專利名稱：：用于治療各種疾病的脂連蛋白的制作方法用于治療各種疾病的脂連蛋白背景用母乳喂養(yǎng)的兒童與用嬰兒配方食品喂養(yǎng)的兒童相比趨向于更加健康，過敏反應和傳染性疾病的發(fā)生率更低，并且趨向于更瘦[l]。盡管這些保護效應的原因尚未完全理解，但是乳蛋白(milkproteins)顯然在起作用。此外，先前的研究已經證實，人乳蛋白影響乳兒(nursinginfant)的胃腸、神經和免疫系統(tǒng)的發(fā)育[2-6]。脂連蛋白(也稱作ACRP30,adipoQ或GBP28)是一種主要在脂肪組織中由脂肪細胞產生的蛋白質[7-10],它作用于數種可能影響人的發(fā)育的生理過程。高濃度的循環(huán)脂連蛋白可通過減少促炎癥細胞因子[ll，12]，改善胰島素敏感性[13]，和提高脂肪酸代謝[14],從而對健康產生積極作用。人乳的組成在哺乳期婦女體內和之間有差異。個體內差異可能部分是由于在整個哺乳期中乳蛋白濃度的改變[15-17]。乳蛋白濃度的個體間變異性已經被歸因于遺傳變異[18,19]和母親肥胖[20],以及其他因素。在人類中，脂連蛋白水平與獨立于肥胖癥的胰島素抵抗負相關[21-23]，在具有2型糖尿病的個體中脂連蛋白水平最低[24-26]。而且，在胰島素抵抗發(fā)生前先出現低脂連蛋白，提示脂連蛋白對胰島素敏感性有直接作用[27-33]。小鼠研究證實，脂連蛋白改善葡萄糖的利用[34]。高脂連蛋白還與抗動脈粥樣硬化性的脂質分布譜有關。脂連蛋白始終與血漿甘油三酯(TG)負相關，與血漿HDL膽固醇水平正相關[35]。脂連蛋白直接影響脂質代謝和氧化。此外，脂連蛋白具有強烈的抗炎性質。脂連蛋白降低TNF-ot[11]和IL-6[11,12]的產生，提高巨噬細胞中抗炎細胞因子的表達[36]。脂連蛋白還在TNF-a的下游起作用，抑制其激活NF-kB路徑的能力[37]。脂連蛋白在體外抑制粒細胞-巨噬細胞克隆的形成，并抑制成熟巨噬細胞的吞噬細胞活性[38]。脂連蛋白在體內以數種寡聚體形式存在，最常見是三聚體、六聚體或低分子量(LMW)形式，以及同被看作高分子量(HMW)形式的雙六聚體(doublehexamers)和更高級結構。脂連蛋白的特定寡聚體與人類的重要代謝產物有關。HMW形式的循環(huán)脂連蛋白響應于體重的減少被選擇性提高[39，40]，而響應于胰島素輸注被選擇性降低[41]。這是特別有趣的，因為HMW形式的脂連蛋白與已知強烈受肥胖影響的生理過程相關結合在一起成為HMW復合體的脂連蛋白的比例與葡萄糖耐受的相關性好于總脂連蛋白水平與葡萄糖耐受的相關性[42]。用抗糖尿病藥物處理后，肝胰島素敏感性的改善與以HMW復合體存在的脂連蛋白的比例的相關性也好于與總脂連蛋白濃度的相關性[43]。與正常對照相比，患有冠狀動脈疾病的成年人體內HMW復合體占總脂連蛋白的百分比更低，而只有HMW形式才保護血管內皮細胞免于凋亡[39]。HMW復合體與抗動脈粥樣硬化的高密度脂蛋白(HDL)膽固醇的正相關性也好于總脂連蛋白，而三體形式與HDL負相關[40]。脂連蛋白寡聚體結構似乎在細胞內被組裝并分泌，在生理條件下復合體之間幾乎沒有自發(fā)交換[41,44]。事實上，Wang等[45]提示，不同的寡聚體形式是由于脂連蛋白基因編碼的特定氨基酸的羥基化和糖基化導致的。概要這里描述了用于治療嬰兒和兒童中肥胖癥和某些代謝疾病的或降低其風險的方法和組合物。所述方法涉及施用含有脂連蛋白(例如糖基化形式的脂連蛋白)的組合物。在某些實施方案中，脂連蛋白具有見于人乳中的脂連蛋白的氨基酸序列。在一些實施方案中，脂連蛋白具有見于人乳中的脂連蛋白的糖基化模式。