抗大腸桿菌o157:h7單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。產(chǎn)生抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株10G1A2，其保藏號為CGMCC NO.9999。本發(fā)明還提供一種由所述雜交瘤細(xì)胞株10G1A2分泌的抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體、包被的免疫磁珠及所述免疫磁珠在檢測大腸桿菌O157:H7方面的應(yīng)用。本發(fā)明抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體包被的磁珠可以從體積較大的樣品增菌液中有效富集大腸桿菌O157:H7，然后采用熒光定量PCR檢測方法，可以極大的提高大腸桿菌O157:H7的檢測靈敏度，提高大腸桿菌O157:H7 檢測的準(zhǔn)確性。
CGMCC NO. 9999
2014.11.18
【專利說明】抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]食源性病原微生物污染是當(dāng)今世界上不斷增多的食品安全問題和突發(fā)性公共衛(wèi)生事件之一。據(jù)WHO估計(jì)，食源性疾病的漏報(bào)率在95%以上，全世界每年至少有200萬人死于以感染性腹瀉為主的食源性疾病，這類感染大部分是因食品和飲水受微生物污染所致。在食源性病原微生物中，腸出血性大腸桿菌(EHEC)占有重要地位。
[0003]EHEC 主要包括 0157:H7(又稱為大腸桿菌 0157:H7 或萬.coli 0157:H7)，026:H11和0111等幾種血清型，其中0157:H7是典型菌株。大腸桿菌0157:H7感染能引起出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic colitis, HC)，闌尾炎，食管狹窄和結(jié)腸穿孔等嚴(yán)重胃腸道并發(fā)癥，在兒童和老年人中還可引起溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome, HUS )及血栓性血小板減少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic purpura, TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，重者可引起死亡。大腸桿菌0157:Η7長期駐留于牛、羊、豬、雞等家畜家禽的腸道中，并且牛是主要的貯存宿主，容易造成幼齡動物腹瀉，進(jìn)而污染畜禽產(chǎn)品、水源及農(nóng)作物等，給農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，同時(shí)也對人們的健康構(gòu)成巨大威脅。1982年該菌首先在美國被發(fā)現(xiàn)，此后在世界各地散發(fā)或地方流行，1996年在日本大阪地區(qū)發(fā)生流行，患者逾萬、死亡11人，1999~2000年在中國江蘇、安徽等地發(fā)生了多起食源性感染0157:Η7事件，導(dǎo)致177人死亡。大腸桿菌0157:Η7的感染具有暴發(fā)流行趨勢、強(qiáng)烈的致病性與致死性以及抗生素治療可能會加劇病情等特點(diǎn)，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，世界性衛(wèi)生組織也已將大腸桿菌0157: Η7列為新的食源性病原菌?，F(xiàn)有檢測大腸桿菌0157: Η7的熒光定量方法，檢測靈敏度達(dá)到80CFU/ml，仍然不能滿足監(jiān)控的要求，尤其在樣品中污染的大腸桿菌0157:H7較少時(shí)，樣品取樣誤差和靈敏度不夠高，造成檢出率不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供分泌抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供上述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體，該單克隆抗體的特異性強(qiáng)、靈敏度高。
[0006]本發(fā)明的再一目的是提供抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體在檢測大腸桿菌0157: H7方面的應(yīng)用，能夠有效富集待測樣品中的大腸桿菌0157: H7，結(jié)合熒光定量PCR方法，顯著提高了靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0007]本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0008]一種產(chǎn)生抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株10G1A2，其保藏號為CGMCC N0.9999。
