單克隆抗tk1抗體的制作方法
【專利摘要】諸多實(shí)施方案涉及能夠結(jié)合人TK1的血清形式的單克隆抗體或片段以及牽涉使用此類單克隆抗體或片段的試劑盒和方法。
【專利說明】
單克隆抗TK1抗體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明實(shí)施方案總體上涉及單克隆抗TK1抗體、牽涉使用此類單克隆抗TK1抗體的 試劑盒和方法。
[0002] 背景
[0003] 胸苷激酶1，即TK1 (ATP:胸苷5 ' -磷酸轉(zhuǎn)移酶，EC 2.7.1.21)，是一種參與DNA前體 合成的酶。TK1的一種形式還以高水平存在于患有惡性腫瘤的人和動物的血清中。因此，已 經(jīng)出于監(jiān)測和預(yù)后目的而在若干種不同的惡性疾病中使用血清TK1活性測量，但主要用于 白血病和淋巴瘤的情況中。
[0004] 此外，TK1是血液中可以測定的唯一增殖標(biāo)記物，而且如果可用作常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢 驗(yàn)，則有可能提供較大的臨床益處[1 -8 ]。
[0005] 使用放射性底物 125I-dUrd(PROLIFIGEN?TK-REA，DiaSorin Inc)測量血清 TK1活性已經(jīng)有幾十年，但這種放射性酶測定具有有限的用途并且僅用于惡性血液學(xué)惡性 病的情況下[1，2,6]。近年來已經(jīng)可利用非放射性TK1活性測定（TKLIAISON?測定， DiaSorin Inc.)。這是一種靈敏而又穩(wěn)定的測定，并且已經(jīng)在患有血液學(xué)惡性病的人和狗 中提供了臨床上有價值的信息，特別是用于監(jiān)測治療和預(yù)測復(fù)發(fā)[8,9]。
[0006] 在過去的15年間，已經(jīng)可利用針對人TK1的抗體并且能夠測定不同的血液學(xué)和實(shí) 體腫瘤諸如乳腺癌[5，10，11]和若干種其他形式的實(shí)體和血液學(xué)腫瘤[11，12]中的1￥1蛋白 水平而不是TK1活性。
[0007] TK1蛋白測定主要依賴于基于針對TK1的C末端部分而產(chǎn)生的抗TK1抗體的斑點(diǎn)印 跡程序[3,5,10-13]。選擇這種策略用于抗體產(chǎn)生的主要原因是C末端區(qū)域參與TK1的細(xì)胞 周期調(diào)控[14-16]。它含有用于在有絲分裂期間引發(fā)TK1降解的識別序列，并且已經(jīng)假定這 是它可能產(chǎn)生抗體的暴露區(qū)域[3,8，13,20,23-25]。雖然斑點(diǎn)印跡測定已經(jīng)被成功用于許 多研究中[5，10-13]，但主要限制在于它不是臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中的常規(guī)方法。現(xiàn)在有超過六 種不同的抗TK1抗體制劑可商購獲得，并且若干種已經(jīng)顯示能與重組TK1和細(xì)胞TK1反應(yīng) (www.acris_antibodies.com)。然而，常規(guī)臨床實(shí)踐中目前沒有基于抗體的血清TK1測定。
[0008] 難以建立靈敏而且穩(wěn)定的血清TK1測定的主要原因很可能與血液中存在的復(fù)雜而 又可變的TK1形式有關(guān)。近來，已經(jīng)利用人TK1酶和狗TK1酶進(jìn)行了若干項(xiàng)研究，從而表征了 TK1的重組形式、細(xì)胞形式和血清形式[17]。據(jù)發(fā)現(xiàn)，TK1以多種寡聚復(fù)合物存在，并且重要 的是，這些復(fù)合物中僅有一小部分具有酶活性。特別是患有實(shí)體腫瘤疾病的患者中的血清 TK1就是這種情況。寡聚似乎與血液中發(fā)生的二硫化物交聯(lián)的形成有關(guān)，但是當(dāng)腫瘤細(xì)胞解 體且TK1被轉(zhuǎn)運(yùn)至血流中時也很有可能。用還原劑進(jìn)行治療導(dǎo)致血清TK1復(fù)合物發(fā)生一定程 度的改組[2,17]，但關(guān)于免疫測定設(shè)計的這些事實(shí)的后果迄今為止還沒有得到解決。血液 中的TK1蛋白的主要部分不具有酶活性的這一事實(shí)可以解釋TK1酶活性測量在實(shí)體腫瘤疾 病的情況下不是非常有效[18]。因此，非常需要建立能以充分的靈敏度測量血清TK1的常規(guī) 體外診斷程序以供臨床使用。 發(fā)明概要
[0009] 一個目的是提供一種能夠結(jié)合人TK1的血清形式的單克隆抗體或片段。
[0010] 這個目的和其他目的通過如本文中所公開的實(shí)施方案來滿足。
[0011] 所述實(shí)施方案的一個方面涉及一種能夠結(jié)合人胸苷激酶1(TK1)的血清形式的單 克隆抗體或單克隆抗體的片段。所述單克隆抗體或片段對選自由以下各項(xiàng)組成的組的表位 具有特異性：
[0012] 人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2);
[0013] 人TK1 的NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5WPNCPVPGKPGEAV (SEQ ID N0:3)中的至少一個;和
[0014] 人TK1的構(gòu)象依賴性表位。
[0015] 所述實(shí)施方案的另一個方面涉及一種用于測定身體樣本中的細(xì)胞和/或血清TK1 物質(zhì)的水平的方法。所述方法包括使所述身體樣本與根據(jù)以上的單克隆抗體或片段接觸。 所述方法還包括檢測所結(jié)合的單克隆抗體或片段的量。
[0016] 所述實(shí)施方案的另一個方面涉及一種用于測定身體樣本中的細(xì)胞和/或血清TK1 物質(zhì)的水平的試劑盒。所述試劑盒包括已固定至固體載體或欲固定至所述固體載體的根據(jù) 以上的第一單克隆抗體。所述試劑盒還包括根據(jù)以上的第二單克隆抗體。在這方面，所述第 一單克隆抗體對第一表位具有特異性，所述第一表位選自由以下各項(xiàng)組成的組：
[0017] 人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2);
[0018] 人TK1 的NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5WPNCPVPGKPGEAV (SEQ ID N0:3)中的至少一個;和
[0019] 人TK1的構(gòu)象依賴性表位。所述第二單克隆抗體對選自該組的不同的第二表位具 有特異性。
[0020] 所述實(shí)施方案的又一個方面涉及一種用于估計受試者中腫瘤復(fù)發(fā)的可能性的方 法。所述方法包括使用根據(jù)以上的方法或試劑盒來測定來自所述受試者的身體樣本中的血 清TK1物質(zhì)的水平。所述方法還包括將所述身體樣本中的所述血清TK1物質(zhì)的水平與代表健 康受試者群體的血清TK1物質(zhì)的水平或與先前在所述受試者中測得的血清TK1物質(zhì)的水平 相比較。
[0021] 所述實(shí)施方案的另一個方面涉及一種用于測定受試者中細(xì)胞增殖的方法。所述方 法包括使用根據(jù)以上的方法或試劑盒來測定來自所述受試者的身體樣本中的血清TK1物質(zhì) 的水平。所述方法還包括基于所述身體樣本中的所述血清TK1物質(zhì)的水平來測定所述細(xì)胞 增殖。
[0022] 所述實(shí)施方案的又一個方面涉及一種用于測定罹患惡性病的受試者中增殖過程 反應(yīng)的方法。所述方法包括使用根據(jù)以上的方法或試劑盒來測定來自所述受試者的身體樣 本中的血清TK1物質(zhì)的水平。所述方法還包括基于所述身體樣本中的所述血清TK1物質(zhì)的水 平來測定所述增殖過程反應(yīng)。
[0023] 所述實(shí)施方案的另一個方面涉及一種用于測定受試者中炎癥、感染或腫瘤細(xì)胞增 殖的水平的方法。所述方法包括使用根據(jù)以上的方法或試劑盒來測定來自所述受試者的身 體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平。所述方法還包括基于所述身體樣本中的所述血清TK1物質(zhì) 的水平來測定所述炎癥、感染或腫瘤細(xì)胞增殖的水平。
[0024] 所述實(shí)施方案的再一個方面涉及一種分離的肽，其由氨基酸序列GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2)、NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5)或NCPVPGKPGEAV(SEQ ID N0:3)組成。
[0025] 所述實(shí)施方案的又一個方面涉及一種產(chǎn)生能夠結(jié)合人TK1的血清形式的單克隆抗 體的方法。所述方法包括利用第一肽偶聯(lián)物或第二肽偶聯(lián)物使非人動物免疫，所述第一肽 偶聯(lián)物包含具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID NO: 1)且與第一 載體蛋白偶合的肽，所述第二肽偶聯(lián)物包含所述具有氨基酸序列 GQPAGroNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID N0:1)且與不同于所述第一載體蛋白的第二 載體蛋白偶合的肽。所述方法還包括從對所述第一肽偶聯(lián)物或所述第二肽偶聯(lián)物具有血液 效價的所述非人動物分離脾細(xì)胞。所述方法還包括通過使所述脾細(xì)胞與骨髓瘤融合來形成 雜交瘤。所述方法另外包括針對對所述第二肽偶聯(lián)物的效價來篩選來自由用所述第一肽偶 聯(lián)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的雜交瘤的上清液，且針對對所述第一肽偶聯(lián)物的效價來篩選來自由 用所述第二肽偶聯(lián)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的雜交瘤的上清液。所述方法還包括選擇產(chǎn)生能夠結(jié) 合所述第一肽偶聯(lián)物、所述第二肽偶聯(lián)物和人rTKl的單克隆抗體的雜交瘤。所述方法另外 包括從所述選定雜交瘤的上清液分離所述單克隆抗體。
[0026]所述實(shí)施方案的單克隆抗體和片段就能夠結(jié)合人TK1的血清形式來說具有優(yōu)良性 質(zhì)，并且因此可以用于牽涉測定樣本中人TK1的血清形式的水平的各種試劑盒和方法。 [0027] 附圖簡述
[0028]通過參考以下描述連同附圖，可以最充分地理解所述實(shí)施方案連同其其他目標(biāo)和 優(yōu)點(diǎn)，其中：
[0029]圖1說明利用得自抗XPA 210肽雜交瘤的上清液和重組TK1制劑以及得自健康和癌 癥患者的血清進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡測定的結(jié)果。脊髓發(fā)育不良綜合征(MDS)是涉及血細(xì)胞的骨 髓類別的無效產(chǎn)生的血液學(xué)醫(yī)學(xué)病狀的多樣性集合，并且也稱為白血病前期。在這種情況 下CA-125指示患者疑似罹患卵巢癌。
[0030]圖2說明基于序列相似性的四聚體復(fù)合物中TK1C末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)模型以及解脲脲 原體(1].1^^〇171:;[(311111)/微小脲原體(1]43￥代11111)(當(dāng)前命名）和人1'1(1的30結(jié)構(gòu)[19,20]。標(biāo) 記為A的區(qū)域表示氨基酸195-207。標(biāo)記為B的區(qū)域表示氨基酸208-216,這很可能包括彎曲 區(qū)域。標(biāo)記為C的區(qū)域，即，氨基酸215-222,含有接近于蛋白質(zhì)末端的預(yù)測C末端 〇螺旋。A、B 和C區(qū)域可能暴露于酶復(fù)合物的表面，且因此可以是適用于抗體產(chǎn)生的抗原位點(diǎn)。
[0031] 圖3是夾心ELISA測定的一個設(shè)計實(shí)施方案的示意性說明。
[0032] 圖4說明用TKLIA1SOW?鍘定(DiaSorin Inc.)所測定的得自10名健康血液供者 和28名經(jīng)診斷患有前列腺癌的患者的血清的TK活性值。
[0033] 圖5說明用基于XPA 210-Arl和XPA 210-Ar2抗體的夾心ELISA測定所測定的得自 10名健康血液供者和28名經(jīng)診斷患有前列腺癌的患者的血清的吸光度值。
[0034] 圖6A-6D說明產(chǎn)生XPA 210-Arl(圖6B)、XPA 210-Ar2(圖6C)和XPA 210-Ar3(圖6D) 的雜交瘤細(xì)胞的總RNA的瓊脂糖凝膠電泳。圖6A說明DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker III，其還存在于圖6B-6D的泳道Μ中，其中泳道R指示來自對應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞的總RNA。