人類月旨連蛋白前體蛋白(GenBankAccessionNo.NP_004788.1GI:4757760)具有如下的序列(前14個氨基酸或前17個氨基酸是前導序列，序列的其余部分是成熟蛋白的序列)。(SEQIDNO:l)成熟的脂連蛋白具有如下的氨基酸序歹ij:SAFSVGLETYVTIP畫PIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTN(SEQIDNO:2)或者如下的氨基酸序列GEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITV在一些情況下，可能期望施用SEQIDNO:l的多肽片段，它們包含脂連蛋白的所謂"球狀頭部"(globularhead)的一些或全部。例如，可以口服施用包含如下氨基酸(由它們構成或者基本上由它們構成)的組合物SEQIDNO:l(全長人類脂連蛋白)的84-244，85-244，86-244，87-244，88-244,89-244，90-244,91-244，92-244，93-244,94-244,95-244，96-244,97-244,98-244,99-244，100-244，101-244，102-244,103-244,104-244,105244，106-244，107-244,108-244，109-244，110-244或111-244。在其它情況下，可以口服施用包含SEQIDNO:l的多肽片段的組合物，所述多肽片段包含如下氨基酸的多肽片段，由如下氨基酸的多肽片段構成，或基本上由如下氨基酸的多肽片段構成SEQIDNO:l(全長人類脂連蛋白)的84-244，85-244，86-244,87-244,88-244,89-244,90-244,91-244，92-244，93-244,94-244,95-244，96-244，97-244，98-244，99-244，100-244,101-244,102-244，103-244104-244，105-244，106-244，107-244,108-244，109-244，110-244或111-244。在一些情況下，可以口服施用包含三聚體(3條多肽鏈的復合體)、六聚體(6條多肽鏈的復合體)、12聚體(12條多肽鏈的復合體)或18聚體(18條多肽鏈的復合體)的組合物。蛋白質中的數個賴氨酸殘基具有被糖基化的潛力(例如參照非成熟蛋白質編號的賴氨酸65、68、77和101)，數個脯氨酸殘基具有被羥基化的潛力。在一些情況下，含有脂連蛋白的有用組合物，相對于人乳中存在的一些或全部成分，是相對富含脂連蛋白的。例如脂連蛋白可以比人乳中的一種或多種蛋白質和脂肪(或者所有組分)豐富10%，20°/。，50%，70%，90%或者更多。這里描述了用于治療患者的肥胖或降低患者肥胖的風險的方法，包括口服施用含有純化的脂連蛋白或其片段的組合物；治療患者的代謝綜合征或降低患者的代謝綜合征風險的方法，包括口服施用含有純化的脂連蛋白或其片段的組合物；治療患者中選自下組的病癥的或降低患者中選自下組的病癥的風險的方法炎性腸病、高血糖、胰島素纟氐抗、與胰島素抵抗有關的代謝綜合征、2型糖尿病、代謝綜合征包括高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病(coronaryheartdisease)或缺血性心臟病，該方法包括口服施用含有純化的脂連蛋白或其片段的組合物；和治療或降低嬰兒壞死性小腸結腸炎(necrotizingenterocolitis)風險的方法，包括口服施用含有純化的脂連蛋白或其片段的組合物。