[0009]本發(fā)明還提供一種由所述雜交瘤細(xì)胞株10G1A2分泌的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體。
[0010]本發(fā)明還提供所述抗大腸桿菌0157: H7單克隆抗體在檢測大腸桿菌0157: H7方面的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明還提供所述抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被的免疫磁珠及所述免疫磁珠在檢測大腸桿菌0157:H7方面的應(yīng)用。
[0012]在本發(fā)明中，采用所述免疫磁珠富集待測樣品中的大腸桿菌0157:H7，得到富集液；采用熒光定量PCR方法檢測所述富集液中的大腸桿菌0157:H7。
[0013]在本發(fā)明中，所述富集待測樣品中大腸桿菌0157:H7的方法為:將所述免疫磁珠加入待測樣品中進(jìn)行吸附，用磁力架沉淀所述免疫磁珠，洗脫所述免疫磁珠，取洗脫液作為富集液。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明用大腸桿菌0157:H7全菌免疫，之后用大腸桿菌0157:H7表面脂多糖挑選特異性單克隆抗體，大大提高了該單克隆抗體對大腸桿菌0157:H7的特異性和靈敏度。
[0015]與常規(guī)方法相比，本發(fā)明抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被的磁珠可以從體積較大的樣品增菌液中有效富集大腸桿菌0157:H7，然后采用熒光定量PCR檢測方法，可以極大的提高大腸桿菌0157:H7的檢測靈敏度；此外本發(fā)明抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被的磁珠能特異性地吸附預(yù)增菌液中的大腸桿菌0157:H7，可排除其他雜菌對分離培養(yǎng)或熒光定量PCR檢測的干擾，可以提高大腸桿菌0157:H7檢測的準(zhǔn)確性。由于磁珠包被有特異性抗體，富集效果及效率大大提高，磁珠與細(xì)菌結(jié)合是通過非共價(jià)鍵結(jié)合，不會影響大腸桿菌0157:H7的生理和生化特性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖，其中M-分子量Mark，1-純化抗大腸桿菌0157:H7表面脂多糖單克隆抗體。
[0017]保藏信息:
參椐的生物材料(株):10G1A2 ；
分類命名:產(chǎn)大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；
保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jfta:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所；
保藏號為CGMCC N0.9999，保藏日期為:2014年11月18日。
具體實(shí)施方案
[0018]0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH9.6):含有 0.05 mol/L Na2CO3和 0.05 mol/L NaHCO3的水溶液，PH值為9.6。
[0019]PBS 緩沖液(0.01M, pH 7.4):取 137 mmol NaCl,2.7 mmol KClUO mmol Na2HPO4和2 mmol KH2P04溶于水，調(diào)節(jié)pH至7.4，用水定容至1L。
[0020]PBST緩沖液:在PBS緩沖液((λ 01M, pH 7.4)中添加終濃度為0.05% (質(zhì)量百分濃度)吐溫一 20。
[0021]封閉液:含質(zhì)量濃度為0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBST緩沖液。
[0022]羊抗鼠HRP-1gG: HRP (辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG (abeam:ab6789)。
[0023]TMB底物顯色液:包括A液和B液。A液:將I mL濃度為10 mg/mL的3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺(縮寫為TMB，鄭州四季化工公司)溶液加入到100 mL濃度為0.1 mol/L、pH為6.0的磷酸緩沖液中配成；所述濃度為0.1 mol/L, pH為6.0的磷酸緩沖液的配制方法為:0.1 mol/L磷酸二氫鈉水溶液87.7mol/L磷酸氫二鈉水溶液12.3 mL混合即成。B液:體積濃度為3%的H2O2水溶液，10 mL。A液和B液均需4°C密封、避光保存。使用時(shí)每10 mL A液加50 μ L B液混勻即用。