[0035] 圖7A-7C說明產(chǎn)生XPA 210-Arl(圖7A)、XPA 210-Ar2(圖7Β)和XPA 210-Ar3(圖7C) 的雜交瘤細(xì)胞的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。泳道M，DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker III;泳道1，VH;和泳道 2,VL〇
[0036] 圖8A和8B說明重組人TK1與XPA 210-Arl(圖8A)和XPA 210-Ar2(圖8B)之間的相互 作用的Attana 2000測量的結(jié)果。使用1:1結(jié)合模型進(jìn)行曲線擬合，且所計算的常數(shù)是締合 速率(Ka)、解離速率(Kd)、親和力(KD)、質(zhì)量擴(kuò)散速率(k t)和最大信號(Bmax)。
[0037] 詳細(xì)描述
[0038] 本發(fā)明實(shí)施方案總體上涉及單克隆抗胸苷激酶1(抗TK1)抗體或抗體片段以及涉 及使用此類單克隆抗TK1抗體或抗體片段的方法和試劑盒。
[0039]所述實(shí)施方案的單克隆抗TK1抗體和片段非常適用作診斷和臨床工具，因?yàn)檫@些 單克隆抗TK1抗體和片段能夠結(jié)合人TK1的血清形式。
[0040]存在本領(lǐng)域中已知的諸多單克隆抗TK1抗體。盡管這些抗體能夠結(jié)合人重組TK1 (rTKl)和在不同程度上結(jié)合人TK1的細(xì)胞形式(有時表示為胞質(zhì)TK1)，但它們就能夠結(jié)合身 體樣本中的人TK1的血清形式(諸如在血清或血液樣本中）而言無效。
[0041 ]人TK1以多種形式存在，這取決于某些分子的存在，例如存在或不存在腺苷三磷酸 (ATP);取決于蛋白質(zhì)的濃度，即高濃度或低濃度;取決于蛋白質(zhì)的類型，即天然或重組TK1; 且取決于蛋白質(zhì)的部位，即在血清或細(xì)胞質(zhì)中。
[0042]總體來說，細(xì)胞質(zhì)TK1和重組人TK1在存在ATP的情況下或在高濃度下作為四聚體 存在，且在不存在ATP的情況下或在低濃度下作為二聚體存在。細(xì)胞質(zhì)TK1和重組人TK1的四 聚體形式具有高TK1活性，而二聚體形式具有較低TK1活性[26]。
[0043]形成鮮明對比的是，人血清TK1可以呈具有血清TK1活性的高分子量復(fù)合物形式， 諸如寡聚物或包含此類寡聚物，以及具有極低或甚至缺乏血清TK1活性的二聚體和四聚體 形式。
[0044] 可商購獲得的抗TK1抗體（3B3.E11，得自Abcam;M02,得自Abnova的克隆F12; EPR3194和EPR3193,得自Abnova的兔單克隆抗體)不能與血清TK1足夠充分地反應(yīng)。這些抗 TK1抗體是基于人重組TK1而產(chǎn)生。這與如本文中所提供的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一起表明，基于人重組 TK1的單克隆抗TK1抗體的產(chǎn)生一般無效，并且通常將不產(chǎn)生能夠以充分結(jié)合強(qiáng)度結(jié)合TK1 的血清形式的抗TK1抗體。
[0045]此外，針對TK1蛋白的相同部分所產(chǎn)生的單克隆抗TK1抗體將對如本文中所示的 TK1的血清形式具有極為不同的特異性和結(jié)合性質(zhì)。這意味著識別TK1蛋白的一部分中的第 一表位的一種單克隆抗TK1抗體可以結(jié)合人TK1的血清形式，而識別TK1蛋白的同一部分中 的不同的第二表位的另一種單克隆抗TK1抗體將不能很好地結(jié)合TK1的血清形式，即使兩種 單克隆抗TK1抗體是針對TK1蛋白的相同一般部分而產(chǎn)生。
[0046] 不同的單克隆抗TK1抗體的結(jié)合性質(zhì)的這種變化的一個推測性解釋是很可能僅單 克隆抗TK1抗體對人TK1中在能夠結(jié)合人TK1的血清形式方面有效的特定表位具有特異性。 本發(fā)明實(shí)施方案已經(jīng)鑒定了此類特定表位，從而使得能夠形成具有能夠結(jié)合人TK1的血清 形式的所需性質(zhì)的單克隆抗TK1抗體和抗體片段。
[0047] 本文中所描述的單克隆抗TK1抗體的獨(dú)特性質(zhì)因此很可能至少部分是由于其表位 結(jié)合性質(zhì)。
[0048] 因此，所述實(shí)施方案的一個方面涉及一種能夠結(jié)合人TK1的血清形式的單克隆抗 體或單克隆抗體片段。所述單克隆抗體或片段對選自由以下各項(xiàng)組成的組的表位具有特異 性：
[0049] ?人TK1 的GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2);
[0050] ?人 TK1 的 NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5)和 NCPVPGKPGEAV(SEQ ID N0:3)中的至少一個；和
[0051 ] ?人TK1的構(gòu)象依賴性表位。
[0052]如本文中所提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，就產(chǎn)生能夠結(jié)合人TK1的血清形式的單克隆抗 TK1抗體或片段而言，以上所提供的組中的表位是人TK1中的關(guān)鍵表位。
[0053] 表位GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2)對應(yīng)于人TK1中的氨基酸編號213至222。這個表位 在本文中一般表示為1 〇-mer或1 〇-mer肽。
[0054]以上所提供的組的第二個表位依次包含人TK1中從氨基酸編號205延伸至216的部 分中所存在的三個相關(guān)序列。這些相關(guān)序列是本文中一般表示為肽7的NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、本文中一般表示為肽8的PVPGKPGEAV(SEQIDN0:5)和本文中一般表示為12-mer或 12-mer肽的NCPVPGKPGEAV(SEQ ID N0:3)〇
[0055] 這些表位(SEQ ID如:2-5)存在于人11(1的(：末端區(qū)中。1'1(1的這個(：末端區(qū)參與1'1(1 的細(xì)胞周期調(diào)控，并且含有用于在有絲分裂期間引發(fā)TK1降解的識別序列。
[0056] 這些表位還是人T K 1的C末端部分中的較長序列 GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID NO: 1)的一部分。這個較長序列在本文中一般 表示為XPA 210,為31-mer或31-mer肽。
[0057]以上所提供的組中的第三個表位是人TK1的構(gòu)象依賴性表位。這意味著對構(gòu)象依 賴性表位具有特異性的單克隆抗TK1抗體或片段對人TK1的任何單個短（8卩，10至12個氨基 酸長)肽部分不顯示任何明顯的結(jié)合。成鮮明對比的是，單克隆抗TK1抗體或片段的結(jié)合在 這種情況下將具有構(gòu)象依賴性，其中表位或抗原結(jié)構(gòu)域由在人TK1的一級序列中彼此不相 鄰而是通過抗原結(jié)構(gòu)域的某一三維(3D)構(gòu)象形成的多個(即，至少兩個)區(qū)域組成。因此，在 人TK1的3D結(jié)構(gòu)中，這些多個區(qū)域?qū)⒈舜讼噜徎蚪咏卮嬖冢瑥亩餐瑯?gòu)成或形成構(gòu)象依賴 性表位。
[0058]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，構(gòu)象依賴性表位是人TK1的C末端部分中所存在的構(gòu)象 依賴性表位。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，構(gòu)象依賴性表位是人TK1中從氨基酸編號195延 伸至氨基酸編號225的C末端部分，即人TK1中對應(yīng)于XPA 210的部分中所存在的構(gòu)象依賴性 表位。
[0059]因此，人TK1的一級氨基酸序列折疊以形成3D蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會使C末端中且優(yōu)選地使 C末端中對應(yīng)于XPA 210的部分中的多個區(qū)域靠近在一起，從而形成構(gòu)象依賴性表位，即使 這些區(qū)域在人TK1的一級序列中彼此并不相鄰。
[0060] 在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述實(shí)施方案的單克隆抗體或片段不僅能夠結(jié)合人TK1 的血清形式，而且能夠結(jié)合人重組TK1 (rTKl)。
[0061] 在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述實(shí)施方案的單克隆抗體或片段不僅能夠結(jié)合人TK1 的血清形式，而且能夠結(jié)合人TK1的細(xì)胞形式，即細(xì)胞質(zhì)TK1。
[0062] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述實(shí)施方案的單克隆抗體或片段不僅能夠結(jié)合人 TK1的血清形式，而且能夠結(jié)合人rTKl和人TK1的細(xì)胞形式。
[0063] 因此，所述實(shí)施方案的單克隆抗體和片段具有很多種用途，因?yàn)樗鼈兡軌蚪Y(jié)合TK1 的不同形式，即，優(yōu)選地，人TK1的血清形式和細(xì)胞形式以及人rTKl。據(jù)信，單克隆抗體和片 段的這些結(jié)合性質(zhì)是由于單克隆抗體和片段對其具有特異性的選定表位的鑒定。與人TK1 的C末端部分結(jié)合的其他單克隆抗TK1抗體可能能夠結(jié)合人rTKl和/或人TK1的細(xì)胞形式，但 不能很好地結(jié)合人TK1的血清形式。這是本發(fā)明單克隆抗體和片段的獨(dú)特性質(zhì)。
[0064] 所述單克隆抗體或片段優(yōu)選地還能夠結(jié)合具有氨基酸序列 GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID N0:1)的肽，即XPA 210。
[0065] 所述實(shí)施方案的單克隆抗體或片段優(yōu)選地可通過包括以下步驟的方法獲得，諸如 通過所述方法獲得。
[0066] 利用第一肽偶聯(lián)物或第二肽偶聯(lián)物使非人動物免疫，所述第一肽偶聯(lián)物包含具有 氨基酸序列GQPAGroNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQIDNO:l)且與第一載體蛋白、優(yōu)選 地牛血清白蛋白（B SA)偶合的肽，所述第二肽偶聯(lián)物包含具有氨基酸序列GQPAGPDNK ENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID N0:1)且與不同于所述第一載體蛋白的第二載體蛋白、 優(yōu)選地匙孔戚血藍(lán)蛋白（KLH)偶合的肽。
[0067] 所述非人動物可以選自傳統(tǒng)上用于抗體產(chǎn)生的多種動物，包括但不限于小鼠、大 鼠、雞、山羊、綿羊、豚鼠、倉鼠、兔和馬。在一個具體實(shí)施方案中，所述非人動物是非人哺乳 動物。
[0068] 從對所述第一肽偶聯(lián)物或所述第二肽偶聯(lián)物具有血液效價(抗體效價）的所述非 人動物分離脾細(xì)胞。
[0069] 總體來說，利用所述第一肽偶聯(lián)物或所述第二偶聯(lián)物使多種非人動物免疫。在這 種情況下，鑒定對所述第一肽偶聯(lián)物或所述第二肽偶聯(lián)物顯示出高血液效價的那些非人動 物。隨后從這些所鑒定的非人動物分離脾細(xì)胞。
[0070] 顯示出血液效價的非人動物意味著所述非人動物的血液或血清包含能結(jié)合所述 第一肽偶聯(lián)物或所述第二肽偶聯(lián)物且更優(yōu)選地結(jié)合所述第一肽偶聯(lián)物和所述第二肽偶聯(lián) 物的肽GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID N0:1)的抗體。
[0071] 隨后根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)，通過使所分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤融合來形成 雜交瘤。
[0072] 針對對所述第二肽偶聯(lián)物的效價(抗體效價)來篩選來自由用所述第一肽偶聯(lián)物 進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的雜交瘤的上清液。相應(yīng)地，針對對所述第一肽偶聯(lián)物的效價(抗體效價） 來篩選來自由用所述第二肽偶聯(lián)物進(jìn)行所述免疫而產(chǎn)生的雜交瘤的上清液。
[0073]進(jìn)行這種篩選以避免針對對應(yīng)的免疫中所使用的諸如BSA或KLH之類的載體蛋白 產(chǎn)生的抗體。