在一些情況下，可以口服施用脂連蛋白或其片段用于降低體重(bodymass)、降低體重增加率、治療葡萄糖不耐受、治療胰島素抵抗、治療II型糖尿病、治療高脂血癥、治療高尿酸血癥、控制血糖、治療具有高空腹血糖的非糖尿病患者。在一些情況下，將脂連蛋白或其片段施用給正在接受胰島素或胰島素增敏劑(例如二曱雙胍)施用的患者。在各種實施方案中患者小于18歲；患者小于15歲；患者小于10歲；患者小于1歲；患者是早產嬰兒。在一些實例中，脂連蛋白或其片段被糖基化。在其他實例中，其被輕基化和糖基化。在各種實施方案中脂連蛋白或其片段的至少一個氨基酸被葡萄糖基半乳糖基(glucosylgalactosyl)殘基取代；脂連蛋白包含SEQIDNO:l,2或3的氨基酸序列，并且在賴氨酸殘基65、68、77和101之一者或多者處被糖基化。在其他實施方案中，脂連蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在一些實例中，含有SEQIDNO:2的多肽在賴氨酸殘基51、54和84之一者或多者處被糖基化。在一些實例中，脂連蛋白的形式是人乳中存在的形式，例如純化的脂連蛋白的糖基化與人乳中存在的糖基化一樣。在一些情況下，純化的脂連蛋白具有至少一個從下組選擇的模塊(moiety):葡萄糖基半乳糖基模塊、葡萄糖基葡萄糖基(glucosylglucosyl)模塊、半乳糖基葡萄糖基(galactosylglucosyl)模塊或者半乳糖基半乳糖基(galactosylgalactosyl)模塊。含有純化的脂連蛋白或其生物活性片段的組合物可以進一步包含人乳中存在的寡糖。在不同情況下，該組合物包括至少一種al，2-聯(lián)結的巖藻糖基化寡糖，或者至少一種從下組選擇的寡糖乳糖-N-巖藻戊糖I(lacto-N畫flicopenaoseI)[LNF-I]、2-巖藻糖基乳糖(2國focosyllactose)[2，-FL]、乳糖-N-二巖藻己糖I(lacto-N-difocohexaoseI)[LDFH-I]、乳糖二巖藻丁糖(lactodifbcotetraoseI)、專丄jf唐陽N陽巖藻-戊#唐II(lacto-N-fUco-penaoseII)[LNF-II]、3-巖藻糖基乳糖(3-fucosyllactose)[3-FL]、乳糖-N-巖藻戊糖III(lacto-N-fucopenaoseIII)[LNF-III]、乳糖-N-丁糖(lacto-N-tetraose)[LNT]和乳糖-N-新丁并唐(lacto-N-neotetraose)[LNneoT]。在一些情況下，純化的脂連蛋白或其片段經過修飾從而包含至少一個從下組選擇的基團乳糖-N-巖藻戊糖I;乳糖-N-巖藻戊糖II;3，-巖藻糖基乳糖；乳糖-N-巖藻戊糖II;乳糖-N-二巖藻己糖I;乳糖二巖藻丁糖；乳糖N-丁糖；乳糖N-新丁糖；3'-唾液酸基乳糖(3，-Sialyllactose);3，-唾液酸基乳糖胺(3，-Sialyllactosamine);6'-唾液酸基乳糖(6，-Sialyllactose);6，-唾液酸基乳糖胺(6'-Sialyllactosamine);唾液酸基乳糖-N-新丁糖c(Sialyllacto畫N-neotetraosec);單唾液酸基乳糖-N-己糖(Monosialyllacto-N-hexaose);二唾液酸基乳糖-N-己糖I(Disialyllacto畫N-hexaoseI);單唾液酸基乳糖畫N-新己糖I(Monosialyllacto-N-neohexaoseI);單唾液酸基乳糖誦N畫新己糖II(Monosialyllacto隱N-neohexaoseII);二液酉交基孕L4唐-N-殺斤己斗唐(Disialyllacto-N-neohexaose);二唾液酸基乳沖唐-