[0024]終止液:2mol/L 的 H2SO4溶液。
[0025]氨基喋呤(A )貯存液配制方法:取1.76mg氨基喋呤，加入90mL超純水中，滴加lmol/L NaOH水溶液0.5mL助溶，待完全溶解后，加lmol/L鹽酸0.5mL中和，加超純水定容至100mL，0.22um膜過濾除菌，小量分裝，-20°C保存。
[0026]次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)貯存液配制方法:取136.1mg次黃嘌呤(H)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(T)，加超純水至100mL，置于45-50°C水浴中使之完全溶解。0.22um膜過濾除菌，小量分裝，_20°C保存，臨用前37°C水浴中溶解。
[0027]L-谷氨酰胺(L.G)溶液配制方法:取2.92g L-谷氨酰胺，溶于10mL超純水中，
0.22um膜過濾除菌，小量分裝，-20°C保存。
[0028]雙抗溶液(青鏈霉素溶液)配制方法:取青霉素(鈉鹽)100萬單位和鏈霉素(硫酸鹽)lg，溶于10mL滅菌超純水中，小量分裝，-20°C保存。
[0029]完全培養(yǎng)基RPM1-1640:在購買的不完全RPM1-1640培養(yǎng)基中加入終濃度(體積百分濃度)均為1%的L.G溶液和雙抗溶液，加終濃度(體積百分濃度)為10%的新生犢牛血清。
[0030]HT培養(yǎng)箱:在完全培養(yǎng)基RPM1-1640中加入終濃度(體積百分濃度)為1%的HT貯存液
HAT培養(yǎng)基:在完全培養(yǎng)基RPM1-1640中加入終濃度(體積百分濃度)為1%的HT貯存液和1%的A貯存液。
[0031]實(shí)施例1抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的制備 I抗原的制備
E.coli 0157:H7培養(yǎng)液50mL，1000rpm離心5min，取菌泥，用生理鹽水重懸，加入菌懸液體積0.5%的甲醛溶液，37°C滅活24h，生理鹽水洗滌三次后，調(diào)整菌液濃度為2.5X 19個(gè)/mL，得到滅活0157:H7菌懸液，_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0032]取滅活0157:H7菌懸液，使用iNtRON B1technology公司脂多糖提取試劑盒LPSExtract1n Kit (貨號:17141 )，提取大腸桿菌0157:H7表面脂多糖，_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0033]2雜交瘤細(xì)胞株的建立
2.1免疫動物
選擇6~8周齡雌性BALB/c鼠10只。每只小鼠腹腔注射0.2mL滅活0157:H7菌懸液(步驟I制備)，每間隔I周同樣劑量加強(qiáng)注射一次，共免疫5次，其中最后一次免疫是在融合前3d，通過尾靜脈注射同樣量抗原加強(qiáng)免疫。
[0034]2.2飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
進(jìn)行細(xì)胞融合前24h，將BALB/c小鼠摘除眼球采血，分離血清，作為抗體檢測時(shí)的陰性對照血清；同時(shí)通過頸脫位致死小鼠，于75%酒精中浸泡lOmin，腹部向上固定后，無菌剪開腹部皮膚，鑷子剝離皮膚，暴露腹膜，酒精棉球擦拭腹膜消毒；用注射器注射1mL HAT培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管，右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部lmin，隨后反復(fù)抽吸注入的培養(yǎng)基直至吸入注射器內(nèi)的HAT培養(yǎng)基泛黃為止。把吸出的培養(yǎng)基在1000r/min離心lOmin，棄上清，用5mL HAT培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，使用HAT培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)到2 X 15個(gè)/mL，得到飼養(yǎng)細(xì)胞懸液。將飼養(yǎng)細(xì)胞懸液加Λ 96孔板，每孔一滴(約5(^10，置37°0、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0035]2.3骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的制備