[0074] 此后，選擇一或多種產(chǎn)生能夠結(jié)合所述第一肽偶聯(lián)物和所述第二肽偶聯(lián)物的單克 隆抗體的雜交瘤。在一個具體實(shí)施方案中，選擇至少一種產(chǎn)生能夠結(jié)合所述第一肽偶聯(lián)物、 所述第二肽偶聯(lián)物和人rTKl的單克隆抗體的雜交瘤。
[0075] 然后從選出雜交瘤的上清液分離所述實(shí)施方案的單克隆抗體。
[0076]在一個實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段所具有的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)具有來自 由以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸序列：
[0077] ·DYEMH(SEQIDN0:6)，或與SEQIDN0:6具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列 同一性的氨基酸序列；
[0078] ·AIHPGYGGTAYNQKFKG(SEQIDN0:7)，或與SEQIDN0:7具有至少90%且優(yōu)選地 至少95%序列同一性的氨基酸序列；
[0079] · FITKH)Y(SEQ ID N0:8)，或與SEQ ID N0:8具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序 列同一性的氨基酸序列；
[0080] ·KSSQSLLDSDGKTFLN(SEQIDN0:9)，或與SEQIDN0:9具有至少90%且優(yōu)選地至 少95%序列同一性的氨基酸序列；
[0081 ] ·LVSKLDS(SEQIDN0:10)，或與SEQIDN0:10具有至少90%且優(yōu)選地至少95% 序列同一性的氨基酸序列;和
[0082] · WQGTHFPWT(SEQ ID N0:11)，或與SEQ ID N0:11 具有至少90%且優(yōu)選地至少 95%序列同一性的氨基酸序列。
[0083] 在一個具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段所具有的CDR具有選自由以下各 項(xiàng)組成的組的氨基酸序列：SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
[0084] 在一個具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段具有:可變重鏈(VH)CDRl，其具有 氨基酸序列SEQ ID N0:6或與SEQ ID N0:6具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的 氨基酸序列;VH CDR2,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:7或與SEQ ID N0:7具有至少90%且優(yōu) 選地至少95%序列同一性的氨基酸序列；和VH⑶R3,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:8或與 SEQ ID NO:8具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序列。所述單克隆抗體 或片段優(yōu)選地還具有或替代地具有:可變輕鏈(VL)CDRl，其具有氨基酸序列SEQ ID N0:9或 與SEQ ID N0:9具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序列;VL CDR2,其具 有氨基酸序列SEQ ID N0:10或與SEQ ID N0:10具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一 性的氨基酸序列；和VLCDR3，其具有氨基酸序列SEQIDN0 :11或與SEQIDN0:11具有至少 90 %且優(yōu)選地至少95 %序列同一性的氨基酸序列。
[0085]在一個具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段具有:VH CDR1，其具有氨基酸序 列SEQ ID N0:6;VH CDR2,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:7;VH CDR3,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:8;VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID N0:9;VL CDR2,其具有氨基酸序列SEQ ID NO: 10;和VL CDR3,其具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11。
[0086] 根據(jù)這個具體實(shí)施方案的單克隆抗體在本文中表示為XPA 210-Arl。
[0087] 在另一個實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段所具有的CDR具有來自由以下各項(xiàng) 組成的組的氨基酸序列：
[0088] ·DYEMH(SEQIDN0:6)，或與SEQIDN0:6具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列 同一性的氨基酸序列；
[0089] ·AILPGSGGTAYNQKFKG(SEQIDN0:12)，或與SEQIDN0:12具有至少90%且優(yōu)選 地至少95 %序列同一性的氨基酸序列；
[0090] ·LITTroY(SEQIDN0:13)，或與SEQIDN0:13具有至少90%且優(yōu)選地至少95% 序列同一性的氨基酸序列；
[0091] ·KSSQSLLDSDGKTYLN(SEQIDN0:14)，或與SEQIDN0:14具有至少90%且優(yōu)選地 至少95%序列同一性的氨基酸序列；
[0092] ·LVSKLDS(SEQIDN0:10)，或與SEQIDN0:10具有至少90%且優(yōu)選地至少95% 序列同一性的氨基酸序列;和
[0093] · WQGTHFPWT(SEQ ID N0:11)，或與SEQ ID N0:11 具有至少90%且優(yōu)選地至少 95%序列同一性的氨基酸序列。
[0094]在一個具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段所具有的CDR具有選自由以下各 項(xiàng)組成的組的氨基酸序列：SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
[0095]在一個具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段具有:VH CDR1，其具有氨基酸序 列SEQ ID N0:6或與SEQ ID N0:6具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序 列;VH⑶R2,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:12或與SEQ ID N0:12具有至少90%且優(yōu)選地至 少95%序列同一性的氨基酸序列；和VHCDR3，其具有氨基酸序列SEQIDN0 :13或與SEQID N0:13具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序列。所述單克隆抗體或片段 優(yōu)選地還具有或替代地具有 :VLCDR1，其具有氨基酸序列SEQIDN0:14或與SEQIDN0:14 具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序列;VL CDR2,其具有氨基酸序列 SEQ ID N0:10或與SEQ ID N0:10具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序 列；和VL⑶R3,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:11或與SEQ ID N0:11具有至少90%且優(yōu)選地 至少95%序列同一性的氨基酸序列。
[0096]在一個具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段具有:VH CDR1，其具有氨基酸序 列SEQ ID N0:6;VH CDR2,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:12;VH CDR3,其具有氨基酸序列 SEQ ID N0:13;VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID N0:14;VL CDR2,其具有氨基酸序列SEQ IDN0:10;和VLCDR3，其具有氨基酸序列SEQIDN0:11。
[0097] 根據(jù)這個具體實(shí)施方案的單克隆抗體在本文中表示為XPA 210_Ar2。
[0098] 在另一個實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段所具有的CDR具有來自由以下各項(xiàng) 組成的組的氨基酸序列：
[0099] ·SGYSWH(SEQIDN0:15)，或與SEQIDN0:15具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序 列同一性的氨基酸序列；
[0100] ·YIHYSGSTTYNPSLKG(SEQIDN0:16)，或與SEQIDN0:16具有至少90%且優(yōu)選地 至少95%序列同一性的氨基酸序列；
[0101] · WGTGHWYFDV(SEQ ID N0:17)，或與SEQ ID N0:17具有至少90%且優(yōu)選地至少 95%序列同一性的氨基酸序列；
[0102] ·RSSTGAVTTTNYAN(SEQIDN0:18)，或與SEQIDN0:18具有至少90%且優(yōu)選地至 少95%序列同一性的氨基酸序列；
[0103] ·GTNNRVP(SEQIDN0:19)，或與SEQIDN0:19具有至少90%且優(yōu)選地至少95% 序列同一性的氨基酸序列;和
[0104] · ALWYSNHWV(SEQ ID N0:20)，或與SEQ ID N0:20具有至少90%且優(yōu)選地至少 95%序列同一性的氨基酸序列。
[0105] 在一個具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段所具有的CDR具有選自由以下各 項(xiàng)組成的組的氨基酸序列：SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、 SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
[0106] 在一個具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段具有:VH CDR1，其具有氨基酸序 列SEQ ID N0:15或與SEQ ID N0:15具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸 序列；VHCDR2，其具有氨基酸序列SEQIDN0 :16或與SEQIDN0:16具有至少90%且優(yōu)選地 至少95%序列同一性的氨基酸序列；和VH CDR3,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:17或與SEQ ID NO: 17具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序列。所述單克隆抗體或片 段優(yōu)選地還具有或替代地具有:VL⑶R1，其具有氨基酸序列SEQ ID N0:18或與SEQ ID N0: 18具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序列;VL⑶R2,其具有氨基酸序列 SEQ ID N0:19或與SEQ ID N0:19具有至少90%且優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序 列；和VL CDR3,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:20或與SEQ ID N0:20具有至少90%且優(yōu)選地 至少95%序列同一性的氨基酸序列。
[0107] 在一個具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或片段具有:VH CDR1，其具有氨基酸序 列SEQ ID N0:15;VH CDR2,其具有氨基酸序列SEQ ID N0:16;VH CDR3,其具有氨基酸序列 SEQ ID N0:17;VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID N0:18;VL CDR2,其具有氨基酸序列SEQ IDN0:19;和VLCDR3，其具有氨基酸序列SEQIDN0:20。
