重要性，但由于ARS等 在蛋白結構上有許多類似之處，通過免疫反應由動物得到的抗體顯示出與其它ARS也發(fā)生 結合的交叉反應，很多情況下無法生成高強度的抗體。從具有優(yōu)異的靈敏度W及無ARS間交 叉反應的方面出發(fā)，預測本發(fā)明的抗體是不僅可用于研究、而且可用于診斷并且工業(yè)實用 性也高的抗體。

【發(fā)明內容】

[0005] 發(fā)明所要解決的課題
[0006] 本發(fā)明人在對與KRS特異性結合的抗體進行研究的過程中，從利用隧菌體展示方 法制造的文庫中找出了與KRS特異性結合的片段，并明確了其序列和結合特異性，從而完成 了本發(fā)明。
[0007] 因此，本發(fā)明的目的在于提供一種與人KRS結合的抗體或其片段。
[000引本發(fā)明的另一目的在于提供一種多核巧酸，其編碼上述抗體或其片段。
[0009] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種載體，其包含上述多核巧酸。
[0010] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種細胞，其包含上述載體。
[0011] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種與人KRS結合的抗體或其片段的生產方法。
[0012] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種KRS特異性檢測方法，其包括:使抗體或其片段與 試樣接觸的步驟;和對上述抗體或其片段進行檢測的步驟。
[0013] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種癌診斷用組合物，其包含上述抗體或其片段作為 有效成分。
[0014] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種自身免疫性疾病診斷用組合物，其包含上述抗體 或其片段作為有效成分。
[0015] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種炎性疾病診斷用組合物，其包含上述抗體或其片 段作為有效成分。
[0016] 用于解決課題的手段
[0017] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種與人KRS結合的抗體或其片段，其包含抗體輕 鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)，該抗體輕鏈可變區(qū)(VL)包含:包含序列號1所表示的 氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDIOL1、包含序列號2所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDR) L2、和包含序列號3所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDIOL3,該抗體重鏈可變區(qū)（VH)包 含:包含序列號4所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)(CDIOH1、包含序列號5所表示的氨基酸 序列的互補決定區(qū)（CDR)肥、和包含序列號6所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDR)H3。
[0018] 為了達到本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明提供一種多核巧酸，其編碼上述抗體或其片 段。
[0019] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種載體，其包含上述多核巧酸。
[0020] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種細胞，其包含上述載體。
[0021] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種與人KRS結合的抗體或其片段的生 產方法，該生產方法包括:在多核巧酸進行表達的條件下培養(yǎng)上述細胞、生產包含輕鏈和重 鏈可變區(qū)的多膚的步驟;和由上述細胞或培養(yǎng)上述細胞的培養(yǎng)基回收上述多膚的步驟。
[0022] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種KRS特異性檢測方法，其包括:使抗 體或其片段與試樣接觸的步驟;和對上述抗體或其片段進行檢測的步驟。
[0023] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種癌診斷用組合物，其包含上述抗體 或其片段作為有效成分。
[0024] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供上述抗體或其片段在癌診斷用制劑制造 中的用途。
[0025] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種個體的癌診斷方法，其通過下述步 驟來進行：（a)由個體獲得生物學試樣的步驟；（b)利用第1項的抗體或其片段測定上述生物 學試樣內的KRS蛋白質水平的步驟;和(C)將上述KRS蛋白質水平與正常個體的KRS蛋白質水 平進行比較的步驟。
[0026] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種自身免疫性疾病診斷用組合物，其 包含上述抗體或其片段作為有效成分。
[0027] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供上述抗體或其片段在自身免疫性疾病診 斷用制劑制造中的用途。
[0028] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種個體的自身免疫性疾病診斷方法， 其通過下述步驟來進行：（a)由個體獲得生物學試樣的步驟；（b)利用第1項的抗體或其片段 測定上述生物學試樣內的KRS蛋白質水平的步驟;和（c)將上述KRS蛋白質水平與正常個體 的KRS蛋白質水平進行比較的步驟。
[0029] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種炎性疾病診斷用組合物，其包含上 述抗體或其片段作為有效成分。
[0030] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供上述抗體或其片段在炎性疾病診斷用制 劑制造中的用途。
[0031] 為了達到本發(fā)明的又一目的，本發(fā)明提供一種個體的炎性疾病診斷方法，其通過 下述步驟來進行：（a)由個體獲得生物學試樣的步驟；（b)利用第1項的抗體或其片段測定上 述生物學試樣內的KRS蛋白質水平的步驟;和(C)將上述KRS蛋白質水平與正常個體的KRS蛋 白質水平進行比較的步驟。
[0032] 下面，詳細說明本發(fā)明。
[0033] 本發(fā)明提供一種與人KRS結合的抗體或其片段，其包含抗體輕鏈可變區(qū)（VL)和抗 體重鏈可變區(qū)(VH)，該抗體輕鏈可變區(qū)(VL)包含:包含序列號1所表示的氨基酸序列的互補 決定區(qū)（CDIOL1、包含序列號2所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDIOL2、和包含序列號3 所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDIOL3,該抗體重鏈可變區(qū)（VH)包含:包含序列號4所 表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDR)Hl、包含序列號5所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū) (CDR)肥、和包含序列號6所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDR)H3。
[0034] 賴氨酷-tRNA合成酶化RS，Lys}d-tRNA synthetase)是促進賴氨酸(Xys)與tRNA的 結合的酶，是ARS(氨酷-tRNA合成酶，aminoa巧1 tRNA synthetase)的一種。本發(fā)明的KRS通 常表示天然型或重組人KRS和人KRS的非人源同族體。
[0035] 在本說明書中，"抗體"、"抗KRS抗體"、"人源化抗KRS抗體"和"修飾人源化抗KRS抗 體"、"anti-KRS ant化ody"等用語W最廣義的含義使用，具體而言，包括單克隆抗體(包括 單克隆抗體、全長單克隆抗體）、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片 段(例如，可變區(qū)和顯示出目標生物活性(例如與KRS的結合)的抗體的其它部分）。