融合前兩周開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 (由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室饋贈)，擴(kuò)大培養(yǎng)，融合時(shí)確保骨髓瘤細(xì)胞SP2/0處于對數(shù)生長期，有良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95% ;融合當(dāng)天，用不完全RPM1-1640培養(yǎng)基(Gibco貨號:12633012)將骨髓瘤細(xì)胞SP2/0從瓶壁輕輕吹下，收集于50mL離心管內(nèi)，1000r/min離心lOmin，棄去上清，加入不完全RPM1-1640培養(yǎng)基30mL，同法離心棄去上清；然后將細(xì)胞重懸浮于不完全RPM1-1640培養(yǎng)基1mL,混勻，制成骨髓瘤細(xì)胞SP2/0懸液，并做活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0036]2.4脾淋巴細(xì)胞的制備
取標(biāo)題2.1中最后一次免疫3d后的雌性BALB/c小鼠，摘除眼球采血作為陽性血清；頸脫位法致死小鼠，于75%酒精中浸泡lOmin，隨即放入超凈臺內(nèi)的解剖板上，腹部朝上，四肢固定。無菌取出脾臟，用不完全RPM1-1640培養(yǎng)基洗滌數(shù)次，并用鑷子除去附著的結(jié)締組織。將脾臟移入200目微孔濾網(wǎng)上，置于新鮮不完全RPM1-1640培養(yǎng)基中，用研磨棒輕輕研磨，將脾臟制成單細(xì)胞懸液，收集脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心lOmin，取脾細(xì)胞用不完全RPM1-1640離心洗滌1~2次，最后將脾細(xì)胞重懸于1mL不完全RPM1-1640中，混勾，得到脾淋巴細(xì)胞懸液，并做活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。
[0037]2.5細(xì)胞融合
按常規(guī)方法融合，取計(jì)數(shù)后的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與脾淋巴細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)之比為1:5-1:10的比例混合于50mL離心瓶中，充分混勾，1000r/min離心lOmin，棄上清。用手掌輕擊離心瓶底，將沉淀的細(xì)胞打散。將離心瓶底部放入40~41°C水浴中，邊旋轉(zhuǎn)邊加入融合用的PEG-4000 lmL，在Imin內(nèi)加完，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)同時(shí)加入不完全RPM1-1640培養(yǎng)基15mL，在90s內(nèi)加完，由慢到快，前5s加ImLo室溫靜置1min后，1000r/min離心lOmin，棄上清，加入HAT培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基對雜交瘤細(xì)胞具有選擇性所以有時(shí)候稱為HAT選擇性培養(yǎng)基)，懸浮雜交瘤細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞懸浮液分配到加入了飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°〇、5%0)2的溫箱中培養(yǎng)。5d后，用新鮮預(yù)熱的HAT培養(yǎng)基換出一半培養(yǎng)基；1d后用預(yù)熱的HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；觀察雜交瘤細(xì)胞的生長情況，待其細(xì)胞培養(yǎng)液上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時(shí)，吸取適量細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行抗體檢測。
[0038]2.6 篩選
2.6.1間接ELISA最佳抗原包被量和血清稀釋度的選擇
融合前免疫小鼠眼球采血制備的陽性血清(標(biāo)題2.4)，篩選時(shí)作為陽性對照；非免疫小鼠眼球采血制備的血清作為陰性對照(標(biāo)題2.2)，同時(shí)以PBST緩沖液作為空白對照調(diào)零孔。在酶標(biāo)板上進(jìn)行方陣試驗(yàn)，確定檢測抗原的最佳包被濃度及陽性、陰性對照的最佳稀釋濃度，具體步驟為:
(I)包被:檢測抗原(本實(shí)施例標(biāo)題I中滅活0157:H7菌懸液)用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)分別稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍，自左向右每個(gè)稀釋度加一列，100μ L/孔，37°C作用2h后置4°C過夜；
(2)洗滌:棄去孔內(nèi)的液體，PBST緩沖液洗3次，每次洗滌5min，拍干；