[0108] 根據(jù)這個具體實(shí)施方案的單克隆抗體在本文中表示為XPA 210_Ar3。
[0109] 所述實(shí)施方案的單克隆抗體的片段可以是能夠結(jié)合人TK1的血清形式的單克隆抗 體的任何片段，并且可以選自由以下各項(xiàng)組成的組:單鏈抗體、Fv片段、scFv片段、Fab片段、 F(ab'）2片段、Fab'片段、Fd片段、單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb)、SCFv-FC片段、雙scFv片段和CDR區(qū)。
[0110] 所述實(shí)施方案的單克隆抗體或片段優(yōu)選地為分離的單克隆抗體或片段，諸如從先 前所描述的雜交瘤的上清液中分離。
[0111] 所述單克隆抗體可以是能夠結(jié)合人TK1的血清形式的人源化單克隆抗體或嵌合單 克隆抗體。
[0112] 單克隆抗體的特異性可以基于親和力和/或親合力進(jìn)行測定。親和力由抗原與單 克隆抗體解離的平衡常數(shù)(Kd)表示，是抗原決定簇與所述單克隆抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)之 間的結(jié)合強(qiáng)度的量度。Kd值越小，所述抗原決定簇與所述單克隆抗體之間的結(jié)合強(qiáng)度越強(qiáng)。 替代地，親和力還可以表示為親和力常數(shù)(U，它是l/Kd。如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易知，親和 力可以用本來已知的方式來測定，這取決于感興趣的特定抗原。
[0113] 親合力是單克隆抗體與相關(guān)抗原之間的結(jié)合強(qiáng)度的量度。親合力跟抗原決定簇與 其在所述單克隆抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間的親和力和所述單克隆抗體上所存在的相關(guān) 結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目有關(guān)。
[0114] 典型地，單克隆抗體將以10-5至ΚΓ12摩爾/升(M)或更小且優(yōu)選地10-7至10- 12Μ或更 小且更優(yōu)選地10-8至10-12Μ的解離常數(shù)(Kd)，g卩，以105至10 12Μ-1或更大且優(yōu)選地107至101?^ 或更大且更優(yōu)選地1〇 8至1012μ4的締合常數(shù)(Ka)結(jié)合其抗原。
[0115] 總體來說，大于10-4Μ的任何Kd值(或低于104Μ<的任何1值)一般被視為指示非特 異性結(jié)合。
[0116] 優(yōu)選地，所述實(shí)施方案的單克隆抗體或片段將以小于500ηΜ，優(yōu)選地小于200ηΜ，更 優(yōu)選地小于ΙΟηΜ，諸如小于5ηΜ的親和力結(jié)合人ΤΚ1的血清形式和/或重組形式。如本文中所 提供的初步結(jié)合研究指示，就與重組人ΤΚ1的結(jié)合而言，所述實(shí)施方案的單克隆抗體具有對 應(yīng)于小于5ηΜ且在一些情況下甚至小于InM的KD值的親和力。
[0117] 單克隆抗體與抗原或抗原決定簇的特異性結(jié)合可以用本來已知的任何合適的方 式加以測定，包括例如斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或競爭性結(jié)合測定，諸如放 射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)和夾心競爭測定，以及本領(lǐng)域中本來已知的其不同的 變化形式。
[0118] 所述實(shí)施方案的另一個方面涉及一種用于測定身體樣本中的細(xì)胞和/或血清TK1 物質(zhì)水平的方法。所述方法包括使所述身體樣本與根據(jù)所述實(shí)施方案的單克隆抗體或片段 接觸。所述方法還包括檢測所結(jié)合的單克隆抗體或片段的量。
[0119] 用于檢測所結(jié)合的單克隆抗體或片段的量的任何現(xiàn)有技術(shù)都可以用于本發(fā)明方 法中。舉例來說，所述檢測可以是直接的或間接的，并且可以產(chǎn)生熒光或發(fā)色信號。直接檢 測典型地涉及使用與標(biāo)記偶聯(lián)的單克隆抗體或片段。間接檢測利用針對所述單克隆抗體或 片段的宿主物種產(chǎn)生的經(jīng)過標(biāo)記的二抗。
[0120] 用于觀察抗體與表位的結(jié)合的常用標(biāo)記包括熒光團(tuán)和能將可溶性底物轉(zhuǎn)化成發(fā) 色最終產(chǎn)物的酶。
[0121] 所述身體樣本優(yōu)選地選自由以下各項(xiàng)組成的組:細(xì)胞樣本、組織樣本、血液樣本、 血清樣本、腦脊髓液樣本、胸膜液樣本、滑膜液樣本和腹膜腔液樣本。在一個優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述身體樣本是體液樣本且優(yōu)選地選自由以下各項(xiàng)組成的組:血液樣本、血清樣本、 腦脊髓液樣本、胸膜液樣本、滑膜液樣本和腹膜腔液樣本。在一個具體實(shí)施方案中，所述身 體(體液)樣本是血液樣本或血清樣本。
[0122] 因此，所述實(shí)施方案的單克隆抗體和片段可以用于測定身體樣本中的細(xì)胞和/或 血清TK1物質(zhì)的水平，即，量。據(jù)信，所述實(shí)施方案的單克隆抗體和片段能夠結(jié)合細(xì)胞或血清 TK1的多種形式，諸如二聚體、四聚體和寡聚物，包括可能與其他蛋白質(zhì)、輔因子或分子結(jié)合 的形式，且從而使得能夠測定其水平。因此，細(xì)胞和/或血清TK1物質(zhì)從而包括細(xì)胞和/或血 清TK1的多種形式。
[0123] 在一個具體實(shí)施方案中，所述方法是用于測定身體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平 的方法。
[0124] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法是用于測定身體樣本中的細(xì)胞TK1物質(zhì)的水平的 方法。
[0125] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法是用于測定身體樣本中的細(xì)胞TK1物質(zhì)和血清TK1 物質(zhì)的水平的方法。
[0126] 所述實(shí)施方案的另一個方面涉及一種用于測定身體樣本中的細(xì)胞和/或血清TK1 物質(zhì)的水平的試劑盒。所述試劑盒包括已固定至固體載體或欲固定至所述固體載體的根據(jù) 諸多實(shí)施方案的第一單克隆抗體。所述試劑盒還包括根據(jù)所述實(shí)施方案的第二單克隆抗 體。
[0127] 所述試劑盒的第一單克隆抗體對選自由以下各項(xiàng)組成的組的第一表位具有特異 性：人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2);人TK1的NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV (SEQ ID N0:5)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID N0:3)中的至少一個;和人TK1的構(gòu)象依賴性表位。 所述試劑盒的第二單克隆抗體對選自所述組的不同的第二表位具有特異性。
[0128] 因此，所述試劑盒的兩種單克隆抗體都能夠結(jié)合人TK1的血清形式且優(yōu)選地還結(jié) 合人TK1的細(xì)胞形式。然而，所述試劑盒的兩種單克隆抗體對選自以上所提供的組的不同的 表位具有特異性。
[0129]在一個實(shí)施方案，所述第一單克隆抗體對所述第一表位具有特異性，所述第一表 位選自人TK1的GEAVAARKLF( SEQ ID N0: 2)和人TK1的構(gòu)象依賴性表位中的一個，且所述第 二單克隆抗體對所述第二表位具有特異性，所述第二表位選自人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID NO: 2)和人TK1的所述構(gòu)象依賴性表位中的另一個。
[0130]在另一個實(shí)施方案中，所述第一單克隆抗體對所述第一表位具有特異性，所述第 一表位選自人TK1 的GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2)以及人TK1 的NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、 PVPGKPGEAV(SEQIDN0:5)和NCPVPGKPGEAV(SEQIDN0:3)中至少一個中的一個，且所述第 二單克隆抗體對所述第二表位具有特異性，所述第二表位選自人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2)以及人TK1 的NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5)和NCPVPGKPGEAV (SEQ ID N0:3)中至少一個中的另一個。
[0131] 在另一個實(shí)施方案中，所述第一單克隆抗體對所述第一表位具有特異性，所述第 一表位選自人 TK1 的 NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5)和 NCPVPGKPGEAV(SEQ ID N0:3)中至少一個以及人TK1的構(gòu)象依賴性表位中的一個，且所述第 二單克隆抗體對第二表位具有特異性，所述第二表位選自人TK1的NCPVPGKPGE(SEQ ID N0: 4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID 勵：3)中至少一個以及人11(1的構(gòu) 象依賴性表位中的另一個。
[0132] 在第一具體實(shí)施方案中，所述第一單克隆抗體是XPA 210-Arl且所述第二單克隆 抗體是XPA 210-Ar2。在第二具體實(shí)施方案中，所述第一單克隆抗體是XPA 210-Ar2且所述 第二單克隆抗體是XPA 210-Arl。在第三具體實(shí)施方案中，所述第一單克隆抗體是XPA 210-Arl且所述第二單克隆抗體是XPA 210-Ar3。在第四具體實(shí)施方案中，所述第一單克隆抗體 是XPA 210-Ar3且所述第二單克隆抗體是XPA 210-Arl。在第五具體實(shí)施方案中，所述第一 單克隆抗體是XPA 210-Ar2且所述第二單克隆抗體是XPA 210-Ar3。在第六具體實(shí)施方案 中，所述第一單克隆抗體是XPA 210-Ar3且所述第二單克隆抗體是XPA 210-Ar2。
[0133] 在一個具體實(shí)施方案中，所述試劑盒是夾心測定試劑盒。這意味著所述試劑盒使 用結(jié)合細(xì)胞和/或血清TK1物質(zhì)的不同的表位的單克隆抗體，使得第一單克隆抗體和第二單 克隆抗體二者可以同時結(jié)合相同細(xì)胞和/或血清TK1復(fù)合物或分子。
[0134] 在一個具體實(shí)施方案中，所述試劑盒是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒且優(yōu)選 地是夾心ELISA。
[0135] 夾心ELISA可以用于通過對第一單克隆抗體作為所謂的俘獲抗體所結(jié)合的固體載 體表面進(jìn)行制備來檢測身體樣本中的細(xì)胞和/或血清TK1物質(zhì)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中， 已知量的第一單克隆抗體與固體載體表面結(jié)合。所述表面上的任何非特異性結(jié)合位點(diǎn)任選 地但優(yōu)選地被阻斷。然后將所述身體樣本施加至所述表面，使得其中所存在的任何細(xì)胞和/ 或血清TK1物質(zhì)將被已固定的第一單克隆抗體俘獲。通過一個或多個洗滌步驟優(yōu)選地移除 未結(jié)合的物質(zhì)。然后加入所述第二單克隆抗體并且允許結(jié)合被所述第一單克隆抗體所俘獲 的任何細(xì)胞和/或血清TK1物質(zhì)。
[0136] 然后在直接或間接檢測方法中測定所結(jié)合的第二單克隆抗體的量。舉例來說，標(biāo) 記或酶可以直接地或經(jīng)由諸如生物素-鏈霉親和素或生物素-親和素連結(jié)之類的連結(jié)間接 地連接至所述第二單克隆抗體。替代地，有可能使用經(jīng)過標(biāo)記或與酶連接且特異性結(jié)合所 述第二單克隆抗體的二抗。
[0137] 因此，在一個實(shí)施方案中，所述第二單克隆抗體具有共價連接的生物素。替代地， 所述第二單克隆抗體具有共價連接的鏈霉親和素或親和素。