[0036] 本發(fā)明的抗體是為了能夠與KRS選擇性地結合而在輕鏈CDR和重鏈CDR中包含特定 氨基酸序列的抗體，將單克隆抗體和多克隆抗體全部包括在內，優(yōu)選為單克隆抗體。此外， 本發(fā)明的抗體將嵌合抗體、人源化的抗體、人抗體全部包括在內，優(yōu)選為人抗體。
[0037] 本發(fā)明的單克隆抗體表示由實質上為同質抗體的集團獲得的抗體，即，構成集團 的各個抗體除了有可能少量天然存在的突變W外是相同的。單克隆抗體極其特異性地與單 一抗原表位結合。
[0038] "單克隆"運一用語是指抗體表現(xiàn)出可W由實質上相同的集團獲得的相同的抗體 特性，未必要利用特定方法來生產抗體。例如，本發(fā)明的單克隆抗體可W利用文獻[參照： Kohler et al.(1975)NaUire 256:495]中初次記載的雜交瘤方法來制造，或者可W利用重 組DNA方法(參照:美國專利第4816567號)來制造。此外，例如可W利用文獻[參照:Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628、Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597和 Presta(2005)J.Allergy Clin. Immunol. 116:731]中記載的技術由隧菌體抗體文庫進行分 離。
[0039] 本發(fā)明的抗體具體而言包括嵌合抗體，該情況下，重鏈和/或輕鏈的一部分由特定 種屬起源、或者與特定抗體的相應序列相同或顯示出同源性，只要顯示出本發(fā)明的抗體優(yōu) 選的生物學活性(例如與KRS的選擇性結合），其余部分可W由其它種屬起源、或者與其它抗 體的相應序列相同或顯示出同源性[參照：美國專利第4816567號和Morrison et al., (1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855]〇
[0040] 人源化抗體是將人抗體的序列和非人(例如小鼠、大鼠）抗體的序列均包含在內的 抗體，一般來說，除了與表位結合的部位(CDR)W外的其余部分是人抗體的序列，與表位結 合的部位可W包含非人來源的序列。
[0041] 完全的人抗體是指僅包含人的免疫球蛋白的蛋白質序列的抗體，可W利用小鼠、 小鼠細胞、或由小鼠細胞起源的雜交瘤來生產，或者可W利用隧菌體展示方法來生產。
[0042] 由生物體生產的天然抗體通常是由2個相同的輕鏈和2個相同的重鏈構成的約 150,000道爾頓的異四聚體性糖蛋白。各輕鏈通過1個共價二硫鍵與重鏈連接，但二硫鍵數(shù) 在不同的免疫球蛋白異構體的重鏈間是多樣化的。各重鏈和輕鏈具有規(guī)則隔離的鏈內二硫 橋。各重鏈在一個末端接續(xù)在可變區(qū)（VH)之后具有多個恒定區(qū)。各輕鏈在一個末端具有可 變區(qū)（VL)，在另一個末端具有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第1恒定區(qū)整齊排列，輕鏈的 可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)整齊排列。認為特別的氨基酸殘基在輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)間形 成界面。
[0043] 抗體的"可變區(qū)"或"可變結構域"是指抗體的重鏈或輕鏈的氨基末端結構域。重鏈 的可變區(qū)記為"VH"或"Vh"，輕鏈的可變區(qū)記為"VL"或"Vl"。運些結構域通常為抗體的最可變 的部分，包含抗原結合部位。
[0044] "超變性化ypervariable)"是指下述情況:上述可變區(qū)內的若干個序列等在抗體 間的序列中廣范圍地不同，包含與各特定抗體對其特異性抗原決定簇的結合及特異性直接 關聯(lián)的殘基。
[0045] 在全部的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)中，超變性為互補決定區(qū)或超變環(huán)化VL)，集中 于公知的3個區(qū)域等。CDR通過文獻[Kabat等、1991,In:Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service〉National Institutes of Health,Bethesda ,MD.]中的序列比較進行限定，另一方面，HVL如文獻[化othia and Lesk 1987. J.Mol. Biol. 196:901-917]所記載，由上述可變區(qū)的S維結構進行結構限定。如Kabat 所限定的那樣，CDR-L1在輕鏈可變區(qū)中大致位于殘基24-34，CDR-L2大致位于殘基50-56， CDR-L3大致位于殘基89-97; CDR-H1在重鏈可變區(qū)中大致位于殘基31-35，CDR-H2大致位于 殘基50-65，CDR-冊大致位于殘基95-102。
[0046] 上述重鏈和輕鏈各自之中的3個CDR等被框架區(qū)（FR)所分離，上述區(qū)域包含鮮有可 變傾向的序列等。上述重鏈和輕鏈中上述FR和CDR從可變區(qū)的氨基末端至簇基末端按下述 順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。上述FR的大巧斤疊配置不僅使上述各鏈內 部的CDR相互接近，而且還與其它鏈的CDR接近。生成的形態(tài)有助于抗原結合部位（參照 Kabat等，1991，NIH Publ .No.91-3242，Vol. 1,647-669頁），但不需要所有的CDR殘基等直接 參與抗原結合。
[0047] 本發(fā)明的抗體的特征在于，屬于輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的各CDR分別包含特定 序列，從而與KRS特異性結合，具體而言，本發(fā)明的抗體也為下述抗體，其包含抗體輕鏈可變 區(qū)(化)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)，該抗體輕鏈可變區(qū)(VL)包含:包含序列號1所表示的氨基酸 序列的互補決定區(qū)（CDR)Ll、包含序列號2所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDR)L2、和包 含序列號3所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDI0L3,該抗體重鏈可變區(qū)（VH)包含:包含 序列號4所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDR)Hl、包含序列號5所表示的氨基酸序列的 互補決定區(qū)（CDR)肥、和包含序列號6所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDR)H3。
[0048] 本發(fā)明的抗體可W優(yōu)選包含特定的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，具體而言也為在輕 鏈可變區(qū)中包含序列號13的第137位至第246位氨基酸序列、在重鏈可變區(qū)中包含序列號13 的第1位至第121位氨基酸序列的抗體。
[0049] 本發(fā)明的抗體最優(yōu)選為包含序列號13所表示的氨基酸序列的抗體。
[0050] 本發(fā)明的抗體片段、片段或"其片段"包括:保持有母抗體的至少一部分結合特異 性、典型地至少包含母抗體的抗原結合的一部分或可變區(qū)（例如一個W上的CDR)的抗體的 片段或衍生物。抗體片段的示例包括:化b Jab'、F(ab'）2和Fv片段;雙鏈抗體;線性抗體;單 鏈(Single-chain)抗體分子，例如sc-Fv; W及由抗體片段形成的多特異性抗體，但不限定 于此。典型地，在W摩爾基準表現(xiàn)該活性的情況下，抗體片段或衍生物保持有抗體的KRS結 合活性的10% W上。優(yōu)選的是，抗體片段或衍生物保持有作為母抗體的KRS結合親和度的至 少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高。此外，KRS抗體片段包含實質上不改變 其生物學活性的保守性氨基酸置換(稱為抗體的保守性突變體）。本發(fā)明的"結合化合物"表 示抗體及其片段等全部。
[0051 ] Fab由一個輕鏈W及一個重鏈的CH1(第1恒定結構域)和可變區(qū)形成。Fab分子的重 鏈無法與其它重鏈分子形成二硫鍵。
[0052] 化區(qū)域含有包含抗體的CH1和CH2結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個W 上的二硫鍵通過C冊結構域的疏水性相互作用來維持。
[0053] 化b '含有一個輕鏈W及VH結構域、CH1結構域和CH1與CH2結構域間的區(qū)域，為了在 兩個化b'片段的兩個重鏈間形成鏈內二硫鍵從而形成F(ab'）2分子，F(xiàn)ab'含有一個重鏈的 一部分。
[0054] F(ab'）2含有兩個輕鏈W及為了在兩個重鏈間形成鏈內二硫鍵而包含CH1和CH2結 構域間的固定區(qū)域的一部分的兩個重鏈。因此，由通過兩個重鏈間的二硫鍵共同維持的兩 個化b'片段形成F(ab'）2片段。