(3)封閉:每孔加入15(^1^封閉液，37°〇作用2h；
(4)洗滌:方法同前；
(5)加入一抗:一抗(標(biāo)題2.4制備的陽性血清)用PBST緩沖液分別稀釋100倍、1000倍、10000倍，每個(gè)稀釋度加一行，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；
(6)洗滌:方法同前；
(7)酶標(biāo)二抗:加入工作濃度(1:3000稀釋)的羊抗鼠HRP-1gGaOOy L/孔，37°C孵育lh，洗滌同前；
(8)顯色:加入TMB底物顯色液100μ L/孔，37 °C反應(yīng)10~15 min ；
(9)終止反應(yīng):加入終止液，50μ L/孔，終止反應(yīng)，測定各孔OD45tl。
[0039]結(jié)果判定:以陽性血清OD45tl值在1.0左右，陰性血清OD 45(|值小于0.2，且陽性血清OD45tl值/陰性血清OD 450 (Ρ/Ν值)最大時(shí)為檢測抗原的最佳工作濃度，該點(diǎn)對應(yīng)的血清稀釋度為最佳血清稀釋度。結(jié)果:檢測抗原(標(biāo)題I中滅活0157:Η7菌懸液)的最佳包被濃度為I X 16個(gè)/mL,陽性血清的最佳稀釋度為1:1000 ;陰性的最佳稀釋度為1:1000。
[0040]制備包被有檢測抗原的酶標(biāo)板:
(1)包被:檢測抗原以最佳工作濃度包被96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，10yL/孔，37°C作用2h后置4°C過夜；
(2)洗滌:棄包被液，用PBST緩沖液洗3次，每次洗滌5min，拍干；
(3)封閉:每孔加入150μ L封閉液進(jìn)行封閉，37°C作用2h ;
(4)洗滌:按照步驟(2)方法洗滌，得到包被有檢測抗原的酶標(biāo)板，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0041]注:下面的間接ELISA檢測中，采用包被有檢測抗原的酶標(biāo)板，陽性、陰性血清均取最佳稀釋度。
[0042]2.6.2 間接 ELISA 試驗(yàn)
為了篩選雜交瘤細(xì)胞株，取標(biāo)題2.5中細(xì)胞培養(yǎng)液上清100 μ L加入包被有檢測抗原的酶標(biāo)板中，同時(shí)設(shè)立陽性、陰性和空白對照，37°C孵育lh，洗滌；加入工作濃度(1:3000稀釋)的羊抗鼠HRP-1gG，100 μ L/孔，37°C孵育lh，同前洗滌拍干；加入TMB底物顯色液100 μ L/孔，37 °C反應(yīng)10~15 min ;加入終止液50 μ L/孔，終止反應(yīng)。測定各孔0D45(I。判斷標(biāo)準(zhǔn):待檢孔的OD450/陰性孔的OD45tl彡2.1即可判為待檢孔內(nèi)細(xì)胞株為陽性，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
[0043]2.7雜交瘤細(xì)胞的克隆化
采用有限稀釋法對連續(xù)兩次檢測為陽性的細(xì)胞株進(jìn)行克隆化?？寺∏爸苽湫∈箫曫B(yǎng)細(xì)胞。對待克隆孔內(nèi)活細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，用HT培養(yǎng)基10倍比稀釋成20個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基，加入到已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每孔理論上有I個(gè)細(xì)胞，置于37°0、5%0)2的溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至孔底面積的1/10時(shí)進(jìn)行檢測，強(qiáng)陽性孔再按照相同方法進(jìn)行克隆，如此重復(fù)3~4次，直至陽性率達(dá)到100%，獲得初步篩選的雜交瘤細(xì)胞株。將初步篩選的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存細(xì)胞，同時(shí)保留上清液，采用間接ELISA測定抗體效價(jià)，選取效價(jià)較高的若干雜交瘤細(xì)胞株。
[0044]2.8雜交瘤細(xì)胞株的篩選
取大腸桿菌0157:H7表面脂多糖進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并與標(biāo)題2.7中效價(jià)較高的若干雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液分別進(jìn)行免疫雜交，選取免疫反應(yīng)效果最好的克隆作為分泌抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為10G1A2。
[0045]2.9單克隆抗體的特異性