[0138] 所述試劑盒優(yōu)選地還包括辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素或HRP標(biāo)記的 親和素。替代地，所述試劑盒還包括HRP標(biāo)記的生物素。所述試劑盒還包括HRP底物，諸如3， 3 '，5，5 '-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物、3，3 ' -二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物或2，2 ' -聯(lián)氮-雙(3-乙基 苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)底物。在此類情況下，可以通過檢測發(fā)色底物被HRP轉(zhuǎn)化為可檢 測的有色產(chǎn)物的分光光度法來測定身體樣本中的細(xì)胞和/或血清TK1物質(zhì)的水平。
[0139] 在一個實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括微量滴定板(MCP)作為固定或欲固定所述 第一單克隆抗體的固體載體。圖3是根據(jù)一個實(shí)施方案使用第一單克隆抗體和第二單克隆 抗體的夾心ELISA的原理的示意性概述。
[0140] 所述試劑盒不一定必須是ELISA試劑盒。在另一個實(shí)施方案中，所述試劑盒使用親 和色譜法，其中所述第一單克隆抗體與固定相，諸如與柱中的凝膠基質(zhì)或珠粒結(jié)合。舉例來 說，所述凝膠基質(zhì)或珠?？梢杂芍T如SEPHAROSE?之類的瓊脂糖制成。
[0141] 在此類情況下，身體樣本中所存在的細(xì)胞和/或血清TK1物質(zhì)將通過與所固定的第 一單克隆抗體結(jié)合而被截留在所述柱中。在洗滌之后，結(jié)合的細(xì)胞和/或血清TK1物質(zhì)可以 避開并且使用所述第二單克隆抗體進(jìn)行檢測。舉例來說，可以使用蛋白質(zhì)印跡法且利用用 于TK1檢測的第二單克隆抗體使用直接或間接檢測方法來測定避開的細(xì)胞和/或血清TK1物 質(zhì)的量。
[0142] 所述固體載體可以替代地為磁性珠粒，諸如DYNABEADS?。
[0143] 本發(fā)明實(shí)施方案的試劑盒可以用于先前描述的方法中來測定身體樣本中的細(xì)胞 和/或血清TK1物質(zhì)水平。
[0144] 所述實(shí)施方案的另一個方面涉及一種用于估計受試者中腫瘤復(fù)發(fā)的可能性的方 法。所述方法包括使用根據(jù)所述實(shí)施方案的方法或試劑盒來測定來自所述受試者的身體樣 本中的血清TK1物質(zhì)的水平。然后將所述身體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平與代表健康受試 者群體的血清TK1物質(zhì)的水平或與先前在所述受試者中測得的血清TK1物質(zhì)的水平相比較。
[0145] 所測得的水平高于與健康人群相關(guān)的水平表明所述受試者中的腫瘤復(fù)發(fā)可能性 增加。類似地，所測得的水平高于與進(jìn)行先前治療后的受試者相關(guān)的水平表明所述受試者 中的腫瘤復(fù)發(fā)可能性增加。關(guān)于基于所測得的TK1物質(zhì)的水平來估計腫瘤復(fù)發(fā)可能性的更 多信息，請參考[24,25]。
[0146] 所述實(shí)施方案的又一個方面涉及一種用于測定受試者中細(xì)胞增殖的方法。所述方 法包括使用根據(jù)所述實(shí)施方案的方法或試劑盒來測定來自所述受試者的身體樣本中的血 清TK1物質(zhì)的水平。所述方法還包括基于所述身體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平來測定細(xì)胞 增殖。
[0147] 在一個具體實(shí)施方案中，測定正?；蚰[瘤細(xì)胞增殖的水平且與所測得的血清TK1 物質(zhì)的水平相比較，以確定受試者是具有正?；蚧€細(xì)胞增殖還是升高的細(xì)胞增殖。
[0148] 本發(fā)明方法可以作為一種監(jiān)測應(yīng)用于受試者的多種療法的工具。舉例來說，所述 方法可以用于監(jiān)測所述受試者中的抗增殖或抗腫瘤療法。在此類情況下，所述方法可以用 于驗(yàn)證所選抗增殖或抗腫瘤療法在所述受試者中在減少細(xì)胞增殖方面是否具有所期望的 效果。如果所述療法不具有所期望的效果，即，沒有檢測到細(xì)胞增殖顯著下降，則另一種或 改進(jìn)的抗增殖或抗腫瘤療法可以代替應(yīng)用于所述受試者。
[0149] 所述實(shí)施方案的另一個方面涉及一種用于測定罹患惡性病的受試者中的增殖過 程反應(yīng)的方法。所述方法包括使用根據(jù)所述實(shí)施方案的方法或試劑盒來測定來自所述受試 者的身體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平。所述方法還包括基于所述身體樣本中的所述血清 TK1物質(zhì)的水平來測定所述增殖過程反應(yīng)。此類增殖過程反應(yīng)的一個實(shí)例可以是免疫反應(yīng) 或?qū)γ庖叻磻?yīng)的反應(yīng)。在一個實(shí)施方案中，增殖過程反應(yīng)的至少一種其他生物標(biāo)記物也可 以用于所述測定中。
[0150] 所述實(shí)施方案的又一個方面涉及一種用于測定受試者中的炎癥、感染或腫瘤細(xì)胞 增殖的水平的方法。所述方法包括使用根據(jù)所述實(shí)施方案的方法或試劑盒來測定來自所述 受試者的身體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平。所述方法還包括基于所述身體樣本中的所述 血清TK1物質(zhì)的水平來測定所述炎癥、感染或腫瘤細(xì)胞增殖的水平。在一個實(shí)施方案中，炎 癥、感染或腫瘤細(xì)胞增殖的至少一種其他生物標(biāo)記物也可以用于所述測定中。
[0151] 具體來說，可以根據(jù)本發(fā)明的方法來測定和監(jiān)測諸如乳房腫瘤、肺腫瘤和膀胱腫 瘤之類的腫瘤細(xì)胞的增殖。
[0152] 在使用根據(jù)所述實(shí)施方案的單克隆抗體的方法和試劑盒的上述實(shí)施方案中，所述 受試者優(yōu)選地為人受試者，且所述身體樣本優(yōu)選地選自先前所描述的合適身體樣本的組。
[0153] 所述實(shí)施方案的其他方面涉及一種分離的肽，其由氨基酸GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2)、NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5)或NCPVPGKPGEAV(SEQ ID N0:3)組成。此類分離的肽非常適合作為抗體結(jié)合的表位。所述分離的肽可用于制備能夠結(jié) 合人TK1的血清形式且優(yōu)選地還能夠結(jié)合人重組TK1和人TK1的細(xì)胞形式的單克隆抗TK1抗 體或片段。
[0154] 所述實(shí)施方案的又一個方面涉及一種產(chǎn)生能夠結(jié)合人TK1的血清形式的單克隆抗 體的方法。所述方法包括利用第一肽偶聯(lián)物或第二肽偶聯(lián)物使非人動物免疫，所述第一肽 偶聯(lián)物包含具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID NO: 1)且與第一 載體蛋白偶合的肽，所述第二肽偶聯(lián)物包含所述具有氨基酸序列 GQPAGroNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID N0:1)且與不同于所述第一載體蛋白的第二 載體蛋白偶合的肽。所述方法還包括從對所述第一肽偶聯(lián)物或所述第二肽偶聯(lián)物具有血液 效價的所述非人動物分離脾細(xì)胞。所述方法進(jìn)一步包括通過使所述脾細(xì)胞與骨髓瘤融合來 形成雜交瘤。所述方法另外包括針對對所述第二肽偶聯(lián)物的效價來篩選來自由用所述第一 肽偶聯(lián)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的雜交瘤的上清液，且針對對所述第一肽偶聯(lián)物的效價來篩選來 自由用所述第二肽偶聯(lián)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的雜交瘤的上清液。所述方法進(jìn)一步包括選擇產(chǎn) 生能夠結(jié)合所述第一肽偶聯(lián)物、所述第二肽偶聯(lián)物和人rTKl的單克隆抗體的雜交瘤。所述 方法另外包括從所述選定雜交瘤的上清液分離所述單克隆抗體。
[0155] 在一個實(shí)施方案中，選擇所述雜交瘤包括選擇產(chǎn)生能夠結(jié)合所述第一肽偶聯(lián)物、 所述第二肽偶聯(lián)物、人rTKl和獲自罹患癌癥的人受試者的血清樣本中所存在的TK1的單克 隆抗體的雜交瘤。
[0156] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括選擇能夠結(jié)合獲自罹患癌癥的人受試者的血清 樣本中所存在的TK1的分離的單克隆抗體。
[0157]因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法涉及進(jìn)行選擇以便獲得能夠結(jié)合TK1的血 清形式的單克隆抗體。這種選擇可以通過選擇雜交瘤或通過在分離的單克隆抗體間進(jìn)行選 擇來進(jìn)行。 實(shí)施例
[0158]本發(fā)明實(shí)施例指示三種獨(dú)特的單克隆抗TK1抗體的設(shè)計和多步驟分離。所述單克 隆抗TK1抗體能夠識別重組TK、細(xì)胞TK1和血清TK1。此外，公開了用于獲得所述獨(dú)特單克隆 抗TK1抗體的免疫、選擇和最終篩選程序，包括其在TK1氨基酸序列中的表位結(jié)合區(qū)。還描述 了利用來自健康血液供者和來自不同類型癌癥疾病患者的樣本的基于這些單克隆抗TK1抗 體中的兩種的夾心ELISA的設(shè)計和性能。
[0159] 實(shí)施例1:制備針對人TK1的C末端區(qū)域的小鼠單克隆抗體
[0160] 利用來源于人TK1蛋白序列[19]的以下序列GQPAGPDNKENCP VPGKPGEAVAARKLFAPQ (SEQ ID NO: 1)對針對人TK1的C末端區(qū)域的小鼠單克隆抗體進(jìn)行免疫和選擇在兩種場合下 進(jìn)行。
[0162] 以上所提供的序列顯示人TK1的C末端區(qū)域(SEQ ID N0: 21)與跟小鼠 （SEQ ID N0: 22)、大鼠 （SEQ ID N0:23)、雞（SEQ ID N0:24)和狗（SEQ ID N0:25)中的相應(yīng) TK1 序列一起 用于免疫的序列的比較。
[0163] 在第一種方法中，使用相等量的肽與載體蛋白，利用通過以標(biāo)準(zhǔn)方法與戊二醛 (2.3%)交聯(lián)而與牛血清白蛋白05六)偶合的肽使雌性8 &1匕/(：小鼠免疫。利用2〇(^8偶聯(lián)物 (在弗氏完全佐劑中）使小鼠初步免疫，且在三次加強(qiáng)免疫（i〇〇yg每次，在弗氏不完全佐劑 中）之后，從對所述抗原具有高血液效價的小鼠分離脾細(xì)胞且與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0融 合。對所產(chǎn)生的雜交瘤進(jìn)行多組亞克隆，并且使用ELISA堿性磷酸鹽檢測系統(tǒng)（Vector Laboratories，CA，USA)以涂有肽抗原(0.05yg/孔，SEQ ID NO: 1)的96孔板篩選來自細(xì)胞的 上清液。對來自陽性孔的具有最高效價的上清液進(jìn)行進(jìn)一步亞克隆，總計三至五次，并且測 試上清液。最后，鑒定了對31-mer肽和人重組TK1具有高效價的七種候選單克隆雜交瘤克 隆。建立細(xì)胞儲備，擴(kuò)增培養(yǎng)物且制備一大批上清液，將其凍干且在斑點(diǎn)印跡測定和ELISA 測定中進(jìn)行測試。這個程序分離在本文中表示為XPA 210-Arl的單克隆抗體。
[0164] 在用于獲得針對C末端肽的單克隆抗體的第二種方法中，使用三種不同的抗原：i) 如以上所描述與BSA偶合的XPA 210肽(SEQ ID NO: l);ii)用類似的交聯(lián)方法與匙孔戚血藍(lán) 蛋白（KLH)偶合的XPA 210肽；和iii)人rTKUrTKl的產(chǎn)生和結(jié)構(gòu)性質(zhì)描述于[20]中。利用 l〇〇yg肽偶聯(lián)物或rTKl (在弗氏完全佐劑中）使小鼠初步免疫，且在三次加強(qiáng)免疫（100yg每 次，在弗氏不完全佐劑中）之后，從對所述抗原具有高血液效價的小鼠分離脾細(xì)胞并且與小 鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0融合。使用基本上如以上所描述的系統(tǒng)，用lyg/孔肽抗原篩選所產(chǎn)生 的雜交瘤上清液。用肽KHL偶聯(lián)物篩選諸多孔中由用肽BSA偶聯(lián)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的雜交瘤 上清液，且對于肽KHL免疫則反過來。設(shè)計這種篩選以避免針對相應(yīng)的免疫中所使用的載體 蛋白產(chǎn)生的抗體。將來自陽性孔的具有最高效價的上清液亞克隆五次。僅選擇對肽偶聯(lián)物 和人rTKl都呈陽性的雜交瘤。在僅進(jìn)行重組TK1免疫的情況下，使用TK1蛋白進(jìn)行選擇。在各 情況下，鑒定了對肽偶聯(lián)物和rTKl具有高效價的十種候選單克隆雜交瘤克隆。建立細(xì)胞儲 備，擴(kuò)增培養(yǎng)物且制備一大批上清液，將其凍干且如以下所描述在若干種測定中進(jìn)行測試。