[0055] Fv是包含全部的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)、但欠缺恒定區(qū)的抗體片段。
[0056] 單鏈Fv或scFv表示包含抗體的VH和化結構域的抗體片段，此處，運些結構域存在 于單一多膚鏈內。通常，scFv結合抗原，因此，為了形成優(yōu)選的結構而使Fv多膚追加包含VH 和化結構域間的多膚接頭。關于S C F V的概況，參照文獻[參照：P1U C k t h U n (19 9 4) T H E PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES .vol.113.Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag，化w化rk，269-315頁]。另外，參照國際專利公開公報第W088/01649 號和美國專利第4946778號和第5260203號。
[0057] 雙鏈抗體是指具有兩個抗原結合部位的小的抗體片段，此處，片段包含由相同的 多膚鏈連接至輕鏈可變區(qū)（VL)的重鏈可變區(qū)（VH)(VH-VL)。使用不允許在同一鏈上的兩個 結構域間配對的短接頭，使結構域與其它鏈的互補性結構域強制配對，生成兩個抗原結合 部位。雙鏈抗體例如更詳細地記載于歐洲專利第404097號；W0 93/1 1161 ;和文獻 [Hollinger et al.'Proc.Natl.Acad.Sei.USA,90:6444-6448(1993)]中。
[005引線性抗體是指包含形成一對抗原結合部位的一對串聯(lián)Fd片段(VH-CHl-VH-CHl)的 抗體。線性抗體例如如文獻[Zapata等1995，Protein Eng. 8(10) :1057-1062]中公開的那 樣，可W為雙特異性或單特異性。
[0059] "結構域抗體"是僅含有重鏈的可變區(qū)或輕鏈的可變區(qū)的免疫功能性免疫球蛋白 片段。
[0060] 根據若干示例，兩個W上的VH區(qū)域與膚接頭共價結合，生成2價結構域抗體。2價結 構域抗體的兩個VH區(qū)域可W將相同或不同的抗原作為目標。
[0061] 2價抗體包含兩個抗原結合區(qū)域。根據若干示例，兩個結合區(qū)域具有相同的抗原特 異性。但是，2價抗體也可W為雙特異性(bispecific)。
[0062] 本發(fā)明的抗體或其片段可W使用本領域公知的方法、例如隧菌體展示方法或酵母 細胞表面表達系統(tǒng)來生成。制造scFv的方法使用美國專利第4946778號和第5258498號中記 載的方法，用于重組生成化bJab'和F(ab'）2片段的方法使用W0 92/22324等中記載的方 法。
[0063] 本發(fā)明的抗體可W來自包括人在內的哺乳動物、包括鳥類等在內的任意動物。優(yōu) 選的是，上述抗體為人、小鼠、驢、羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的抗體。
[0064] 人的抗體為具有人的免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，包括由人的免疫球蛋白文 庫分離的抗體、或者由針對一種W上的人免疫球蛋白進行了轉基因而不表達內源性免疫球 蛋白的動物分離的抗體(參照美國專利第5939598號）。
[0065] 本發(fā)明的抗體可W為與酶、巧光物質、放射線物質和蛋白質等連接的抗體，但不限 定于此。此外，將上述物質連接至抗體的方法是本領域公知的。
[0066] 本發(fā)明提供一種多核巧酸，其編碼上述的本發(fā)明的抗體或其片段。
[0067] 多核巧酸也記為寡核巧酸或核酸，包括DNA分子等（例如cDNA或基因組（genomic DM)、RNA分子等(例如mRNA)、利用核巧酸類似物等生成的上述DNA或RNA的類似物(例如，膚 核酸等W及非天然產生的核巧酸類似物等)及它們的雜交體等。上述多核巧酸可W形成為 ^j|(single-stranded^^j|(double-stranded)。
[0068] 本發(fā)明的多核巧酸只要編碼本發(fā)明的抗體或片段，則其序列沒有特別限制，可W 優(yōu)選包含序列號7至12所表示的多核巧酸。
[0069] 編碼本發(fā)明的抗體或其片段的多核巧酸通過本領域公知的方法獲得。例如，可W 基于編碼上述抗體的重鏈和輕鏈的一部分或全部的DNA序列或該氨基酸序列，利用本領域 公知的寡核巧酸合成法、例如聚合酶鏈式反應(PCR)法等來合成。
[0070] 此外，本發(fā)明提供一種載體，其包含上述多核巧酸。
[0071] 本發(fā)明的載體是為了本發(fā)明的抗體或其片段的重組生產、W本發(fā)明的多核巧酸的 復制或表達為目的而利用的，通常包含信號序列、復制起點、一個W上的標記基因、增強子、 啟動子和轉錄終止序列中的一個W上。
[0072] 本發(fā)明的載體優(yōu)選為表達載體，更優(yōu)選為包含W可工作的方式與調節(jié)序列、例如 啟動子連接的本發(fā)明的多核巧酸的載體。
[0073] 作為載體之一的質粒(plasmid)是指能夠結合外部的多核巧酸片段的線形或圓形 的雙螺旋DNA分子。載體的其它形態(tài)有病毒載體(viral vector;例如復制缺陷型逆轉錄病 毒（replication defective retroviruses)、腺病毒等和腺相關病毒等（adenoassociated viruses))，此處，附加的DNA片段等能夠導入上述病毒基因組內。特定的載體(例如，包括細 菌來源和附加體的哺乳類載體的細菌性載體等)能夠在可在其中導入運些載體的宿主細胞 中進行自我復制。其它載體(例如，非附加體的哺乳動物載體等)通過導入宿主細胞內而整 合到宿主細胞的基因組內，進而由此與上述宿主基因組一同進行復制。
[0074] 表達載體為能夠表達所選擇的多核巧酸的載體的一個形態(tài)。對于一個多核巧酸序 列來說，在調節(jié)序列對上述多核巧酸序列的表達(例如，水平、時機或表達的位置)產生影響 的情況下，該多核巧酸序列可工作的方式連接"于上述調節(jié)序列。上述調節(jié)序列是對W 可工作的方式與其連接的核酸的表達(例如，水平、時機或表達的位置)產生影響的序列。上 述調節(jié)序列例如可W直接或通過一個或更多的其它分子等(例如，與上述調節(jié)序列和/或上 述核酸結合的多膚等）的作用對所調節(jié)的核酸產生其影響。上述調節(jié)序列包括啟動子、增強 子和其它表達調節(jié)因子等。本發(fā)明的載體優(yōu)選為在Sf il位點包含scFv插入物的pCom3x (phagmid，隧菌粒)載體。
[0075] 另一方面，本發(fā)明提供一種細胞，其包含本發(fā)明的載體。
[0076] 本發(fā)明的細胞只要是在表達本發(fā)明的多核巧酸時可使用的細胞，則其種類沒有特 別限制。
[0077] 本發(fā)明的細胞/宿主細胞可W為原核生物(例如大腸桿菌）、真核生物(例如酵母或 其它菌類）、植物細胞(例如煙草或番茄植物細胞）、動物細胞(例如人細胞、猴細胞、倉鼠細 胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或雜交瘤。
[0078] 適合于本發(fā)明的目的的原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌，例如腸桿菌科 化]11日1'〇6日(31日1'1日。日日日）、例如埃希氏桿菌屬化3(311日1'；[(3111日）、例如大腸桿菌、腸桿菌屬 化nterobacter)、歐文氏菌屬化rwinia)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、變形桿菌 (Proteus)、沙口 氏菌屬（Salmonella)、例如鼠傷寒沙口氏菌（Salmonella typhimurium)、 沙雷氏菌屬（Serrat ia)、例如粘質沙雷氏菌（Serrat ia marcescans )和志賀氏菌屬 (Shigella)、和桿菌（Bacilli )、例如枯草桿菌（B. subtilis)和地衣芽抱桿菌 (B. licheniformis)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、例如銅綠假單胞菌（P.aeruginosa)和鏈 霉菌屬(S化eotomyces)。本發(fā)明的細胞只要能夠表達本發(fā)明的載體，則沒有特別限制，優(yōu)選 大腸桿菌，但不限定于此，例如可W為大腸桿菌ER2537、大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31，537)、大腸桿菌￥3110(41'此27,325)或可表達1^3。2的大腸桿菌，更優(yōu)選為大腸桿菌 邸2537。
