專(zhuān)利名稱(chēng)：鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla的單克隆抗體及其應(yīng)用本發(fā)明涉及鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla的單克隆抗體，同時(shí)涉及所述單克隆抗體的制備方法以及產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，所述單克隆抗體在檢測(cè)Pla中的應(yīng)用、以及含有所述單克隆抗體的膠體金免疫層析試紙條及其在檢測(cè)鼠疫菌和/或輔助診斷鼠疫中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鼠疫(Plague)是由耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersinia pestis)引起的自然疫源性烈性傳染病。鼠疫免疫檢測(cè)是鼠疫防治工作中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其在鼠疫的發(fā)現(xiàn)、疫區(qū)處理及臨床診斷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。傳統(tǒng)的鼠疫免疫檢測(cè)，主線(xiàn)是針對(duì)Fl抗原。Fl抗原是由耶爾森氏鼠疫桿菌pMTl 質(zhì)粒上cafl基因編碼的一種莢膜蛋白。長(zhǎng)期以來(lái)，F(xiàn)l抗原被認(rèn)為是鼠疫桿菌的特異性抗原，基于Fl的抗原、抗體檢測(cè)方法被認(rèn)為是較可信的鼠疫檢測(cè)和診斷方法。然而，自然界已發(fā)現(xiàn)存在天然缺失Fl抗原的鼠疫菌株，加之，F(xiàn)l抗原是一種溫度調(diào)控表達(dá)抗原，在37°C時(shí)大量表達(dá)，而在時(shí)不予表達(dá)或微量表達(dá)，這也限制了它的應(yīng)用研究范圍。發(fā)展除Fl抗原外的檢測(cè)和診斷技術(shù)較為必要，是鼠疫防治工作中的一個(gè)重要課題。鼠疫菌纖溶酶原激活因子(Plasminogen activator,Pla)是鼠疫菌特有的pPCPl 質(zhì)粒編碼的細(xì)胞表面蛋白酶，研究表明，鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla蛋白是鼠疫菌從皮下感染擴(kuò)散到循環(huán)系統(tǒng)的重要毒力因子(Sodeinde OA, Subrahmanyam YV, Stark K， et al. A surface protease and the invasive character of plague[J]Science,1992, 258(6) :1004-1007 ；Goguen JD, Hoe NP, Subrahmanyam YVBK. Proteases and bacterial virulence :a view fromthe trenches [J]. Infect Agents Dis，1995，4 (1) :47-54)，在鼠疫菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。且Pla的轉(zhuǎn)錄、翻譯不受溫度限制。針對(duì)Pla蛋白進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于鼠疫菌的檢測(cè)和/或輔助診斷鼠疫，特別是對(duì)于Fl抗原缺失鼠疫菌株以及非37°C 條件生長(zhǎng)的鼠疫菌株(特別是鼠疫的傳播媒介蚤的檢測(cè))具有重要意義。目前對(duì)鼠疫菌Pla的檢測(cè)主要是采用PCR技術(shù)，并取得了較好的檢出效果。然而， 該方法對(duì)技術(shù)操作要求比較高，且檢測(cè)過(guò)程需要數(shù)小時(shí)，時(shí)間較長(zhǎng)。另一方面，單克隆抗體相較于多克隆抗體，具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，可作為相關(guān)抗原的生物學(xué)功能研究的重要工具，用于Western blot、免疫沉淀、免疫細(xì)胞化學(xué)等實(shí)驗(yàn)，對(duì)于抗原的研究、相關(guān)疾病的檢測(cè)、診斷、預(yù)后判斷等具有重要意義。但目前未見(jiàn)國(guó)內(nèi)有關(guān)于鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla的單克隆抗體的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla的單克隆抗體，該單克隆抗體對(duì)鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla蛋白有特異性。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供制備所述單克隆抗體的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述單克隆抗體在檢測(cè)Pla蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)Pla蛋白的膠體金免疫層析試紙條，它具有檢測(cè)鼠疫菌和/或輔助診斷鼠疫作用。該膠體金免疫層析試紙條上含有本發(fā)明所述的單克隆抗體。本發(fā)明應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla的單克隆抗體。首先，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供了一種對(duì)鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla蛋白有特異性的單克隆抗體。本發(fā)明中所述的“抗體的特異性”是指單克隆抗體對(duì)相應(yīng)抗原或近似抗原物質(zhì)的識(shí)別能力。特異性高，識(shí)別抗原的能力就強(qiáng)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中， 本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)GST (谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶)-Pla融合蛋白、天然Pla蛋白有特異性，對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有特異性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC NO. C201091或CCTCC NO. C201094的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生?？