N-丁沖唐(Disialyllacto-N-tetraose);二唾液酸基乳4唐-N畫己糖II(Disialyllacto-N-hexaoseII);唾液酸基乳糖-N-丁糖a(Sialyllacto-N-tetraosea);二唾液酸基乳糖-N隱己糖I(Disialyllacto-N-hexaoseI);唾液酸基乳糖-N-丁糖b(Sialyllacto-N-tetraoseb);3，-唾液酸基-3-巖藻糖基乳糖(3，-Sialyl-3-flicosyllactose);二唾液酸單巖藻糖基乳糖-N-新己糖(Disialomonofucosyllacto-N-neohexaose);單巖藻糖基單唾液酸基乳糖-N-辛糖(Monofucosylmonosialyllacto隱N-octaose)(sialylLea);唾液酸基乳糖-N-巖藻己糖II(Sialyllacto-N-flicohexaoseII);二唾液酸基乳糖-N-巖藻戊糖II(Disialyllacto-N-fUcopentaoseII);和單巖藻糖二唾液酸基乳糖-N-丁糖(Monofucosyldisialyllacto-N-tetraose)。在一些情況下，純化的脂連蛋白或其生物活性片段具有至少一個從下組選擇的模塊葡萄糖基半乳糖基模塊、葡萄糖基葡萄糖基模塊、半乳糖基葡萄糖基模塊或者半乳糖基半乳糖基模塊。在不同情況下，口服施用脂連蛋白或其生物活性片段從而獲得10嗎/ml-100嗎/ml;10(ig/ml-75(xg/ml;20|iig/ml-60嗎/ml;或1|ig/ml-100嗎/ml的血漿濃度。在本文中所述方法的各個方面中，施用脂連蛋白從而使脂連蛋白的血漿濃度達到10嗎/ml-100iug/ml;施用脂連蛋白從而使脂連蛋白的血漿濃度達到10|xg/ml-75|xg/ml;施用脂連蛋白從而使脂連蛋白的血漿濃度達到20嗎/ml-60|ug/ml;施用脂連蛋白從而使脂連蛋白的血漿濃度達到1嗎/ml-100嗎/ml。還描述了包含純化的脂連蛋白的營養(yǎng)補劑(supplement)和包含純化的脂連蛋白的嬰兒配方食品(infantformula)。如這里使用的，"純化蛋白質"(例如純化的脂連蛋白)是指和其他與之天然伴隨的蛋白質、脂肪或核酸相分離的蛋白質。該蛋白質可以占純化制品干重的至少10,20,5070，80或95%。本發(fā)明一個或多個實施方案的細節(jié)在下面的附圖和說明中給出。從描述和附圖以及從權利要求可以顯見本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點。附圖描述圖1描述了乳脂連蛋白和瘦蛋白(leptin)濃度的比較，以及(小圖)乳瘦蛋白在來自RHMB-即時組(adhoccohort)的30個橫斷性(cross-sectional)乳樣品中的分布。四分位間距由方框限定；中值用水平線表示。須狀線(whiskers)代表分布的第九十五百分位和第五百分位。中值間的差異p<0.0001，用Wilcoxon符號秩次檢驗。圖2描述了乳脂連蛋白與哺乳持續(xù)時間之間的關系。實線是從哺乳月份和ln(乳脂連蛋白)的重復測量分析確定的預測回歸線卩±SE:-0.059±0.007。來自兩個個體中的總共3個數據點沒有示出，它們的乳脂連蛋白濃度為45-60ng/mL。圖3描述了乳脂連蛋白與種族之間的關系。乳汁樣品來自于Cincinnati地區(qū)婦女中處于大約1月哺乳期的37個墨西哥人和19個非西班牙裔白人。四分位間距由方框限定；中值用水平線表示。須狀線代表分布的第九十五百分位和第五百分位。中值間的差異p=0.003,用Wilcoxon符號秩次檢驗。