[00巧]作為本發(fā)明的細胞，真核生物最廣泛使用釀酒酵母（Saccaromyces cerevisiae)。 但是，不限定于下述例示，可W使用許多其它屬、種和菌株，例如粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母屬宿主、例如乳酸克魯維酵母化.lactis)、脆 壁克魯維酵母化.fragilisKATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母化.扣1肖日'1(3113)(410： 16,045)、威克克魯維酵母化.巧1。1?5阿11111)(41〇：24，178)、沃爾特克魯維酵母化.服1^1) (八10： 56,500)、果蛹克魯維酵母化，壯〇3〇91111日圳111)(41'此36,906)、耐熱克魯維酵母 化.athermotolerans)和馬克斯克魯維酵母化，marxianus);耶氏酵母屬（yarrowiaKEP 402,226);畢赤酵母（Pichia pastoris)化 P 183,070);假絲酵母（Candida);里氏木霉 (Trichoderma reesia化P 244,234));粗糖脈抱霉（Neurospora crassa);許旺酵母屬 (Schwanniomyces)、例如西方許旺酵母(occiden1:alis);和絲狀真菌、例如脈抱菌屬、青霉 菌屬(PeniciIlium)、彎頸霉屬(Torypocladium)和曲霉屬(Aspergillus)宿主、例如構巢曲 菌(nidulans)和黑曲霉(niger)。
[0080] 另一方面，本發(fā)明的細胞可W為動物細胞、特別是脊椎動物細胞。在培養(yǎng)(組織培 養(yǎng)）中，脊椎動物細胞的增殖是常規(guī)方法，技術可廣泛使用。不限于此，有用的哺乳動物宿主 細胞的示例為利用SV40進行了轉化的猴的腎臟CV1細胞系(C0S-7，ATCC C化1651)、人的胚 腎細胞系（由懸浮培養(yǎng)進行亞克隆的293或293細胞[Gr址am等、1977，J Genvirol. 36; 59 ])、 幼小倉鼠的腎臟細胞(BHK，ATCC (XL10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR" (CH0，Urlaub等、1980， Proc.化tl.Acad.Sci.USA 77:4216;例如0644)、小鼠塞爾托利細胞（了]\14，]\1日1116'，1980， Biol.Reprod 23:243-251 )、猴的腎臟細胞(CV1ATCC CCL 70)、非洲綠猴的腎臟細胞(￥6尺0- 76，ATCC CRkl587)、人的宮頸癌細胞化ELA，ATCC.(XL 2)、狗的腎臟細胞(MDCK，ATCC CCL 34)、布法羅大鼠肝細胞(B化3A ATCC CRL 1442)、人的肺細胞(W138，ATCC C化75)、人的肝 細胞化ep G2.HB 8065)、小鼠乳房腫瘤（MMT，060562，ATCC CCL51)、TR1 細胞（Mather等、 1982，Annala NY，Acad，Sci.383:44-68)、MRC 5細胞、FS4細胞、人的肝癌細胞株化ep G2)、 肥K 293細胞(人胚胎腎細胞)和E邱1293FTM細胞，優(yōu)選為CH0細胞、肥K 293細胞(人胚胎腎 細胞)或Exp i 293FTM細胞。
[0081] 本發(fā)明的細胞是用本發(fā)明的多核巧酸或包含該多核巧酸的載體進行轉化或轉染 而得到的培養(yǎng)細胞，其能夠繼續(xù)在上述宿主細胞內表達。重組細胞是指被所要表達的多核 巧酸轉化或轉染的細胞。本發(fā)明的細胞雖然進一步包含本發(fā)明的多核巧酸，但只要調節(jié)序 列未W可工作的方式連接于上述多核巧酸而導入上述細胞內，則該細胞無法W所期望的水 平表達該多核巧酸。
[0082] 本發(fā)明的細胞可W用多種多樣的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。工業(yè)上可利用的培養(yǎng)基、例如 化m's F10(Sigma-Ald;rich Co. ,St.Louis.M0)、最低必需培養(yǎng)基（MEM、Sigma-Ald;rich Co .)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co)、和杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM，Sigma-Aldrich Co.)適合于細胞培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基可W根據需要追加激素和/或其它的生長因子、鹽、緩沖 液、核巧酸、抗生素、微量元素W及葡萄糖或同等能量源。
[0083] 本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選為SB(膜蛋白腺30g，酵母提取物20g，M0PS緩沖液lOg/L)培養(yǎng) 基、化eeStyleTM 293培養(yǎng)基或Expi293TM培養(yǎng)基。
[0084] 另一方面，本發(fā)明提供一種與人KRS結合的抗體或其片段的生產方法，該生產方法 包括:在多核巧酸進行表達的條件下培養(yǎng)上述細胞、生產包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的 多膚的步驟;和由上述細胞或培養(yǎng)上述細胞后的培養(yǎng)基回收上述多膚的步驟。
[0085] 關于本發(fā)明的生產方法的細胞，如上所述，包含編碼本發(fā)明的抗體的多核巧酸。
[0086] 本發(fā)明的生產方法的多膚可W為本發(fā)明的抗體或其片段本身，也可W除了本發(fā)明 的抗體或片段之外還追加結合有其它氨基酸序列。該情況下，可W利用本領域技術人員公 知的方法將其從本發(fā)明的抗體或其片段去除。
[0087] 關于上述培養(yǎng)，根據上述細胞的種類的不同，培養(yǎng)基組成和條件也不同，運可W由 本領域技術人員進行適當選擇和調節(jié)。
[0088] 上述抗體分子蓄積于細胞的細胞質內，或者由細胞進行分泌，或者利用適當信號 序列在細胞周質或細胞的培養(yǎng)基中目標化，優(yōu)選在細胞周質或細胞的培養(yǎng)基中目標化。進 一步，優(yōu)選利用本領域技術人員公知的方法使所生產的抗體分子重折疊，從而具有功能性 的形態(tài)。
[0089] 上述多膚的回收根據所生產的多膚的特性和細胞的特性而不同，運可W由本領域 技術人員進行適當選擇和調節(jié)。
[0090] 上述多膚可W生產于細胞內、周邊的細胞質空間或者適當?shù)胤置诘脚囵B(yǎng)基內。如 果多膚在細胞內生產，則作為第1步驟，為了釋放出蛋白質，有時要破壞該細胞。顆粒型碎 片、宿主細胞或溶解的片段例如通過離屯、分離或超濾而去除。在抗體被分泌到培養(yǎng)基內的 情況下，通常首先使用商業(yè)上可利用的蛋白質濃縮過濾器、例如Amicon或Millipore 化llicon超濾單元將來自運種表達系統(tǒng)的上清液進行濃縮。為了抑制蛋白分解，有時在任 意之前的步驟中包含蛋白酶抑制劑、例如PMSF，為了防止偶發(fā)的污染物的生長，有時含有抗 生素。
[0091] 由細胞制造的抗體例如可W利用徑基憐灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析進 行純化，本發(fā)明的抗體優(yōu)選可W通過親和層析進行純化。
[0092] 本發(fā)明的抗體或其片段與KRS特異性結合，因此，例如對于檢測特定細胞、組織或 血清內KRS表達的、用于檢測KRS蛋白質并進行定量化的診斷分析有用。
[0093] 因此，本發(fā)明提供一種KRS特異性檢測方法，其包括:使第1項的抗體或其片段與試 樣接觸的步驟;和對上述抗體或其片段進行檢測的步驟。
[0094] 為了對上述抗體或其片段進行"檢測"，抗體或其片段通常可W進行可檢測部分 (moiety)的標記。
[00巧]例如，可W利用文獻[Current Protocols in Immunology,Volumes land 2.1991 ,Coligen 等 Ed.Wiley-Interscience,化 w York,N,Y. ,Pubs]中記載的技術，用放射 性同位素或巧光顯示來顯示。放射能力例如可W通過閃爍計數(shù)(scintillation counting) 進行測定，巧光可W利用巧光計進行定量。
[0096] 或者，可W利用多種多樣的酶-底物顯示，上述酶的標記的示例包括:果蛹巧光素 酶和細菌巧光素酶(美國專利第4737456號）之類的巧光素酶、巧光素（luciferin)、2,3-二 氨獻嗦二酬、蘋果酸脫氨酶、脈酶(urase)、辣根過氧化物酶化RP0)之類的過氧化物酶、堿性 憐酸酶、e-半乳糖巧酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖類氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化 酶、和葡萄糖-6-憐酸脫氨酶）、雜環(huán)氧化酶(例如，尿酸酶和黃嚷嶺氧化酶）、乳過氧化物酶、 微過氧化物酶等。使酶與抗體結合的技術例如記載于文獻[0' Sullivan等、1981，Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay , in Methods in Enzyme .(J,Langone&H.Van Vunakis,eds), Academic press，N.Y.，73;147-166]中。