受試菌株包括厶 Coli 0157:H7、EHEC 026:Hl1、EHEC 0111、EPEC 0127:H6、ETEC0148:H28、厶 coli 025、厶 coli 055、厶 coliQlE.coli 0103、厶 coli 0138、厶 coli0139, B.coli 0141, B.coli 0145, coli K88, B.coli K99, B.coli BL2U B.coliToplO、金黃色葡萄球菌、志賀桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、臘樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、多殺性巴氏桿菌、鴨疫里氏桿菌、副豬嗜血桿菌、乳酸桿菌、布氏桿菌、李氏桿菌、禽分支桿菌、鏈球菌、魏氏梭菌、肉毒梭菌、禽波氏菌。將各受試菌株按照標(biāo)題2.6.1中方法包被酶標(biāo)板，然后進(jìn)行間接ELISA檢測，考察雜交瘤細(xì)胞株10G1A2培養(yǎng)液上清的特異性。結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞株10G1A2培養(yǎng)液上清只與E.Coli 0157:H7發(fā)生陽性反應(yīng)，其他各菌均為陰性反應(yīng)(待檢孔的OD450/陰性孔的OD45tl^ 2.1判定為陽性)。
[0046]3.單克隆抗體的制備及性質(zhì)
3.1單克隆抗體的制備
選8~10周齡體重20g以上的雌性BALB/c鼠，腹腔注射液體石蠟，0.5mL/只，I周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株10G1A2 (2X 106~5X 16細(xì)胞/只)，在動物腹部明顯增大時(shí)抽取腹水，3000r/min離心lOmin，取上清液，_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0047]利用HiTrap? Protein G親和層析柱(生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號SD6606)對腹水上清液進(jìn)行純化。純化過程中所用試劑全為化學(xué)純，所有溶液的溶劑全為去離子水，配好后用0.45 μ m濾膜過濾，腹水上清液純化前10000 r/min離心3min。純化具體操作步驟如下:
(I)去掉層析柱頂部的塞子，用接合器把注射器和層析柱連在一起。
[0048](2)去掉層析柱尾部的snap-off。
[0049](3)用注射器吸取10ml binding buffer (生物工程(上海)股份有限公司，貨號BSP048-2)，“滴對滴”式注入，以防空氣進(jìn)入層析柱，注射速率lml/min。
[0050](4)吸取待純化腹水上清液，注入到層析柱中。
[0051](5)吸取10ml binding buffer于層析柱中，洗脫雜蛋白。
[0052](6)用5 ml elut1n buffer (0.1M梓檬酸溶液)洗柱，準(zhǔn)備1.5ml收集管5個(gè)，每管預(yù)先加入濃度為1M、pH9.0的Tris-HCl緩沖液200 μ L，每管收集1ml。
[0053]腹水上清液純化后，得到純化抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體，經(jīng)NanodroplOOO(Thermo)測得蛋白含量為1.027mg/mL，_20°C保存?zhèn)溆?，并用SDS-PAGE電泳觀察純化效果，可見目的蛋白純度很高，主條帶大小為略大于200kDa，如圖1。
[0054]3.2抗體效價(jià)測定
采用包被有檢測抗原的酶標(biāo)板(標(biāo)題2.6.1中制備)，將雜交瘤細(xì)胞株10G1A2培養(yǎng)液上清和腹水上清液做倍比稀釋，采用間接ELISA方法檢測效價(jià)，培養(yǎng)液上清效價(jià)為1:2430 ;腹水效價(jià)為>1:81000。
[0055]3.3亞類測定
按照Thermo scientific公司單克隆抗體亞類鑒定試劑盒操作說明書檢測抗體亞類。雜交瘤細(xì)胞株10G1A2產(chǎn)生的單克隆抗體亞類為IgG。
[0056]3.4單克隆抗體的親和常數(shù)
雜交瘤細(xì)胞株10G1A2產(chǎn)生的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的親和常數(shù)Kd=5.69*10_8。
[0057]實(shí)施例2制備抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被的免疫磁珠
1.取165u L磁珠懸浮液(含磁珠5mg，購于Life technologies，貨號1309004)置離心管內(nèi)，用磁力架將磁珠沉淀(以下簡稱磁力沉淀)，具體操作步驟是:將離心管放于磁力架上，待上層液體變澄清后棄掉上清，保留底部的磁珠，移開磁力架；