贵w類(lèi)型分別屬于IgGl和IgG2a。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。按照《國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約》的規(guī)定，產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的兩株雜交瘤細(xì)胞株已保藏在國(guó)際保藏單位之一——中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC，地址中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，郵政編碼430072)，保藏日期2010 年 9 月 16 日，保藏編號(hào)CCTCC NO. C201091、CCTCC NO. C201094。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種制備所述單克隆抗體的方法。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，是將Pla蛋白與已知的標(biāo)簽形成重組蛋白作為抗原，以制備獲得本發(fā)明的單克隆抗體。所述的標(biāo)簽選自谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(GST標(biāo)簽)，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，采用GST與去除信號(hào)肽的Pla蛋白形成的重組蛋白。制備本發(fā)明的單克隆抗體所用的抗原可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備。例如本發(fā)明Pla蛋白可以是重組蛋白，或從鼠疫菌中提取并純化得到的天然Pla蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，以GST-Pla融合蛋白作為抗原免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞作為能夠產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞(免疫細(xì)胞)，與同系動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。篩選能夠產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，并建立雜交細(xì)胞株。上述方法僅是示例性的，例如可以用同樣的方法免疫其他哺乳動(dòng)物，將其脾細(xì)胞作為免疫細(xì)胞。 還可以選擇適宜的骨髓瘤細(xì)胞用于融合，例如用來(lái)自大鼠、小鼠或倉(cāng)鼠的骨髓瘤細(xì)胞。免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合可以按照常規(guī)方法進(jìn)行(Milstein et al., Mechods Enzymol.，1981，73，3-46)。更具體地說(shuō)，免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞可以按照1 4 1 10的比例在培養(yǎng)基中充分混合，在融合促進(jìn)劑的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，例如將預(yù)熱至 37°C的PEG (分子量1000 6000)溶液以30% 60% (W/V)的比例加入培養(yǎng)基。此外，還可以根據(jù)需要適當(dāng)加入佐劑(如二甲基亞砜)以增強(qiáng)融合效果。用于融合的培養(yǎng)基包括 RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基以及其他可用于此類(lèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并根據(jù)需要補(bǔ)加適量的新生小牛血清等物質(zhì)。可以用普通的選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，例如用含有次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的HAT培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)足夠的時(shí)間，以使雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡，一般為幾天至幾周。
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然后篩選產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行單克隆化。得到的產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，可以在普通培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)或者在液氮中長(zhǎng)時(shí)間保存。從雜交瘤細(xì)胞制備本發(fā)明的單克隆抗體時(shí)，可以從雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中獲得抗體，或者將雜交瘤細(xì)胞注入適宜的哺乳動(dòng)物并從動(dòng)物腹水中獲取抗體。前一種方法適于獲得高純度的抗體，后一種方法適于獲取大量、高效價(jià)抗體。通過(guò)上述方法獲得的抗體，可以用常規(guī)方法純化，例如鹽析、凝膠過(guò)濾、親和色譜等方法。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，所述制備單克隆抗體的方法包括用GST-Pla融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能夠分泌對(duì)天然Pla蛋白有反應(yīng)性、對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞后的動(dòng)物產(chǎn)生的腹水中獲取單克隆抗體。在該方案中，具體是用純化的GST-Pla融合蛋白常規(guī)免疫BALB/c小鼠，血清效價(jià)達(dá)1 IO4 IO5時(shí)，將免疫小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。HAT選擇培養(yǎng)第10天，雜交瘤細(xì)胞融合率為65%以上。融合后第10天進(jìn)行第一次ELISA篩選、亞克隆，此后重復(fù)進(jìn)行ELISA篩選及亞克隆3 4次， 直至克隆陽(yáng)性率100%。