[0097] 標記可W利用多種多樣的公知技術與抗體間接地連接。例如，抗體可W與生物素 連接，屬于上述提到的巧巾廣范圍分類的任意標記等可W與親和素連接，或者可W與此相反 地連接。生物素與親和素選擇性地結合，因此，該標記可W通過運種間接的方式與抗體結 合?；蛘撸瑸榱藢崿F(xiàn)抗體與標記的間接結合，抗體可W與小的半抗原化apten)(例如地高辛） 結合，上述提到的不同類型的標記等中的一種可W與抗半抗原抗體連接(例如抗地高辛抗 體）。因此，能夠實現(xiàn)標記與抗體的間接連接。本發(fā)明的抗體或其片段可用于競爭性結合分 析、直接和間接夾屯、法分析和免疫沉淀分析之類的任意公知的分析方法中。
[0098] 本發(fā)明的抗體或其片段可W用于診斷試劑盒、即用于進行診斷分析的診斷試劑 盒、即與使用說明書一起預先W指定量將試劑等進行包裝而成的組合中。在抗體被酶標記 的情況下，試劑盒可w包含底物和作為提供顯色團或巧光團的底物前體的、酶所要求的輔 助因子。此外，可W包含穩(wěn)定劑、緩沖液(例如封閉緩沖液或溶解緩沖液)等之類的其它添加 劑等。為了提供使分析靈敏度充分優(yōu)化的試劑的溶液內濃度，可W廣泛地改變多種多樣的 試劑的相對量。試劑包含提供溶解時具有適當濃度的試劑溶液的賦形劑。通常可冷凍 干燥的干燥粉末的形式提供。
[0099] 已經明確，由本發(fā)明的抗體檢測出的KRS被TOE-a促進分泌到細胞外時，所分泌的 KRS與巨隧細胞結合而使其活化，從而誘導免疫反應，據報道，結合的KRS通過p38絲裂原活 化蛋白激酶等介導的信號轉導使巨隧細胞的基于TNF-a的活性增加，或者促進細胞的遷移 (Park,S.G.,et al J.,Min,Y.H.,choi,E.C.,Shin,Y.K.,Park,B.J.,Lee,S.W..and Kim,S.2005Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger proinflammatory response 2005proc.化ti.Acad.Sci. 102( 18) ,6356-6361)。此外，最近明確了KRS與各種各 樣的疾病有關?；谘仔约∪饧膊』颊邎蟮懒舜嬖卺槍RS的自身抗體（Geipi，C.， Kanterewicz,E.,Gratacos,J.,Targoff. I.N.&Rodriguez-Sanchez,J.L.Coexistence of two antisynthetases is a patient with the antisynthetse syndrome(1996) Adhritis化eum，39,692-697);基于作為盧伽雷氏病的原因的SODl基因突變患者報道了 KRS與該酶結合而參與該疾病化unst ,C. B. ,Mezey ,E. ,B;rownstein ,M, J,&化iierson , D.Mutations in SODlassociated with amyotrophic laaterl sclerosis cause novel protein interactions(1997)化t.Genet. 15,91-94.);此外，最近基于癌細胞報道了憐酸 化的KRS有助于層粘連蛋白受體的穩(wěn)定化，因而促進癌細胞的轉移（Kim, DG et al Chemical inhibition of prometastatic lysyl-tRNA synthetaselaminin receptor interaction.(2013)Nat Chem.Biol.)。
[0100] 因此，KRS通過檢測而能夠用作用于特定癌或自身免疫性疾病和炎性疾病的診斷、 疾病進展狀態(tài)和治療前后的預后評價的診斷標記物。本發(fā)明的癌或自身免疫性疾病和炎性 疾病的診斷、W及預后的評價可W通過從生物學試樣中檢測出KRS蛋白質來進行。
[0101] 因此，本發(fā)明提供一種癌診斷用組合物，其包含本發(fā)明的抗體或其片段作為有效 成分。此外，本發(fā)明提供一種自身免疫性疾病診斷用組合物，其包含本發(fā)明的抗體作為有效 成分。此外，本發(fā)明提供一種炎性疾病診斷用組合物，其包含本發(fā)明的抗體作為有效成分。
[0102] 因此，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗體或其片段在癌診斷用制劑制造中的用途。此外，本 發(fā)明提供本發(fā)明的抗體或其片段在自身免疫性疾病診斷用制劑制造中的用途。此外，本發(fā) 明提供本發(fā)明的抗體或其片段在炎性疾病的診斷用制劑制造中的用途。
[0103] 因此，本發(fā)明提供一種癌、自身免疫性疾病或炎性疾病診斷方法，其通過下述步驟 來進行：（a)由個體獲得生物學試樣的步驟；（b)利用第1項的抗體或其片段測定生物學試樣 內的KRS蛋白質水平的步驟;和(C)將上述KRS蛋白質水平與正常個體的KRS蛋白質水平進行 比較的步驟。
[0104] 上述生物學試樣包含血液和生物學起源的其它液態(tài)試樣、活組織檢查標本、組織 培養(yǎng)之類的固態(tài)組織試樣或由此來源的細胞。如果舉出更具體的示例，可W為組織、提取 物、細胞溶解物、全血、血漿、血清、唾液、眼球液、腦脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水液、滑液、腹 膜液等，但不限定于此。上述試樣可W由動物、優(yōu)選由哺乳動物、最優(yōu)選由人獲得。上述試樣 可W在檢測前進行預處理。例如可W包括過濾、蒸饋、提取、濃縮、妨礙成分的滅活、試劑的 添加等。此外，可w由上述試樣分離核酸和蛋白質而用于檢測。
[0105] 關于上述檢測，如前所述。
[0106] 本發(fā)明的診斷方法通過將正常個體的生物學試樣內的KRS蛋白質水平與疑似癌、 自身免疫性疾病或炎性疾病的個體的生物學試樣內的蛋白質表達水平進行比較，能夠判斷 實際能否發(fā)生疾病。即，利用本發(fā)明的抗體或其片段由推測為癌、自身免疫性疾病或炎性疾 病的生物學試樣推測出KRS蛋白質水平，并利用本發(fā)明的抗體或其片段由正常個體的生物 學試樣推測出KRS蛋白質水平，對兩者進行比較后，若疑似有疾病的個體的KRS蛋白質水平 高于正常個體，則可W診斷為該疾病。
[0107] 上述癌的種類沒有特別限制，例如可W為乳腺癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃 癌、肝癌、血液癌、骨癌、膜腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼球內黑色素瘤、子宮癌、卵 巢癌、直腸癌、肛口附近癌、結腸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰 金氏病、食道癌、小腸癌、內分泌腺癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道 癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋己細胞淋己瘤、膀脫癌、腎或輸尿管癌、腎細胞 癌、腎骨盆癌、中樞神經系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)淋己瘤、脊髓腫瘤、腦干神經 膠質瘤、垂體腺瘤，優(yōu)選為作用于層粘連蛋白受體而促進轉移的癌、例如肺癌或膜腺癌。
[0108] 上述自身免疫性疾病例如為選自由克隆氏病、紅斑病、過敏癥、風濕病、關節(jié)炎、橋 本氏甲狀腺炎、惡性貧血、阿狄森氏病、I型糖尿病、盧伽雷氏化OU Gehrig)病、炎性肌肉疾 病(例如，多發(fā)性肌炎、皮肌炎、狼瘡、慢性疲勞綜合征、纖維肌痛癥、甲狀腺功能減退癥和甲 狀腺功能亢進癥、硬皮病、白塞氏病、炎性腸病、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、美尼爾氏綜合 征、格林-己利綜合征、干燥綜合征、銀屑病、白齋風、系統(tǒng)性硬皮病、哮喘和潰瘍性大腸炎組 成的組中的疾病，優(yōu)選為風濕性關節(jié)炎、盧伽雷氏病、多發(fā)性肌炎或皮肌炎。