2.加入ImL磁珠偶聯(lián)緩沖液，重懸磁珠，磁力沉淀；
3.先后加入75.7 yL磁珠偶聯(lián)緩沖液、50 yL實(shí)施例1中制備的純化抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體(含抗體10ug)和步驟2中磁力沉淀后的磁珠，混勻，再加入100 μ L處理液，混勻，置37°C搖床上孵育18h后，磁力沉淀；
4.加入ImL封閉液A重懸磁珠，37°C搖床上孵育Ih后，磁力沉淀；
5.加入ImL儲備液，渦旋振蕩5-lOs后，磁力沉淀；重復(fù)該操作一次；加入240uL儲備液混勻(溶液總體積250uL)，得到抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被的免疫磁珠，于4°C冰箱保存。
[0058]磁珠偶聯(lián)緩沖液:lmol/L的硼酸鹽緩沖液，其pH為7.4 ;
處理液:在lmol/L的硼酸鹽緩沖液(pH為7.4)中添加終濃度為3mol/L的硫酸銨； 封閉液A:0.5g牛血清白蛋白(BSA )溶于10mL的PBS緩沖液(0.02M，pH為7.4); 儲備液:0.1g BSA 溶于 10mL PBS 緩沖液(0.02M，pH 為 7.4);
PBS 緩沖液(0.02M，pH 為 7.4):含有 Na2HPO4 2.9g/L,KH2PO4 0.2g/L、NaCl 8.0g/L、KCl
0.28/1的水溶液，其？!1為7.4。
[0059]實(shí)施例3利用抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被的免疫磁珠檢測大腸桿菌0157:H7
(1)依據(jù)SN/T0793-2010(進(jìn)出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌0157:H7檢測方法)進(jìn)行待測樣品的預(yù)增菌:將待測樣品加入EC肉湯中，在42°C條件下培養(yǎng)18-24h，獲得增菌液；
(2)在離心管中加入步驟(I)得到的增菌液20-30mL，然后加入抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被的免疫磁珠(實(shí)施例2制備)50 μ L，37°C孵育Ih ；
(3)洗滌磁珠:將離心管放于磁力架上將磁珠沉淀，3min后棄去上清，加入30mLPBS緩沖液(0.02M，pH為7.4)緩慢重懸，用磁力架將磁珠沉淀，棄去上清。如此重復(fù)洗滌3次；
(4)向洗滌后的免疫磁珠中加入ImL濃度為50mmol/L甘氨酸水溶液，間斷振蕩洗脫免疫磁珠lh，將離心管放于磁力架上，待免疫磁珠全部被吸附于管壁上時(shí)取出上清液，即洗脫液。此洗脫液為大腸桿菌0157:H7富集液。從大腸桿菌0157:H7富集液中直接提取樣品DNA，然后用熒光定量PCR法檢測待測樣品中是否存在大腸桿菌0157:H7。
[0060](5)熒光定量PCR檢測
取樣品DNA，使用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒(DRR390A)，配制反應(yīng)體系如下！PremixEx Taq(2X) 10ul、上游引物(1uM) 0.4ul、下游引物(1uM) 0.4ul、Taqman 探針 0.8ul、ROX Reference Dye II(ROX 參考染料II，50X )()0.2ul、模板(樣品 DNA)2ul、dH20 6.2ulo
[0061]上游引物(SEQID NO:1):5，-GCACTAAAAGCTTGGAGCAGTTC-3，。
[0062]下游引物(SEQID NO: 2 ):5 ’ -AACAATGGGTCAGCGGTAAGGCTA-3 ’。
[0063]Taqman 探針:5’-FAM-CGTTGGCGAGGACC-TAMRA-3’。FAM 是報(bào)告熒光基團(tuán)，TAMRA 淬滅熒光基團(tuán)。Taqman探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0064]配制好的20ul反應(yīng)體系，裝入熒光定量PCR反應(yīng)管中，蓋好管蓋，離心，確認(rèn)反應(yīng)管中無汽包后放入ABI7500熒光定量PCR儀中反應(yīng)。
[0065]反應(yīng)程序如下:第一步:95°C 30s;第二步95°C 5s，60°C 34s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)過程中在60°C收集熒光信號。最終結(jié)果:以CT值< 35為陽性，如CT值等于35則需重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證；CT值> 35為陰性反應(yīng)。
[0066]實(shí)施例4利用抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被的免疫磁珠檢測大腸桿菌0157:H7的靈敏度