圖4描述了乳脂連蛋白濃度與母親BMI之間的關系。實線是從母親BMI和ln(乳脂連蛋白)的重復測量分析確定的預測回歸線，排除了兩位乳脂連蛋白濃度高于50ng/mL的婦女0=14縱向性(longitudinal)樣品)(p士SE:0.08±0.02)。虛線是包含了這些離群者的預測回歸線((3士SE:0.10±0.02)。來自兩個個體的總共3個數據點沒有示出，它們的乳脂連蛋白濃度為45-60ng/mL。圖5描述了乳脂連蛋白濃度與嬰兒體重之間的關系。圖6描述了脂連蛋白暴露與嬰兒生長速度之間的關系。圖7描述了在數天內小鼠乳汁中脂連蛋白的水平。圖8描述了在數天內喂養(yǎng)小鼠體內脂連蛋白的血清水平。圖9描述了在口^^施用人脂連蛋白的小鼠的管腔液(luminalfluids)、腸和血清中的人脂連蛋白水平。詳細說明下文描述的研究證明，脂連蛋白存在于人乳中，其濃度與哺乳持續(xù)時間、種族和母親肥胖傾向有關。人乳中存在脂連蛋白以及用乳喂養(yǎng)的孩子比用嬰兒配方食品喂養(yǎng)的孩子更痩的事實提示，脂連蛋白可用于治療嬰兒肥胖癥或降低肥胖癥的風險，并且可用于治療其他代謝疾病或降低其風險。實施例1乳汁樣品我們對來自兩個截然不同的婦女群體的人乳汁樣品進行了分析l)辛辛那提兒童研究人乳汁庫(CincinnatiChildren'sResearchHumanMilkBank,RHMB)(俄亥俄州辛辛那提市)的提供者，和2)墨西哥市由NICHD基因資助的題目為"人乳在嬰兒營養(yǎng)和健康中的作用，，("TheRoleofHumanMilkinInfantNutritionandHealth")(P01HD13021;PI:Morrow)的參與者。選擇這兩個群體是因為可以用統(tǒng)一的收集程序獲得乳汁樣品。辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學中心的機構審查委員會(IRB)批準了這兩個研究的試驗方案和知情同意書(consentform),并且墨西哥市醫(yī)學科學與營養(yǎng)國家研究所的IRB也批準了墨西哥群體的試驗方案。辛辛那提兒童研究人乳庫(RHMB)是一個儲藏庫，其中任何哺乳期婦女均可自愿捐獻乳汁，可以一次捐獻(RHMB-即時組)或者在整個哺乳期間規(guī)則地捐獻("辛辛那提母乳喂養(yǎng)組"或RHMB-縱向)[46]。對于RHMB-即時組，在捐獻時收集如下信息分娩時嬰兒的孕齡，擠乳時哺乳的天數，捐獻體積，以及乳汁是新鮮地還是冷凍后帶到保存庫捐獻的。然而，當母親提供的是擠出的乳汁，這種收集是非標準化的。從RHMB-即時組隨機選擇了30個來自提供者母親的橫斷性(Cross-sectional)乳汁樣品用于本分析。對于希望參與縱向捐獻方案(RHMB-縱向)的婦女，則需要更復雜的程序。要成為縱向提供者，母親必須在分娩后1周內提供同意書，所有嬰兒必須是足月(至少懷孕37周)、單胎妊娠的嬰兒，沒有任何先天或醫(yī)學上的并發(fā)癥。母親必須負責母乳喂養(yǎng)(至少部分地母乳喂養(yǎng))至少6個月，會說英語，并且住在醫(yī)學中心25英里半徑范圍內。所有種族和民族的婦女均可。RHMB-縱向中的乳汁收集遵循標準化程序(見下文乳汁收集)。RHMB-縱向組中的母親必須在哺乳7個月之前捐獻至少7個樣品方可能選擇參與本分析。本研究包括來自22位母親的總共199個乳汁樣品。在第一次訪問時，研究護士進行一個內容廣泛的、基于問巻調查的訪談。在這個訪談中收集的數據包括人口特征、生育史、先前哺乳經驗、母親和嬰兒出生以來的一般健康狀況、以及藥物和環(huán)境暴露。