[0109] 上述炎性疾病不限制于此，包括浮腫等之類的一般性的炎癥癥狀，包括炎性腸疾 病、腹膜炎、骨髓炎、蜂窩組織炎、膜腺炎、外傷引起的休克、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、囊性 纖維病、急性支氣管炎、慢性支氣管炎、急性毛細支氣管炎、慢性毛細支氣管炎、骨關節(jié)炎、 痛風、脊椎關節(jié)病、強直性脊柱炎、萊特爾氏綜合征、銀屑病關節(jié)炎、腸疾病性脊椎炎、青少 年強直性脊柱炎、反應性關節(jié)病、感染性關節(jié)炎、后感染性關節(jié)炎、淋菌性關節(jié)炎、結核性關 節(jié)炎、病毒性關節(jié)炎、真菌性關節(jié)炎、梅毒性關節(jié)炎、萊姆病、與"血管炎綜合征"相關的關節(jié) 炎、結節(jié)性多發(fā)動脈炎、過敏性血管炎、盧伽雷氏肉芽腫病、風濕性多發(fā)性肌肉痛、關節(jié)細胞 動脈炎、巧結晶沉積性關節(jié)病、假性痛風、非類風濕性關節(jié)炎、精囊炎、腫銷炎、化骨外上裸 炎（網球肘）、神經病性關節(jié)病(neuropathic joint disease;或者也稱為"夏科氏關節(jié)病 (Charcot joint)")、出血性關節(jié)病、過敏性紫齋、增生性骨關節(jié)炎、多中屯、性網狀組織細胞 瘤、脊柱側凸（scoliosis)、血色素病、血紅蛋白病、高脂血癥、低丙種球蛋白血癥、家族性地 中海熱、白塞氏病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、回歸熱、多發(fā)性硬化、敗血癥、敗血癥性休克、急性呼吸 窘迫綜合征、多器官衰竭、慢性阻塞性肺疾病、類風濕性關節(jié)炎、急性肺損傷、支氣管肺發(fā)育 不良、II型糖尿病、動脈硬化、阿爾茨海默氏癥、家族性寒冷性自身炎癥綜合征、穆-韋二氏 綜合征(Muckle Wells syn化ome)、新生兒多發(fā)炎性疾病、慢性嬰兒神經皮膚關節(jié)綜合征、 成人斯蒂爾病、接觸性皮炎、葡萄胎、PAPA綜合征、高免疫球蛋白D綜合征、和隱熱蛋白相關 周期綜合征等。
[0110] 診斷癌、自身免疫性疾病和炎性疾病的方法可W通過本發(fā)明的抗KRS抗體或其片 段和與其特異性結合的KRS蛋白質間的抗體-抗原反應來實現(xiàn)，本發(fā)明中"抗原-抗體復合 物"運一用語是指，作為癌、自身免疫性疾病和炎性疾病的標記物的KRS和對其具有特異性 的本申請發(fā)明的抗KRS抗體，抗原-抗體復合物的形成量可W通過檢測標簽的信號大小來定 量測定。
[0111] 運樣的檢測標簽可W從酶、巧光物、配體、發(fā)光物、微小顆粒、氧化還原分子和放射 性同位素組成的組中選擇，但未必限定于此。在使用酶作為檢測標簽的情況下，可利用的酶 的示例包括e-葡糖巧酸酶、e-D-葡糖巧酶、0-D-半乳糖巧酶、脈酶、過氧化物酶或堿性憐酸 酶、乙酷膽堿醋酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和60化36、3胞36、葡萄糖氧化酶和巧光素酶、憐 酸果糖激酶、憐酸締醇式丙酬酸簇化酶、天冬氨酸氨基轉移酶、憐酸締醇式丙酬酸脫簇酶、 e-內酷胺酶等，但不限于此。巧光物的示例包括巧光素、異硫氯酸醋、羅丹明、藻紅蛋白、藻 藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醒、巧光胺等，但不限于此。配體的示例包括生物素衍生物 等，但不限于此。發(fā)光物的示例包括叮晚醋、巧光素、巧光素酶等，但不限于此。微小顆粒的 示例包括膠體金、著色的膠乳等，但不限于此。氧化還原分子的示例包括二茂鐵、釘絡合物、 紫羅堿、釀、Ti 離子、二酷亞胺、1,4-苯釀、對苯二酪、K4W(CN)8、[0s(bpy)3]^、[RU(BPY)3]2 +、[M0(CN)8]4-等，但不限于此。放射線同位素的示例包括3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、 57(：〇、58(：〇、59化、90￥、1251、1311、1861?6等，但不限于此。
[0112] 在本發(fā)明的一個實施例中，構建W人的VK3-23/VLlg基因作為骨架、在CDR處插入 隨機序列的文庫，篩選與KRS選擇性結合的隧菌體，對抗體進行分離、純化，分析堿基序列。
[0113] 在本發(fā)明的一個實施例中，利用蛋白印跡法確認了所純化的抗體是否與KRS結合。 其結果，確認到本發(fā)明的抗體與KRS結合。
[0114] 在本發(fā)明的另一實施例中，利用表面共振分析方法測定了本發(fā)明的抗KRS scFv抗 體與KRS的親和度。其結果，確認到本發(fā)明的抗體的平衡解離常數(shù)具有l(wèi)(K)nM的值，顯示出比 較高的親和度。
[0115] 在本發(fā)明的另一實施例中，測定了本發(fā)明的抗KRS scFv抗體的交叉反應性。利用 Luminex微珠測定了本發(fā)明的抗體與包括KRS在內的8種類似蛋白質的反應性，結果確認到 本發(fā)明的抗體不與除KRS外的KRS蛋白質結合。
[0116] 在本發(fā)明的另一實施例中，對本發(fā)明的抗KRS scFv抗體在診斷用抗體方面是否具 有有用性進行了實驗。制作用本發(fā)明的抗體包被的板，將KRS標準物質稀釋為各濃度并進行 反應，通過化ISA測定能否結合。其結果，確認抗體對KRS標準物質W濃度依賴性的方式測定 到結合，確認到本發(fā)明的抗體能夠用于癌或自身免疫性疾病和炎性疾病診斷。
[0117] 在本發(fā)明的另一實施例中，使用利用本發(fā)明的抗KRS抗體開發(fā)的化ISA試劑盒對膜 腺癌患者的血液進行了分析，結果確認到，KRS與作為膜腺癌的最具代表性的生物標記物的 CA19-9W同等程度被表達，確認到KRS能夠作為兩診斷用生物標記物使用，本發(fā)明的抗體是 有用的。
[0118] 此外，為了與膜腺癌的許多候選生物標記物進行比較分析，使用多重微珠檢測 (multiplex bead Assay)試劑盒對其它候選生物標記物進行分析，綜合地進行了比較分 析，結果確認到，與其它生物標記物相比，KRS可W與CA 19-9-同作為代表性的癌生物標記 物使用，本發(fā)明的抗體是有用的。
[0119] 發(fā)明的效果
[0120] 因此，本發(fā)明的抗體或其片段與人的KRS特異性結合，與包含相同的ARS家族的其 它蛋白質無交叉反應性，能夠進行KRS檢測和抑制，因而對于KRS檢測和作為KRS相關疾病的 癌或自身免疫性疾病和炎性疾病診斷是有效的。
【附圖說明】
[0121] 圖1是確認本發(fā)明的抗體是否與目標蛋白質KRS結合的蛋白印跡實驗結果。
[0122] 圖2是利用表面等離子體共振（SPR)測定作為本發(fā)明的抗體的抗KRS scFv Biocon-Kl的結合親和度而得到的結果的圖化d:平衡解離常數(shù)、橫軸:時間(秒）、縱軸:響應 單位咖)）。
[0123] 圖3是利用Luminex多重檢測（Luminex multiplex Assay)方法測定作為本發(fā)明的 抗體的抗KRSscFv Biocon-Kl的交叉反應性而得到的結果的圖（縱軸（F1):巧光強度 (fluorescent intensity)，WRS:色氨酷-tRNA合成酶、皿S:組氨酷-tRNA合成酶、NRS:天冬 酷胺酷-tRNA合成酶:賴氨酷-tRNA合成酶、SRS:絲氨酷-tRNA合成酶、YRS:酪氨酷-tRNA合成 酶、GRS:甘氨酷-tRNA合成酶、AIMP1 :ARS結合多功能蛋白。
[0124] 圖4是用于確認本發(fā)明的抗體是否能夠檢測KRS的化ISA實驗結果（縱軸:450nm吸 光度、橫軸:KRS標準物質的濃度(ng/ml)。
[0125] 圖5是為了使用本發(fā)明的抗體對正常人和癌患者進行血中KRS量的檢測及相互比 較而利用包含本發(fā)明的抗體的化ISA方法由正常人和膜腺癌患者的血清進行測定而得到的 結果(A:血中KRS濃度、B:血中CA19-9濃度）。
[0126] 圖6是為了確認利用了本發(fā)明的抗體的KRS生物標記物測定在膜腺癌診斷用主要 生物標記物中是否具有有用性而利用ELISA和多重微珠檢測方法對許多生物標記物候選組 的生物標記物進行測定、并對所得到的生物標記物定量值綜合地進行比較分析的結果。
【具體實施方式】
[0127] 下面，通過實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0128] 但是，下述實施例僅僅是對本發(fā)明進行例示，本發(fā)明的內容不限定于下述實施例。
[0129] <實施例1>
[0130] scFv文庫構建和抗KRS scFv
[0131] <l-l〉scFv 文庫構建
[0132] scFv文庫利用韓國專利10-0961392號中記載的方法進行構建。
[0133] W人的VH3-23/VLlg基因為基礎，在互補決定區(qū)插入隨機序列，由此設計出文庫并 使用，利用具有e-內酷胺酶基因作為選擇標記物的質粒載體，緊接在e-內酷胺酶基因的前 導序列后導入限制性酶切割序列而制造pFDV質粒載體，插入scFv基因文庫后轉染大腸桿 菌，之后對其進行培養(yǎng)，構建文庫。通過該過程，在文庫內將具有非正常的終止密碼子或移 碼的scFv基因序列大部分除去，能夠提高文庫的品質。利用聚合酶鏈式反應將從培養(yǎng)得到 的文庫中除去了錯誤后的序列等進行擴增后，由此重組scFv基因文庫，插入pComb3X隧菌體 載體中，轉染大腸桿菌、ER2537系的大腸桿菌，獲得最終文庫。在含有簇節(jié)青霉素的SB(超級 肉湯，Super broth)培養(yǎng)基400mL中對文庫進行培養(yǎng)，在600nm的吸光度達到0.5時，加入 l〇UcUF的VCSM3輔助隧菌體，W80巧m進行攬拌，在37°C感染1小時。在此處加入最終為70yg/ mL的卡那霉素抗生素，在30°CW20化pm進行攬拌，培養(yǎng)一晚，生產表面展示有scFv的隧菌 體。次日早上對培養(yǎng)液進行離屯、分離，添加4%的聚乙二醇8000和3%的氯化鋼，使培養(yǎng)液內 的隧菌體沉淀。將沉淀的隧菌體溶解于50mL的PBS緩沖溶液中，W運種方式再次沉淀，最終 溶解于2mL的PBS緩沖溶液中。對其進行離屯、分離，除去該物質，由此得到隧菌體scFv文庫， 通常最終隧菌體文庫中包含l〇i3CPU/mLW上的隧菌體顆粒。