制備大腸桿菌0157:H7菌液，10倍倍比稀釋，涂布山梨醇麥康凱瓊脂平板(參照進(jìn)出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌0157:H7檢測方法)以確定菌落數(shù)。
[0067]選取1iUo2Uo3Uo4Uo5CFUAiI稀釋菌液，采用實(shí)施例3中方法分別進(jìn)行大腸桿菌0157:H7檢測，考察本發(fā)明方法的靈敏度。結(jié)果為1iCFUAi1-1o5 CFU/ml各稀釋菌液均檢測為陽性。因此，本發(fā)明方法檢出靈敏度可達(dá)10CFU/mL以內(nèi)。
[0068]熒光定量PCR檢測方法對大腸桿菌0157:H7的檢出靈敏度為80CFU/ml(BaoguangLi, Jin-Qiang Chen.Real-Time RCR Methodology for Selective Detect1n of ViableEscherichia coli 0157:H7 Cells by Targeting Z3276 as a Genetic Marker [J].Applied and Environmental Microb1logy, 2012, 78(15): 5297-5304)。
[0069]實(shí)施例5利用抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被的免疫磁珠檢測大腸桿菌0157:H7的準(zhǔn)確性
1.干擾試驗(yàn):分別制備各干擾菌株的菌懸液(選用菌株為實(shí)例I標(biāo)題2.9中非0157:H7菌株)各25ml (菌液濃度為105/mL)，添加大腸桿菌0157:H7約1_10個(gè)，按照實(shí)施例3中的操作步驟進(jìn)行。結(jié)果均為陽性。
[0070]未添加大腸桿菌0157:H7的各干擾菌株的菌懸液(選用菌株為實(shí)例I標(biāo)題2.9中非0157:H7菌株)均為檢測陰性。
[0071]2.模擬檢測試驗(yàn):模擬自然感染的隨機(jī)接觸污染方式，人工制備隨機(jī)濃度(ICFU/g-103CFU/g)大腸桿菌0157:H7污染樣100份。分別按照SN/T0793-2010、本發(fā)明方法(實(shí)施例3中方法)以及熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)用SN/T0793-2010方法(進(jìn)出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌0157:H7檢測方法)的檢測率為57%，本發(fā)明方法檢出率為98%，熒光定量PCR方法檢出率為69%。表明本發(fā)明將免疫磁珠與熒光定量PCR聯(lián)用方法，能夠有效將樣品中的大腸桿菌0157:H7進(jìn)行富集，結(jié)合熒光定量PCR方法，大大提高了檢出率。本發(fā)明檢測方法的檢測率不僅顯著高于SN/T0793-2010方法，而且顯著高于熒光定量PCR方法。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)生抗大腸桿菌0157:??！7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株10以八2，其保藏號為06100 勵.9999。
2.一種由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株10以八2分泌的抗大腸桿菌0157 #7單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述抗大腸桿菌0157#7單克隆抗體在檢測大腸桿菌0157 #7方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述抗大腸桿菌0157:！！7單克隆抗體包被的免疫磁珠。
5.權(quán)利要求4所述免疫磁珠在檢測大腸桿菌0157:?。?方面的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于采用權(quán)利要求4所述免疫磁珠富集待測樣品中的大腸桿菌0157: ?。?，得到富集液；采用熒光定量方法檢測所述富集液中的大腸桿菌0157見
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于所述富集待測樣品中大腸桿菌0157:?。?的方法為:將權(quán)利要求4所述免疫磁珠加入待測樣品中進(jìn)行吸附，用磁力架沉淀所述免疫磁珠，洗脫所述免疫磁珠，取洗脫液作為富集液。
【文檔編號】G01N33/569GK104450628SQ201410832762
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】薛峰, 蔣原, 曾德新, 錢志娟, 胡月珍, 夏曉莉, 邵景東 申請人:江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心