該方案中篩選出了 3株雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為雜交瘤細(xì)胞株 15 、雜交瘤細(xì)胞株19A4、雜交瘤細(xì)胞株HH4，該3株雜交瘤細(xì)胞株能穩(wěn)定分泌抗Pla的單克隆抗體。將這些株雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并腹腔注射BALB/c小鼠，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗Pla 的腹水，腹水產(chǎn)量2 IOml/只，其效價(jià)達(dá)1 106。這對(duì)于將其應(yīng)用于診斷技術(shù)創(chuàng)造了較好條件。雜交瘤細(xì)胞株15 、雜交瘤細(xì)胞株19A4、雜交瘤細(xì)胞株HH4所分泌產(chǎn)生的單克隆抗體(本發(fā)明中命名為單克隆抗體15 、單克隆抗體19A4、單克隆抗體14H4)，具有高度的抗原結(jié)合特異性。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，為分析Pla單克隆抗體的特異性，本發(fā)明用純化的GST及GST-Pla融合蛋白和天然Pla蛋白進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3株單克隆抗體與包被的純化GST-Pla融合蛋白和天然Pla蛋白均為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，與包被的GST 蛋白均為陰性反應(yīng)。以天然Pla蛋白為抗原，3株單克隆抗體為一抗，HRP-SPA為二抗進(jìn)行 Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示3株單克隆抗體能特異性地識(shí)別提取天然蛋白中的Pla蛋白。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的單克隆抗體的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述單克隆抗體在檢測(cè)Pla蛋白的水平中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)Pla蛋白的制劑，該制劑含有本發(fā)明所述的單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體特異性強(qiáng)、純度高、效價(jià)高，可同時(shí)應(yīng)用于ELISA方法，Western Blot雜交，免疫組織化學(xué)和細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)Pla蛋白的表達(dá)水平。本發(fā)明的另一個(gè)方面還提供了所述單克隆抗體在制備檢測(cè)Pla蛋白的膠體金免疫層析試紙條中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)Pla蛋白的膠體金免疫層析試紙條，該膠體金免疫層析試紙條上含有本發(fā)明所述的單克隆抗體。該含有本發(fā)明所述的單克隆抗體的膠體金免疫層析試紙條可用于檢測(cè)鼠疫菌和/或輔助診斷鼠疫。由于本發(fā)明的單克隆抗體具有高度的抗原結(jié)合特異性，利用本發(fā)明的單克隆抗體建立檢測(cè)技術(shù)，可作為鼠疫菌的檢測(cè)和/或鼠疫的輔助診斷，尤其是對(duì)于Fl抗原缺失鼠疫菌株及非37°C條件生長(zhǎng)的鼠疫菌株的診斷具有重要意義。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面還提供了本發(fā)明的單克隆抗體在制備用于檢測(cè)鼠疫菌和/或輔助診斷鼠疫的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)本發(fā)明的單克隆抗體，具有高度的抗原結(jié)合特異性，主要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)包括免疫小鼠應(yīng)用GST-Pla融合蛋白，而獲得的單克隆抗體經(jīng) ELISA法檢測(cè)證實(shí)，與包被純化的GST-Pla融合蛋白和天然Pla蛋白為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，而與包被GST蛋白均為陰性反應(yīng)，且抗體效價(jià)達(dá)10_6。同時(shí)，以天然Pla蛋白為抗原，3株單克隆抗體為一抗，HRP-SPA為二抗進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示3株單克隆抗體能特異性地識(shí)別提取天然蛋白中的Pla成分，而與其它成分未發(fā)生反應(yīng)。所以，本發(fā)明所制備的Pla單克隆抗體為進(jìn)一步深入研究Pla的功能及其致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，有利于深入探討Pla的功能，將其用于針對(duì)Pla蛋白的檢測(cè)，對(duì)于鼠疫菌的檢測(cè)和/或輔助診斷，特別是對(duì)于Fl抗原缺失鼠疫菌株以及非37°C條件生長(zhǎng)的鼠疫菌株的診斷具有重要意義。


圖1顯示轉(zhuǎn)化體BL21_rPla誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Pla的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖中，1 分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 轉(zhuǎn)化體BL21-rPla誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解后沉淀；3 轉(zhuǎn)化體BL21_rPla誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解后上清；4 轉(zhuǎn)化體BL21-rPla誘導(dǎo)前全菌蛋白；5 轉(zhuǎn)化體BL21_rPla誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解后沉淀經(jīng)初步純化后的產(chǎn)物。圖2為秋水仙素法檢查本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株15 、雜交瘤細(xì)胞株19A4、雜交瘤細(xì)胞株HH4的染色體核型分析圖形(Giemsa染色，X 1000)。圖3為純化腹水的SDS-PAGE圖形。圖中，M 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :15B8a ；2 :15B8b ；3 19A4a ；4 :19A4b ；5 :14H4a ；6 :14H4c ；7 :14H4d。