[0134] <1-2〉抗KRS scFv篩選
[0135] 向免疫試管中添加lOiig/ml濃度的KRS，使蛋白質在試管表面吸附1小時，向試管中 添加牛乳粉末3%溶液，對未吸附KRS的表面進行保護。倒空試管后，向其中加入分散于牛乳 粉末3%溶液中的1〇i2CFU的抗體隧菌體文庫，與抗原結合。將非特異性結合的隧菌體抗體用 TBST溶液清洗3次后，利用lOOmM立乙胺溶液對殘留的抗原特異性隧菌體抗體進行洗脫。
[0136] 將洗脫的隧菌體用1.0M濃度的Tr i S-HC1緩沖液（pH7.8)進行中和，在37 °C感染 邸2537大腸桿菌1小時，將感染的大腸桿菌涂布至含有簇節(jié)青霉素的LB化uia-Bedani)瓊 脂培養(yǎng)基上，在37°C進行培養(yǎng)。次日，將培養(yǎng)的大腸桿菌懸浮至3mL的SB簇節(jié)青霉素培養(yǎng)液 中，添加15%甘油，一部分保存于-80°C，將剩余中的50化接種至20mL的SB簇節(jié)青霉素2%葡 萄糖溶液中，在37°C進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)液的600nm光線的吸光度達到0.5時進行離屯、分離，僅 分離出細菌，將其再次懸浮至20mL的SB簇節(jié)青霉素培養(yǎng)液中后，加入1012PFU(隧菌斑形成 單位)的VCSM13輔助隧菌體，緩慢地攬拌，在37°C進行培養(yǎng)。
[0137] 1小時后添加卡那霉素70μg/ml，在30°C快速攬拌(250巧m)，培養(yǎng)一晚。次日，對培 養(yǎng)液進行離屯、分離，將包含隧菌體顆粒的上清液ImL用于文庫，反復進行上述的澄清過程， 使抗原特異性克隆濃縮。
[013引 < 實施例2>
[0139] 抗KRS scFv抗體表達和純化
[0140] 在3-4次左右的反復澄清后，將包含抗體基因的大腸桿菌涂布至含有簇節(jié)青霉素 的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)得到單一菌落，將其接種至2(K)山SB簇節(jié)青霉素溶液中，培養(yǎng)后進 行IPTG誘導，由大腸桿菌的細胞周質(periplasm)表達scFv蛋白質。將大腸桿菌懸浮至40]il 的1 X TES(50mM lYiS，ImM邸TA，20 %薦糖，P冊.0)溶液中后，向其中添加 0.2 X TES溶液60y 1并攬拌，在4°C處理30分鐘W上，進行離屯、分離，在上清液中提取細胞周質。
[0141] <2-1〉針對KRS篩選的scFv抗體表達
[0142] 將篩選的針對KRS的scFv陽性單一菌落克隆在含有簇節(jié)青霉素的SB培養(yǎng)基(膜蛋 白腺30g，酵母提取物20g，M0PS緩沖液10G/L) 5ml中進行培養(yǎng)，開始種子培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)后移 至500ml含有簇節(jié)青霉素的SB培養(yǎng)基中，在0D 600 = 0.5左右時，加入約ImM的IPTG，在30°C 過夜培養(yǎng)后，在大腸桿菌的細胞周質中表達scFv蛋白質。次日，進行離屯、分離，將獲得的大 腸桿菌懸浮至1 X TES緩沖液（50mM Tri S，ImM EDTA，20 %薦糖，P冊.0)中后，添加1.5倍的 0.2 X TES并攬拌，離屯、分離后提取細胞周質。
[0143] <2-2〉篩選的scFv抗體的純化
[0144] 在由細胞周質提取的scFv抗體中加入最終為5mM的MgS〇4,將其與預先在PBS中平 衡的Ni-NTA微珠混合，冷藏1小時并攬拌，與Ni微珠結合，進行親和層析，將未結合的蛋白質 用PBS充分清洗。用含有5mM咪挫的緩沖液進一步充分清洗后，利用200mM咪挫緩沖液將結合 的scFv抗體洗脫。對洗脫的抗體進行透析，通過電泳確認純度，利用BCA方法對蛋白質進行 定量，記錄純化的抗體量后，將一定量分裝冷凍保存。
[0145] <2-3〉免疫印跡和測序
[0146]對于由細胞周質提取的scFv抗體，使用免疫印跡法確認scFv抗體是否與由人細胞 原本表達的KRS結合。通過SDS PAGE對50yg的化la細胞裂解物進行電泳后，利用濕轉印法移 至硝酸纖維素膜，用3%脫脂乳封閉后，添加所提取的scFv抗體，使其結合。為了檢測，使連 接有HRP(辣根過氧化物酶)的抗HA二次抗體與結合的scFv反應，將底物利用ECL試劑在暗室 進行膠片感光，將感光帶與標準分子標記相比，確認到與KRS的大小相當?shù)膸А?br>[0147] 將由此確認的抗原特異性抗體克隆在含有簇節(jié)青霉素的SB培養(yǎng)基10ml中過夜培 養(yǎng)，利用質粒小量提取試劑盒(plasmid miniprep kit)提取質粒DNA，通過毛細管測序服務 (CapillaiT sequencing service) (Macrogen公司）分析堿基序列，基于Kabat蛋白質序列 數(shù)據庫和IMGT(國際免疫遺傳學信息系統(tǒng))分析方法對CDR序列進行分析。
[0148] 其結果，確認到與KRS抗原結合的scFv的個數(shù)共1個，它們的堿基序列為培養(yǎng)基14 中的序列。
[0149] <實施例3>
[0150] 抗KRS scFv抗體的親和度測定
[0151] 利用Prote0n?XPR36SPR(表面等離子體共振)生物傳感器測定了本發(fā)明抗體對KRS 抗原的結合親和度。
[0152] 具體而言，根據制造商的說明書將約lOiig/ml的KRS抗原W約2000至4000反應單位 固定至化C忍片(Bio-Rad 6 X 6傳感器忍片，用于蛋白質-蛋白質相互作用的緊密的具有結 合會K 力的月安偶耳關（Compact capacity 曰 mine coupling for protein-protein interactions))上，將利用PBSW多種濃度稀釋的本發(fā)明的純化scFv抗體（500-30nM)30iil 分別在25°CW50iU/分鐘的速度注入忍片，對其與抗原的相互作用進行定量。將忍片的表面 用0.85 %憐酸進行再生，利用ProteOnManager軟件計算結合速度和解離速度，由解離速度/ 結合速度之比計算平衡解離常數(shù)化D)。
[0153] 其結果，如圖2所示，確認到本發(fā)明的抗體最大具有l(wèi)OOnM的KD值，具有比較高的 KRS親和度。
[0154] <實施例4>
[0155]抗體scFv抗體交叉反應性測定
[0156] 為了判斷scFv抗體與其它抗原是否具有反應性，利用Luminex微珠測定了本發(fā)明 的抗體與KRS和其它ARS家族蛋白的交叉反應性。
[0157] <4-1〉結合有各蛋白的Lum i ne X微珠的制造
[0158] 為了使蛋白質的胺殘基與不同編號的各微珠結合，通過Bio-rad公司的胺偶聯(lián)試 劑盒的實驗過程進行偶聯(lián)。首先，將相當于1 X 106的各微珠移至96孔過濾板中，利用真空歧 管W活化緩沖液進行清洗后，添加50mg/ml S-NHS(N-徑基硫代班巧酷亞胺）和50mg/ml EDACa-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺），在常溫下活化20分鐘。將活化的各微珠用 PBS清洗后，添加純度為90% W上的經純化的各重組ARS抗原、即WRS、HRS、NRS、KRS、SRS、 YRS、GRS、impl (p43) 1化g，在常溫下反應2小時。將與各ARS連接的微珠用PBS清洗2次后，添 加封閉緩沖液，在常溫下反應30分鐘，將未結合的殘基封閉后，用PBS清洗2次，之后再次懸 浮于1(K)山PBS中，保存于遮光的管中。所結合的微珠的數(shù)量用血細胞計數(shù)器進行測定并記 5? 〇
[0159] <4-2〉利用多重檢測(Multiplex Assay)的交叉反應性測定
[0160] 將由細胞周質提取的本發(fā)明的抗體Wl:400的濃度在樣本稀釋液(PBST+2%BSA) 中進行稀釋后，在96孔過濾板中用樣本稀釋液依次各稀釋2次，分注各50iU，在沒有抗體的 空白孔中僅添加樣本稀釋液。按照在結合有ARS的各微珠的每個孔中微珠分別為2000個的 方式分別加入到微珠混合管中，每個孔各分注50山樣本稀釋液。將微珠混合溶液混合后，分 注到孔中，在暗室中反應1小時。反應結束后，利用真空歧管WPBS(2(K)山/孔)清洗3次后，添 加50iU抗(HA)生物素二次抗體，在暗室中追加反應1小時。將與二次抗體結合的微珠用PBS 清洗3次后，為了進行巧光標記，添加化g/ml SA-PE (鏈霉親和素-藻紅蛋白），在暗室中反應 30分鐘，經過用PBS清洗3次的過程，再次懸浮于PBS lOOiil中。對于巧光標記的微珠，利用 Bio-Plex化uminex)200裝置和Bio-Plex manager程序測定巧光的強度，對結果值進行分 析，確認抗體能否與各ARS結合。