[0165] 為了鑒定將會適用于夾心ELISA程序的一對單克隆抗體，使用如以下實(shí)施例中所 描述的若干種二次篩選方法。
[0166] 實(shí)施例2:斑點(diǎn)印跡增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)免疫檢測
[0167] 基本上如[21]中所描述來進(jìn)行這個程序。總之，將3至5μ1肽(每個斑點(diǎn)3_300pg)、 人rTKl (每個斑點(diǎn)0.02-0.2ng)或血清樣本直接施加至硝化纖維膜上。在Tris緩沖生理鹽水 (TBS)中用10%脫脂牛奶將所述膜阻斷4小時且在加入所述上清液或其他一級抗TK1抗體之 后，在室溫(RT，23°C至25°C)下孵育過夜。在室溫下與生物素化的二級抗小鼠 IgG抗體一起 孵育1小時之后，在含親和素-HRP-鏈霉親和素的TBS緩沖液中孵育所述膜，隨后加入ECL底 物(GE Healthcare)。在暴露2_4min的薄膜(GE Healthcare)上檢測所述膜上的單個斑點(diǎn)的 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。還將來自健康對照和患有不同腫瘤疾病的患者的若干份血清樣本施加至所 述膜。
[0168] 僅明顯與肽抗原、rTK 1、來自具有已知高血清TK1水平的腫瘤患者的血清且以最低 限度與來自健康人士的血清反應(yīng)的雜交瘤是用于進(jìn)一步ELISA開發(fā)的排名靠前的候選物。 對于抗體XPA 210-Ar2和XPA 210-Ar3,這些結(jié)果的一個實(shí)例示于圖1中。
[0169] 實(shí)施例3:免疫親和力磁性珠粒測定
[0170] 所述測定分兩個步驟進(jìn)行。首先，使基于斑點(diǎn)印跡測定結(jié)果(實(shí)施例2)而選擇的抗 XPA 210抗體與人rTKl或來自罹患血液學(xué)惡性病的具有高血清TK1水平的患者的血清樣本 反應(yīng)。在第二個步驟中，加入含有磁性珠粒的抗小鼠 IgG抗體以便與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合， 隨后可以在所述混合物經(jīng)歷磁場時將其從反應(yīng)溶液中去除。通過酶活性測定來檢測未結(jié)合 的TK1蛋白。
[0171] 將不同濃度的人^1(1(10即，5即)和3(^1來自血液學(xué)癌癥患者的血清用27(^1丁85 Tween-20(TBST)+2%BSA稀釋，且與4yg純化的單克隆抗TK1抗體(溶解于磷酸鹽緩沖生理鹽 水(PBS)+0.1%BSA+2mM乙二胺四乙酸(EDTA)中，pH 7.4)或50μ1來自選定雜交瘤的對應(yīng)的 上清液合并。然后在4°C下將這些樣本輕緩地攪拌2小時，隨后加入70μ1含預(yù)洗過的綿羊抗 小鼠磁性(Dyna)珠粒的洗滌緩沖液(PBS+0. l%BSA+2mM EDTA，pH 7.4)，并且再孵育1小時。 然后將樣本管在磁鐵上放置2min，并且去除20μ1未結(jié)合的物質(zhì)且測量TK1活性。用如[22]中 所描述的改進(jìn) 3H_Thd測定來測定ΤΚ1活性。將未結(jié)合級分中的活性與用未跟任何雜交瘤上 清液反應(yīng)過的珠粒處理過的對照樣本的活性相比較。利用來自九種選定雜交瘤的上清液所 獲得的結(jié)果示于表1中。
[0172] 選定抗體中大部分與人rTKl反應(yīng)，且正如預(yù)期結(jié)合TK1活性的主要部分，但在與患 者樣本中的血清TK1相互作用的情況下，有較大范圍的TK1活性仍未結(jié)合(97%至31 %)。基 于后者的結(jié)果選出五種候選雜交瘤，擴(kuò)增且分離較大量的IgG并加以純化。然后在以下實(shí)施 例中所描述的測定中測試這些候選抗體。
[0173]表1 -未與抗體-珠粒結(jié)合的TK1活性
[0175] 實(shí)施例4:利用單克隆抗ΤΚ1抗體候選物的表位作圖分析
[0176] 為了確定選定單克隆抗體所結(jié)合的氨基酸區(qū)域，進(jìn)行了利用生物素化的10個氨基 酸的靶肽的Pepscan分析。所述程序是基于合成一組14種ΙΟ-mer氨基酸的肽，所述肽代表了 如結(jié)合實(shí)施例1所示出的TK1序列中從193至226的區(qū)域。各肽具有八個氨基酸重疊和兩個氨 基酸間隙，從而產(chǎn)生一組14種不同的肽，參見表2。還包括完整全長肽，且將所有這些肽固定 在鏈霉親和素涂布過的微量滴定板上。在1小時吸收步驟之后，用TOS、1 %BSA和0.1 %Tween 20洗滌所述板。然后以大約5μg/ml加入不同的抗體，并且將所述板孵育1小時，隨后洗滌三 次。然后加入HRP偶聯(lián)物并且孵育1小時。然后用相同緩沖液將所述板洗滌六次。最后，用100 μL 3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物測定吸光度，且利用一系列抗體的一個測試的結(jié)果 示于表2中。
[0177] 表2-含有抗體的孔在415nm下的吸光度值

[0181] 表2中的結(jié)果允許鑒定結(jié)合不同的抗體所需的最小氨基酸序列。似乎很明顯，當(dāng)使 用31-mer肽(XPA 210)作為抗原時，通過以上程序選出三種主要類型的產(chǎn)生抗體的雜交瘤。
[0182] 一種類型示例為XPA 210-Arl、Sup-584和Sup-583，其結(jié)合如下區(qū)域:GEAVAARKLF (SEQ ID N0:2)，且這些氨基酸將因此被包括在抗原結(jié)構(gòu)域中。
[0183] 另一個結(jié)構(gòu)域示例為Sup-165(XPA 210-Ar3)和Sup-168,其結(jié)合肽7(NCPVPGKPGE (SEQ ID N0:4))和肽8(PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5))，涵蓋氨基酸NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3)作為最可能的抗原結(jié)構(gòu)域。這些抗體顯然優(yōu)選10個氨基酸的肽，因?yàn)榕c31-mer XPA 210的反應(yīng)性低于第一種類型。
[0184] 最后，有一組示例為Sup-553、Sup-1119和Sup-162(XPA 210-Ar2)，其未顯示與十 四種ΙΟ-mer肽中的任一種的任何獨(dú)特結(jié)合。這個結(jié)果強(qiáng)烈表明，其結(jié)合具有構(gòu)象依賴性，由 一級序列中不相鄰而是由抗原結(jié)構(gòu)域的某一 3D構(gòu)象形成的若干個區(qū)域組成。
[0185] 此外，這一組以及其他兩組中的抗體都與全長31-mer肽(XPA 210)以及與人rTKl 反應(yīng)。
[0186] 因此，所述數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，單克隆抗體XPA 210-Arl識別所述31-mer(XPA 210)的C 末端部分中的結(jié)構(gòu)域。二級序列預(yù)測表明，這個區(qū)域形成α螺旋。令人遺憾的是，沒有關(guān)于 ΤΚ1四聚體的這個區(qū)域的直接結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，但基于細(xì)菌解脲脲原體/微小脲原體ΤΚ1結(jié)構(gòu)[20] 與人rTKl結(jié)構(gòu)之間的序列和結(jié)構(gòu)同源性的模型表明C末端結(jié)構(gòu)如圖2中所示。整個ΧΡΑ 210 區(qū)域很可能是在C末端具有α螺旋(在圖2中標(biāo)記為C)的翻轉(zhuǎn)區(qū)域(在圖2中標(biāo)記為B)。表位作 圖結(jié)果的一種可能的解釋是XPA 210-Arl樣表位與C末端α螺旋有關(guān)，XPA 210-Ar3表位與彎 曲結(jié)構(gòu)域有關(guān)，非常接近于充當(dāng)泛素化信號序列用于TK1的細(xì)胞周期降解的KEN序列[15]。 最后，XPA 210-Ar2表位具有構(gòu)象依賴性且可由31-mer區(qū)域的整個3D結(jié)構(gòu)的不同區(qū)域形成。 因此，有可能的是，具有不同結(jié)合性質(zhì)的單克隆抗體可能形成合適的夾心免疫測定對。
[0187] 實(shí)施例5:夾心ELISA測定
[0188] 夾心ELISA測定的概述示于圖3中，其中第一單克隆抗TK1抗體與微量滴定板(MTP) 的孔結(jié)合，從而充當(dāng)與樣本相互作用的"捕捉器(catcher)"。第二單克隆抗TK1抗體在第二 步驟中加入，且結(jié)合存在于所述樣本中并且與固定在所述孔中的所述第一單克隆抗TK1抗 體結(jié)合的TK1。通過生物素化對所述第二單克隆抗TK1抗體進(jìn)行修飾，這意味著其可以非常 有效地與報告復(fù)合物相互作用，就HRP標(biāo)記的鏈霉親和素而言，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，這可以容易 地測量。以下提供夾心ELISA測定中的標(biāo)準(zhǔn)程序的概述：
[0189] 1.將相等體積(70μ1)的樣本和樣本稀釋緩沖液吸取在小瓶中并且渦旋；
[0190] 2 ·在23 Γ-25 Γ下孵育30分鐘；
[0191] 3.加入100μΙ/孔的樣本與樣本稀釋緩沖液的混合物；
[0192] 4.在25°C下在以650rpm振蕩下孵育2小時；
[0193] 5.用350μ1 PBS Tween-20(PBST)洗滌四次；
[0194] 6.加入100μΙ/孔的含生物素標(biāo)記的抗TK1抗體的試劑緩沖液；
[0195] 7.在25°C下在以650rpm振蕩下孵育1小時；
[0196] 8.用350μ1 PBST洗滌四次；
[0197] 9.加入100μΙ/孔的鏈霉親和素聚HRP;
[0198] 10.在25°C下在以650rpm振蕩下孵育30分鐘；
[0199] 11.用350μ1 PBST洗滌四次；
[0200] 12.加入 100μΙ/孔的 ΤΜΒ 底物；
[0201] 13.孵育15分鐘；
[0202] 14 ·加入100μΙ/孔的終止溶液;和
[0203] 15.在450nm下讀取吸光度。
[0204] 在初步測試設(shè)置中，將單克隆抗體XPA 210-Arl選作"捕捉器"，其中在雞中產(chǎn)生的 多克隆抗XPA 210抗體作為檢測器[13,23]。使用這種設(shè)置來驗(yàn)證夾心ELISA可以如圖3中所 示進(jìn)行設(shè)計。此后，將多克隆抗XPA 210抗體置換為如本文中所公開而選出的第二單克隆抗 TK1抗體。
[0205] 在用于選擇第二單克隆抗體的第一測定中，使來自實(shí)施例4的純化的新候選抗體 吸附至MTP孔作為捕捉器且使用XPA 210-Arl抗體作為檢測器。結(jié)果顯示，僅有兩種候選抗 體上清液與來自癌癥患者的血清得到陽性結(jié)果：Sup-162(XPA 210-Ar2)和Sup-165(XPA 210-Ar3)，而所有五種候選抗體都與31 -mer肽(ΧΡΑ 210)偶聯(lián)物以及與人rTK1反應(yīng)。在ΧΡΑ 210-Ar2的情況下觀察到最高反應(yīng)性，且大量制備這種抗體，進(jìn)行生物素化且用作檢測抗 體。在XPA 21OELISA中將XPA 210-Ar 1用作捕捉抗體（圖3)。利用這種測定和多種臨床樣本 的最終結(jié)果示于實(shí)施例6中。
[0206]實(shí)施例6:夾心ELISA測定的靈敏度和特異性。
[0207] 本文中提供了用如實(shí)施例5中所描述利用XPA 210-Arl和XPA-Ar2單克隆抗體進(jìn)行 的原型ELISA所獲得的結(jié)果。所測試的樣本是來自不同疾病階段的前列腺癌患者的28份血 清(購自Biotheme Inc)。作為參考方法，使用TKUAISON?活性測定且結(jié)果提供于圖4中。 在圖5中，示出了利用ELISA測定的結(jié)果，而且在這種情況下提供了直接吸光度值。
[0208]通過用TKLIAISON?測定和ELISA測定來測量來自10名健康血液供者的血清中 的TK1活性和蛋白質(zhì)水平來估計兩種測定的截止值。TKLIAISON?測定在90%特異性下的 靈敏度計算為0.29。這意味著在允許十分之一假陽性(基于來自血液供者的值）的截止值 下，TKLIAISON?測定可以鑒定出29 %的真陽性（基于來自癌癥患者的血清的值）。在 ELISA測定的情況下，靈敏度是0.75。因此，ELISA測定鑒定出實(shí)體腫瘤疾病患者的能力與測 量酶活性的TK1活性測定相比顯著較強(qiáng)。