圖4顯示W(wǎng)estern blot鑒定所述單抗特異性識(shí)別天然Pla蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中，M 預(yù)染 marker ；1 :15 ；2 :19A4 ；3 =HH40圖5顯示所述單抗的亞類(lèi)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6A顯示檢測(cè)Pla抗原膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)培養(yǎng)EV76菌體實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖6B顯示檢測(cè)Fl抗原膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)培養(yǎng)EV76菌體實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用于專(zhuān)利程序的微生物保存(一 )分泌本發(fā)明單克隆抗體15 的雜交瘤細(xì)胞株15 保藏日期2010年9月16日；保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；保藏編號(hào)CCTCCNO :C201091 ；分類(lèi)命名雜交瘤細(xì)胞株15&。( 二)分泌本發(fā)明單克隆抗體19A4的雜交瘤細(xì)胞株19A4保藏日期2010年9月16日；保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；保藏編號(hào)CCTCCNO :C201094 ；分類(lèi)命名雜交瘤細(xì)胞株19A4。
具體實(shí)施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過(guò)具體實(shí)施例并配合附圖進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法， 通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。以下各實(shí)施例中，所用原始實(shí)驗(yàn)材料、儀器用具及試劑均可商購(gòu)獲得，以下提供主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器用具及試劑的來(lái)源1實(shí)驗(yàn)材料1) BALB/c小鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK (滬)2007-0005)、昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK (滇)2005-0008)。2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0 購(gòu)自云大生物科技有限公司。3)rPla蛋白購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。4)鼠疫耶爾森氏菌EV76菌株購(gòu)自云南省地方病防治所菌種庫(kù)。2實(shí)驗(yàn)儀器及用具
權(quán)利要求
1.一種對(duì)鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla蛋白有特異性的單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCC NO :C201091或CCTCC NO :C201094的雜交瘤細(xì)胞分泌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，該抗體對(duì)天然Pla蛋白有特異性，對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有特異性。
3.分泌權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏號(hào)為CCTCCNO. C201091 或 CCTCC NO. C201094。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的方法，該方法包括用GST-Pla融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能夠分泌對(duì)天然Pla蛋白有反應(yīng)性、對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞后的動(dòng)物腹水中獲取單克隆抗體。
5.由保藏號(hào)為CCTCCNO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體在體外檢測(cè)樣品中Pla蛋白的表達(dá)水平中的應(yīng)用。
6.由保藏號(hào)為CCTCCNO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體在制備用于檢測(cè)鼠疫菌和/或輔助診斷鼠疫的制劑中的應(yīng)用。
7.一種檢測(cè)Pla蛋白的制劑，該制劑含有由保藏號(hào)為CCTCC NO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
8.—種檢測(cè)Pla蛋白的膠體金免疫層析試紙條，該膠體金免疫層析試紙條上含有由保藏號(hào)為CCTCC NO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
9.一種檢測(cè)鼠疫菌和/或輔助診斷鼠疫的膠體金免疫層析試紙條，該膠體金免疫層析試紙條上含有由保藏號(hào)為CCTCC NO :C201091和/或CCTCC NO :C201094的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鼠疫菌纖溶酶原激活因子Pla的單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCC NOC201091或CCTCC NOC201094的雜交瘤細(xì)胞分泌。本發(fā)明同時(shí)涉及所述單克隆抗體的制備方法以及產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，還涉及含有所述單克隆抗體膠體金免疫層析試紙條及其在檢測(cè)鼠疫菌和/或輔助診斷鼠疫中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102174107SQ201110043910
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月22日
發(fā)明者唐雪, 宋志忠, 尹家祥, 張建中, 杜春紅, 王鵬, 郭英 申請(qǐng)人:云南省地方病防治所