[0161] 其結果，如圖3所示，確認到本發(fā)明的抗體在所有濃度下與除KRS外的其它ARS家族 蛋白不發(fā)生反應。
[0162] 因此，確認到本發(fā)明的抗體與其它蛋白質無交叉反應性。
[0163] <實施例5>
[0164] 利用純化的抗KRS scFv抗體的夾屯屯LISA配對試驗
[0165] 為了確認本發(fā)明的抗體在診斷用抗體方面是否具有有用性，進行了 KRS夾屯屯LISA 配對試驗。在化ISA構成中，捕捉抗體使用本發(fā)明的抗體，檢測抗體為作為現(xiàn)有制品的兔多 克隆抗體，進行配對試驗，確認能否繪制對于KRS標準物質的定量曲線。
[0166] 首先，將本發(fā)明的純化抗體在包被緩沖液(0.1M碳酸鋼PH9.0)中進行稀釋，W每孔 100-400ng的方式在化ISA板中分注各10化1，之后在常溫下放置3小時。用PBST清洗3次后， 添加含有2%BSA的PBST 35化1，在常溫下封閉1小時后，用PBST清洗3次。將純化的重組KRS 標準物質按不同濃度在樣本稀釋液中分別稀釋2倍，在包被有抗體的板孔中加入各10化1， 在常溫下反應1小時。反應后，將板用PBST清洗3次，之后添加稀釋的檢測抗體(化g/ml) 10化 1，在常溫下追加反應1小時。為了進行檢測，將板用PBST清洗3次后，加入連接有皿P的抗兔 IgG，在常溫下反應1小時，使其結合。為了確認基于HRP的顯色反應，將板用PBST清洗3次后， 添加作為皿P底物的TMB溶液50iil，確認10分鐘顯色反應，添加2N硫酸50iil，終止顯色反應， 之后利用分析儀在450nm測定吸光度。
[0167] 其結果，如圖4所示，確認到對于重組K標準物質可繪制與ng/ml濃度對應的標準直 線。
[016引 < 實施例6>
[0169] 利用抗KRS抗體的膜腺癌患者的血中KRS生物標記物的比較分析
[0170] 利用新開發(fā)的KRS抗體完成了研究用ELISA試劑盒制品的開發(fā)，利用該試劑盒制品 驗證血中KRS蛋白質作為針對膜腺癌的生物標記物的有用性，為了確認面向患者血清的生 物標記物測定而開發(fā)的化ISA試劑盒能否有用地使用，利用正常人和膜腺癌患者的血清進 行了實驗。
[0171] 由韓國的疾病管理本部韓國人體資源銀行網絡獲得IRB審議通過，由慶北大學醫(yī) 院利用正常人和膜腺癌患者的血清進行實驗。為了驗證血中KRS蛋白質作為針對膜腺癌的 生物標記物的有用性，與現(xiàn)有的作為膜腺癌生物標記物的CA19-9的血中濃度比較而進行實 驗。
[0172] 本
【申請人】開發(fā)的KRS ELISA試劑盒的初制品和商業(yè)化的CA19-犯LISA試劑盒根據 制造者的指示來進行操作。具體而言，在包被有抗體的96孔板中添加樣本稀釋液，在常溫下 放置1小時，用洗涂緩沖液清洗3次W上。在各孔中添加檢測抗體后，在常溫下放置1小時，用 洗涂緩沖液清洗3次W上。添加二次抗體后，在常溫下放置1小時，用洗涂緩沖液清洗3次W 上。在各孔中加入TMB底物，在無光的常溫條件下放置15分鐘，添加2N硫酸，中斷顯色反應， 在450nm測定吸光度。
[0173] 如圖5所示，可知：與正常人組相比，膜腺癌患者組中KRS在統(tǒng)計學上顯著增加。由 運種結果可知，與作為膜腺癌的單一生物標記物的代表性的CA19-9的測定值相比，KRS作為 針對膜腺癌的診斷生物標記物的可用性大，可W驗證本
【申請人】開發(fā)的抗KRS抗體作為膜腺 癌的診斷用抗體顯示出優(yōu)異的效果。
[0174] 此外，為了調查KRS在膜腺癌診斷中作為生物標記物的重要性和有用性，為了與其 它候選生物標記物的測定值一起進行比較分析，購入了工業(yè)化的化ISA試劑盒和多重微珠 檢測試劑盒，對多種候選生物標記物進行了測定。所測定的生物標記物全部為KRS、WRS、 AIMPI、CA19-9、CA125、IL-8、CEA、TNF-a 和 CEACAM-1，實驗結果 W 熱圖的形式來表現(xiàn)。
[0175] 在工業(yè)用化ISA試劑盒和多重微珠檢測試劑盒的情況下，根據制造商的指示來進 行操作，具體而言，多重檢測中，將各生物標記物抗體微珠取相當于2000個微珠的容量，使 最終容量為3ml后，在各孔中添加25iil，并在各孔中添加的樣本。在4°C攬拌并放置一 晚。對各孔進行清洗后，添加25iU的檢測抗體，在常溫下放置1小時30分鐘。在各孔中添加25 的鏈霉親和素-藻紅蛋白，在常溫下放置30分鐘后進行清洗。利用Lumminex儀器(Bio- plex 200)測定板后，使用橫胺苯化挫巧光強度試樣進行分析。
[0176] 如圖6所示，可知：與正常人組相比，膜腺癌患者組中作為膜腺癌的單一生物標記 物的代表性的CA 19-9在統(tǒng)計學上顯著增加。此外可知，與其它候選生物標記物測定值相 比，KRS作為針對膜腺癌的診斷生物標記物的可用性極高，可W驗證本
【申請人】開發(fā)的KRS抗 體作為膜腺癌的診斷用抗體顯示出優(yōu)異的效果。
[0177] 工業(yè)實用性
[0178] 如上所述，本發(fā)明的抗體或其片段與人KRS特異性結合，與包含相同的ARS家族的 其它蛋白質無交叉反應性，能夠進行KRS檢測和抑制，因而能夠用于KRS檢測和作為KRS相關 疾病的癌或自身免疫性疾病和炎性疾病的診斷用目的，因此工業(yè)實用性高。
【主權項】
1. 一種與人KRS結合的抗體或其片段，其包含抗體輕鏈可變區(qū)（VL)和抗體重鏈可變區(qū) (VH)，該抗體輕鏈可變區(qū)（VL)包含:包含序列號1所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDR) L1、包含序列號2所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（CDR)L2、和包含序列號3所表示的氨基 酸序列的互補決定區(qū)（CDR)L3,該抗體重鏈可變區(qū)（VH)包含:包含序列號4所表示的氨基酸 序列的互補決定區(qū)（⑶R)H1、包含序列號5所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)（⑶R)H2、和包 含序列號6所表示的氨基酸序列的互補決定區(qū)(CDR)H3。2. 如權利要求1所述的抗體或其片段，其與人KRS結合，其特征在于，所述抗體是在輕鏈 可變區(qū)包含序列號13的第137位至第246位氨基酸序列、在重鏈可變區(qū)包含序列號13的第1 位至第121位氨基酸序列的抗體。3. 如權利要求1所述的抗體或其片段，其特征在于，所述抗體包含序列號13所表示的氨 基酸序列。4. 如權利要求1所述的抗體或其片段，其特征在于，所述片段為選自由雙鏈抗體、Fab、 Fab'、F(ab)2、F(ab'）2、Fv和scFv組成的組中的片段。5. -種多核苷酸，其編碼權利要求1的抗體或其片段。6. 如權利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含序列號7至12所表示 的多核苷酸。7. -種載體，其包含權利要求5所述的多核苷酸。8. -種細胞，其包含權利要求7所述的載體。9. 一種與人KRS結合的抗體或其片段的生產方法，該生產方法包括： 在多核苷酸進行表達的條件下培養(yǎng)權利要求所述8的細胞、生產包含輕鏈可變區(qū)和重 鏈可變區(qū)的多肽的步驟;和 從所述細胞或培養(yǎng)所述細胞后的培養(yǎng)基中回收所述多肽的步驟。10. -種KRS特異性檢測方法，其包括： 使權利要求1所述的抗體或其片段與試樣接觸的步驟;和 對所述抗體或其片段進行檢測的步驟。11. 一種癌診斷用組合物，其包含權利要求1所述的抗體或其片段作為有效成分。12. 權利要求1所述的抗體或其片段在癌診斷用制劑制造中的用途。13. -種個體的癌診斷方法，其通過下述步驟來進行： (a) 由個體獲得生物學試樣的步驟； (b) 利用權利要求1所述的抗體或其片段測定所述生物學試樣內的KRS蛋白質水平的步 驟;和 (c) 將所述KRS蛋白質水平與正常個體的KRS蛋白質水平進行比較的步驟。14. 一種自身免疫性疾病診斷用組合物，其包含權利要求1所述的抗體或其片段作為有 效成分。15. 權利要求1所述的抗體或其片段在自身免疫性疾病診斷用制劑制造中的用途。16. -種個體的自身免疫性疾病診斷方法，其通過下述步驟來進行： (a) 由個體獲得生物學試樣的步驟； (b) 利用權利要求1所述的抗體或其片段測定所述生物學試樣內的KRS蛋白質水平的步 驟;和 (C)將所述KRS蛋白質水平與正常個體的KRS蛋白質水平進行比較的步驟。17. -種炎性疾病診斷用組合物，其包含權利要求1所述的抗體或其片段作為有效成 分。18. 權利要求1所述的抗體或其片段在炎性疾病診斷用制劑制造中的用途。19. 一種個體的炎性疾病診斷方法，其通過下述步驟來進行： (a) 由個體獲得生物學試樣的步驟； (b) 利用權利要求1所述的抗體或其片段測定所述生物學試樣內的KRS蛋白質水平的步 驟;和 (c) 將所述KRS蛋白質水平與正常個體的KRS蛋白質水平進行比較的步驟。
【文檔編號】A61K39/395GK106062005SQ201480076637
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月29日
【發(fā)明人】金圣勛, 崔淵植, 沈炫輔, 李南周, 樸民花
【申請人】醫(yī)藥生命融合研究團