[0209]當(dāng)平行測試來自前列腺患者的28份血清與來自乳腺癌患者的28份血清的組合組 時，利用兩種測定獲得的值之間存在顯著相關(guān)性(r = 0.85)。實(shí)體腫瘤患者的血液中存在高 比例的無活性血清TK1[17，18]很可能是上述結(jié)果的一種解釋。
[0210]實(shí)施例7:單克隆抗ΤΚ1抗體的⑶R區(qū)的測序
[0211] 從冷凍的雜交瘤細(xì)胞中提取出總RNA，并且由所述RNA合成cDNA。然后進(jìn)行RT-PCR 以擴(kuò)增抗體的可變區(qū)（重鏈和輕鏈），然后將其單獨(dú)地克隆至標(biāo)準(zhǔn)克隆載體中并且測序。 [0212]按照TRIzol?.Plus RNA純化系統(tǒng)（Invitrogen，目錄號：15596-026)的技術(shù)手冊 從雜交瘤細(xì)胞分離總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA。更詳細(xì)來說，使樣本的分離的總 RNA在1.5%瓊脂糖/GeIRed?凝膠上在DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker III(TIANGEN，目錄號:MD103)旁邊跑 膠。圖6A示出DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker III的電泳瓊脂糖凝膠，而圖6B-6D示出利用DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker III(泳道Μ)以及產(chǎn)生XPA 210-Arl (圖6B)、XPA 210-Ar2(圖6C)和XPA 210-Ar3(圖6D)的雜 交瘤細(xì)胞的總RNA的相應(yīng)電泳瓊脂糖凝膠。
[0213] 按照SuperScriptTM III第一鏈合成系統(tǒng)（Invitrogen，目錄號：18080-051)的技 術(shù)手冊，使用同種型特異性反義引物或通用引物使總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenScript的 RACE的標(biāo)準(zhǔn)操作程序來擴(kuò)增VH和VL的抗體片段。
[0214] 更詳細(xì)來說，如圖7A-7C中所示使各樣本的4μ1 PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖/661此(1? 凝膠上在DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker III旁邊跑膠。純化PCR產(chǎn)物且存儲在-20°C下直至進(jìn)一步使用。圖 7A-7C中的泳道Μ指示DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker III，而泳道1和泳道2分別對應(yīng)于XPA 210-Arl (圖 7A)、XPA 210-Ar2(圖7B)和XPA 210-Ar3(圖7C)的VH和VL片段。
[0215] 使用標(biāo)準(zhǔn)分子克隆程序?qū)U(kuò)增過的抗體片段單獨(dú)地克隆至標(biāo)準(zhǔn)克隆載體中。
[0216] 進(jìn)行菌落PCR篩選以鑒定具有正確大小的插入序列的克隆。針對各抗體片段，對不 少于五個具有正確大小的插入序列的單一菌落進(jìn)行測序。更詳細(xì)來說，送出五個具有正確 VH和VL插入序列大小的單一菌落以進(jìn)行測序。發(fā)現(xiàn)五個不同的克隆的VH和VL基因近乎同 一。認(rèn)為以下所列出的共有序列是由對應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的序列。
[0217] XPA 210-Arl
[0218] 重鏈:DNA序列（405bp)-SEQ ID Ν0:37
[0219] 前導(dǎo)序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0221]重鏈:氨基酸序列（135aa)_SEQ ID Ν0:38
[0227]輕鏈:氨基酸序列（132aa)_SEQ ID Ν0:40
[0234]重鏈:氨基酸序列（135aa)_SEQ ID Ν0:42
[0238]前導(dǎo)序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0240] 輕鏈:氨基酸序列（132aa)_SEQ ID N0:44
[0241] 前導(dǎo)序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0243] XPA 210-Ar3
[0244] 重鏈：DNA序列（411bp)-SEQ ID N0:45
[0245] 前導(dǎo)序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0247]重鏈:氨基酸序列（137aa)_SEQ ID N0:46
[0250] 輕鏈：DNA序列（384bp)-SEQ ID N0:47
[0251] 前導(dǎo)序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0253] 輕鏈:氨基酸序列（128aa)_SEQ ID N0:48
[0254] 前導(dǎo)序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0256] 實(shí)施例8:單克隆抗TK1抗體的同種型鑒定
[0257] 將來自雜交瘤細(xì)胞系XPA 210-Arl的單克隆抗TK1抗體用于同種型分析測定，所述 測定是按照SBA Clonotyping?系統(tǒng)_HRP(SouthernBiotech，目錄號：5300-05)的技術(shù)手冊 來進(jìn)行。單克隆抗體XPA 210-Ar 1的同種型被測定為IgGl重鏈和K輕鏈，參見以下表3。
[0258]表3-儲備上清液的同種型鑒定
[0260]以上提供的實(shí)施例公開了可以用于確定具有充分特異性和靈敏度的常規(guī)體外診 斷測定具有臨床相關(guān)性的一對單克隆抗ΤΚ1抗體的產(chǎn)生和選擇。已經(jīng)描述了這樣的一對抗 體XPA 210-Ar 1和XPA 210-Ar2的免疫、選擇和表征，并且利用來自健康血液供者以及乳腺 癌患者和前列腺癌患者的樣本進(jìn)行原型夾心ELISA測定已經(jīng)產(chǎn)生了有希望的結(jié)果，與可用 的TK Liaison測定相比，具有較高靈敏度。
[0261]初步選擇策略是基于其中TK1的選定區(qū)域代表C末端結(jié)構(gòu)域的肽偶聯(lián)物，所述C末 端結(jié)構(gòu)域參與酶的細(xì)胞周期調(diào)控。
[0262]已經(jīng)選擇三種單克隆抗體，且其獨(dú)特性質(zhì)是其有效地結(jié)合人TK1的血清形式。這是 獨(dú)特的，因?yàn)槿舾煞N其他抗體可以結(jié)合抗原肽和人rTKl，但僅這三種單克隆抗體可以在使 用人血清的夾心免疫測定形式中起作用。
[0263] 所述抗體中有兩種是用肽-BSA偶聯(lián)物獲得(XPA 210-Arl和XPA 210-Ar3)，而一種 (XPA 210-Ar2)是用肽-KLH偶聯(lián)物產(chǎn)生。盡管初步選出四種克隆，但沒有發(fā)現(xiàn)由用顯示出這 種能力的人rTKl進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的抗體具有所期望的特征。這個結(jié)果是根據(jù)以下事實(shí):現(xiàn) 在有若干種單克隆抗TK1抗體可商購獲得，而仍沒有開發(fā)出基于這些抗體的用于臨床使用 的測定。
[0264] 已經(jīng)用這里所描述的夾心ELISA測定形式測試了市售單克隆抗體中的四種 (3B3 · El 1，來自 Abeam;M02，來自 Abnova的克隆F12 ;EPR3194和EPR3193，來自 Abnova的兔 Mab)，但其中無一可以與血清TK1充分反應(yīng)。因此，基于rTKl的合適單克隆抗體的產(chǎn)生顯然 低效，并且可能與血液中所發(fā)現(xiàn)的TK1蛋白的復(fù)雜寡聚結(jié)構(gòu)有關(guān)。
[0265] 這里所描述的單克隆抗TK1抗體的獨(dú)特性質(zhì)很可能部分由于其表位結(jié)合性質(zhì)，這 是不同的而且明顯補(bǔ)充了有效免疫檢測。
[0266] 在所公開的原型ELISA測定中，使用XPA 210-Arl和XPA 210-Ar2。替代地，這些抗 體之一可以交換為XPA 210-Ar3。此外，對于改進(jìn)的測定或?qū)τ诿庖邷y定的特殊應(yīng)用，XPA 210-Ar3的可利用性很有可能將是非常有益的。這些單克隆抗TK1抗體的存在是功能ELISA 測定的一個先決條件。
[0267] 實(shí)施例9:重組TK1與XPA 210-Arl和XPA 210-Ar2之間的相互作用的結(jié)合研究 [0268]為了測定夾心ELISA程序中所使用的重組TK1與兩種單克隆抗體之間的相互作用 的結(jié)合特征，利用表面共振傳感器技術(shù)，更具體來說，利用Attana 200雙通道連續(xù)流動系統(tǒng) 進(jìn)行了初步結(jié)合研究。這種方法是基于石英晶體微天平(Quartz Crystal Microbalance) 技術(shù)，它提供了有關(guān)抗體抗原相互作用的結(jié)合性質(zhì)的高度生物學(xué)相關(guān)信息。
[0269] 在圖8A和圖8B中所示的實(shí)驗(yàn)中，使用LNB羧基感測器芯片，利用胺偶聯(lián)程序使其與 小鼠 IgG俘獲試劑盒(Biacore，GE Healthcare)預(yù)反應(yīng)。配體是XPA 210-Arl和XPA 210-Ar2,并且通過兩次注射于10mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)中的50ug/ml抗體溶液，用抗小鼠抗 體將其俘獲至表面。無俘獲抗體的經(jīng)相同處理的芯片用作陰性對照。將在10mM HETOS、 150mM NaCl、0.005%Tween 20(pH 7.4)中稀釋至20ug/ml的純重組TK1 以25μ1/π?η注射在 表面上。締合時間是84s，且在另外的300s內(nèi)測量解離。注射無重組ΤΚ1的緩沖液作為空白， 并且從樣本注射信號中減去。
[0270] 通過從20ug/ml至1.25ug/ml的五種濃度重組TK1的一系列注射來進(jìn)行動力學(xué)測 量，且利用XPA 210-Arl和XPA 210-Arf所獲得的結(jié)果分別示于圖8A和圖8B中。使用1:1結(jié)合 模型由圖8A和圖8B中所示的雙參考數(shù)據(jù)的擬合曲線來計算動力學(xué)常數(shù)。由初步結(jié)合研究提 供的結(jié)果顯示重組TK1 與XPA 210-Arl(KD = 0.65nM)和XPA 210-Ar2(KD = 4.12nM)的納摩爾 (nM)親和力。所述結(jié)果進(jìn)一步表明與XPA 210-Ar2與重組TK1之間的相互作用相比，XPA 210-Arl與重組TK1之間似乎存在顯著更強(qiáng)的相互作用。
[0271] 上述實(shí)施方案應(yīng)理解為本發(fā)明的幾個說明性實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可 以在不背離本發(fā)明范圍的情況下對所述實(shí)施方案進(jìn)行各種修改、組合和改變。具體來說，不 同實(shí)施方案中的不同部分解決方案可以組合在技術(shù)上可能的其他配置中。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種單克隆抗體或單克隆抗體的片段，其能夠結(jié)合人胸苷激酶1，即TK1的血清形式， 其中所述單克隆抗體或片段對選自由以下各項(xiàng)組成的組的表位具有特異性： 所述人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2); 所述人TK1 的NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5)和NCPVPGKPGEAV (SEQ ID N0:3)中的至少一個;和 所述人TK1的構(gòu)象依賴性表位。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或片段，其中所述單克隆抗體或片段能夠結(jié)合人 重組TK1和人TK1的細(xì)胞形式。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或片段，其中所述單克隆抗體或片段能夠結(jié)合 具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID N0:1)的肽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或片段，其可通過以下方法獲得，所 述方法包括： 利用第一肽偶聯(lián)物或第二肽偶聯(lián)物使非人動物免疫，所述第一肽偶聯(lián)物包含具有氨基 酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARK LFAPQ(SEQ ID N0:1)且與第一載體蛋白偶合的肽， 所述第二肽偶聯(lián)物包含具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQIDNO: 1)且與不同于所述第一載體蛋白的第二載體蛋白偶合的所述肽； 從對所述第一肽偶聯(lián)物或所述第二肽偶聯(lián)物具有血液效價的所述非人動物分離脾細(xì) 胞； 通過使所述脾細(xì)胞與骨髓瘤融合來形成雜交瘤； 針對對所述第二肽偶聯(lián)物的效價來篩選來自由用所述第一肽偶聯(lián)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生 的雜交瘤的上清液，且針對對所述第一肽偶聯(lián)物的效價來篩選來自由用所述第二肽偶聯(lián)物 進(jìn)行所述免疫而產(chǎn)生的雜交瘤的上清液； 選擇產(chǎn)生能夠結(jié)合所述第一肽偶聯(lián)物、所述第二肽偶聯(lián)物和人重組TK1的單克隆抗體 的雜交瘤;和 從所述選定雜交瘤的上清液分離所述單克隆抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或片段，其中所述單克隆抗體或片段 具有 可變重鏈VH結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)決定區(qū)1，即⑶R1，其具有氨基酸序列（SEQ ID N0:6); VH結(jié)構(gòu)域CDR2,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO:7); VH結(jié)構(gòu)域CDR3,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO:8); 可變輕鏈VL結(jié)構(gòu)域CDR1，其具有氨基酸序列（SEQ ID NO:9); VL結(jié)構(gòu)域CDR2,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO: 10);和 VL結(jié)構(gòu)域CDR3,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO: 11)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或片段，其中所述單克隆抗體或片段 具有 VH結(jié)構(gòu)域CDR1，其具有氨基酸序列（SEQ ID N0:6); VH結(jié)構(gòu)域CDR2,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO: 12); VH結(jié)構(gòu)域CDR3,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO: 13); VL結(jié)構(gòu)域CDR1，其具有氨基酸序列（SEQ ID NO: 14); VL結(jié)構(gòu)域CDR2，其具有氨基酸序列（SEQIDN0:10);和 VL結(jié)構(gòu)域CDR3,其具有氨基酸序列（SEQ ID N0:11)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或片段，其中所述單克隆抗體或片段 具有 VH結(jié)構(gòu)域CDR1，其具有氨基酸序列（SEQ ID N0:15); VH結(jié)構(gòu)域CDR2,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO: 16); VH結(jié)構(gòu)域CDR3,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO: 17); VL結(jié)構(gòu)域CDR1，其具有氨基酸序列（SEQ ID NO: 18); VL結(jié)構(gòu)域CDR2,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO: 19);和 VL結(jié)構(gòu)域CDR3,其具有氨基酸序列（SEQ ID NO:20)。8. -種用于測定身體樣本中的細(xì)胞和/或血清TK1物質(zhì)的水平的方法，其包括： 使所述身體樣本與根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或片段接觸;和 檢測所結(jié)合的單克隆抗體或片段的量。9. 一種用于測定身體樣本中的細(xì)胞和/或血清TK1物質(zhì)的水平的試劑盒，其包括： 已固定至固體載體或欲固定至所述固體載體的根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的第 一單克隆抗體;和 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的第二單克隆抗體，其中 所述第一單克隆抗體對第一表位具有特異性，所述第一表位選自由以下各項(xiàng)組成的 組： 人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2); 所述人TK1 的NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID N0:5)和NCPVPGKPGEAV (SEQ ID N0:3)中的至少一個;和 所述人TK1的構(gòu)象依賴性表位，且 所述第二單克隆抗體對選自所述組的不同的第二表位具有特異性。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述試劑盒是夾心測定試劑盒。11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的試劑盒，其中所述試劑盒是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) 試劑盒。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述第二單克隆抗體具有共價連接的生物素 或者共價連接的鏈霉親和素或親和素。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括： 辣根過氧化物酶(HRP)、標(biāo)記的鏈霉親和素或親和素、或者HRP標(biāo)記的生物素;和 HRP底物，所述HRP底物選自由以下各項(xiàng)組成的組：3，3 '，5，5 ' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)底 物、3，3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物和2，2聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS)底 物。14. 根據(jù)權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括微量滴定板作為所述固 體載體。15. 根據(jù)權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括瓊脂糖珠?；虼判灾榱?作為所述固體載體。16. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中 所述第一單克隆抗體對所述第一表位具有特異性，所述第一表位選自所述人TK1的 GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2)和所述人TK1的所述構(gòu)象依賴性表位中的一個，且 所述第二單克隆抗體對所述第二表位具有特異性，所述第二表位選自所述人TK1的 GEAVAARKLF(SEQ ID N0:2)和所述人TK1的所述構(gòu)象依賴性表位中的另一個。17. -種用于估計受試者中腫瘤復(fù)發(fā)的可能性的方法，其包括： 使用根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求9至16中任一項(xiàng)所述的試劑盒來測定 來自所述受試者的身體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平，和 將所述身體樣本中的所述血清TK1物質(zhì)的水平與代表健康受試者群體的血清TK1物質(zhì) 的水平或與先前在所述受試者中測得的血清TK1物質(zhì)的水平相比較。18. -種用于測定受試者中細(xì)胞增殖的方法，其包括： 使用根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求9至16中任一項(xiàng)所述的試劑盒來測定 來自所述受試者的身體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平，和 基于所述身體樣本中的所述血清TK1物質(zhì)的水平來測定所述細(xì)胞增殖。19. 一種用于測定罹患惡性疾病的受試者中增殖過程反應(yīng)的方法，其包括： 使用根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求9至16中任一項(xiàng)所述的試劑盒來測定 來自所述受試者的身體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平，和 基于所述身體樣本中的所述血清TK1物質(zhì)的水平來測定所述增殖過程反應(yīng)。20. -種用于測定受試者中炎癥、感染或腫瘤細(xì)胞增殖的水平的方法，其包括： 使用根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求9至16中任一項(xiàng)所述的試劑盒來測定 來自所述受試者的身體樣本中的血清TK1物質(zhì)的水平，和 基于所述身體樣本中的所述血清TK1物質(zhì)的水平來測定所述炎癥、感染或腫瘤細(xì)胞增 殖的水平。21. 根據(jù)權(quán)利要求8、17-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述身體樣本選自由以下各項(xiàng)組 成的組:細(xì)胞樣本、組織樣本、血液樣本、血清樣本、腦脊髓液樣本、胸膜液樣本、滑膜液樣本 和腹膜腔液樣本。22. -種分離的肽，其由氨基酸序列GEAVAARKLF(SEQ ID NO:2)、NCPVPGKPGE(SEQ ID N0:4)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO:5)或NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3)組成。23. -種產(chǎn)生能夠結(jié)合人胸苷激酶1TK1的血清形式的單克隆抗體的方法，所述方法包 括： 利用第一肽偶聯(lián)物或第二肽偶聯(lián)物使非人動物免疫，所述第一肽偶聯(lián)物包含具有氨基 酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARK LFAPQ(SEQ ID ΝΟ:1)且與第一載體蛋白偶合的肽， 所述第二肽偶聯(lián)物包含具有氨基酸序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQIDNO: 1)且與不同于所述第一載體蛋白的第二載體蛋白偶合的所述肽； 從對所述第一肽偶聯(lián)物或所述第二肽偶聯(lián)物具有血液效價的所述非人動物分離脾細(xì) 胞； 通過使所述脾細(xì)胞與骨髓瘤融合來形成雜交瘤； 針對對所述第二肽偶聯(lián)物的效價來篩選來自由用所述第一肽偶聯(lián)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生 的雜交瘤的上清液，且針對對所述第一肽偶聯(lián)物的效價來篩選來自由用所述第二肽偶聯(lián)物 進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的雜交瘤的上清液； 選擇產(chǎn)生能夠結(jié)合所述第一肽偶聯(lián)物、所述第二肽偶聯(lián)物和人rTKl的單克隆抗體的雜 交瘤;和 從所述選定雜交瘤的上清液分離所述單克隆抗體。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中選擇所述雜交瘤包括選擇產(chǎn)生能夠結(jié)合所述第 一肽偶聯(lián)物、所述第二肽偶聯(lián)物、所述人rTKl和獲自罹患癌癥的人受試者的血清樣本中所 存在的TK1的單克隆抗體的雜交瘤。
【文檔編號】C12N9/12GK105980407SQ201480075429
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年12月18日
【發(fā)明人】S·埃里克松
【申請人】阿洛賽爾公司