在隨后的訪問中，進行內容有所縮減的問巻調查，以獲得關于用藥和健康狀況等的最新情況。在每次家庭訪問期間用經過規(guī)則校準的可攜式天平獲得母親人體測量結果(maternalanthropomorphicmeasurement)。墨西哥人乳研究組(MexicanHumanMilkstudycohort)是辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學中心與墨西哥市醫(yī)學科學與營養(yǎng)國家研究所(NationalInstituteofMedicalSciencesandNutrition)的合作項目。如果母親的嬰兒健康、足月生產，沒有先天畸形，并且如果母親有意母乳喂養(yǎng)，則將其納入本研究中。朋輩輔導者(peercounselor)對母親3次進行訪問以支持其完全母乳喂養(yǎng)。母親在第一個月每周提供一次乳樣品，然后在哺乳期間每月提供一次。未收集關于母親身高或體重或者嬰兒出生時胎齡的數據。在墨西哥組中，從在大約1個月哺乳期時捐獻了乳樣品的受試者中隨機選擇了37位母親。表l中描述了3個人群中全部被選參與者的特征。表1.研究組的描述研究人乳庫(RHMB)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*所有嬰兒均是足月的。乳汁收集對于RHMB-即時組，乳汁收集涉及母親將其乳樣品送至位于辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學中心的RHMB。對于RHMB-縱向和墨西哥母乳喂養(yǎng)組，乳汁收集在哺乳期間研究護士訪問其家中時進行。乳汁收集涉及用標準電泵擠干整個乳房。每個組的研究護士在10:00am和1:00pm之間收集乳汁。將收集的乳汁保存在冰上，用于運輸到當地研究所，在那里將乳汁分成等分，并在-80。C冷凍。母親人體測量僅在RHMB-縱向人群中，由單個經過訓練的研究護士對母親進行人體測量(B.S.D,)。每月訪問時用E-ZCarry便攜式數字天平(HopkinsMedicalProducts,Baltimore,MD)測量母親的體重。婦女纟皮測量時穿著適于上雄f的服裝，不穿鞋子。身高在初次訪問時測量，受試者站立，穿短襪，腳跟并攏，腳趾分開45度角，頭處于眼耳平面。身高標記在墻上，測量與地面的垂直距離。體重系數(BMI)用身高m的平方除以體重kg(kg/m2)。脂連蛋白和瘦蛋白測定因為脂肪會干擾放射性免疫測定(RIA),所以使用脫脂乳，并且由相同的個人(W.B.)測定來自3個組的全部樣品。將乳樣品解凍并渦旋。脫脂乳(水相)通過離心(l,500Tg,20min,4。C)加以制備，之后除去脂肪層。免疫反應性的脂連蛋白用商業(yè)RIA試劑盒(LincoResearch,St.Charles,MO)用1001:3稀釋的脫脂乳(相當于33.3pL)重復測量2次。測定間和測定內的變異系數分別為8.5%和3.9%。在RHMB-即時樣品中，同樣用商業(yè)RIA試劑盒(LincoResearch,St.Charles,MO)按照Houseknecht及其同事的方案重復測量2次[47]。測定間和測定內CV分別為4.5%和5.0%,檢測限為0.3ng/mL。脂連蛋白的測定方法用標準品加以確證，脫脂乳樣品加入5、20和100ng/mL人脂連蛋白標準品，用于確定所添加質量的回收。統(tǒng)計分析統(tǒng)計分析用SAS9丄3.版本執(zhí)行。由于數據的非正態(tài)性，所以描述性統(tǒng)計數據以中值和范圍的形式報告。為了提高乳脂連蛋白的正態(tài)性以用于統(tǒng)計模型，將數據轉換成自然對數(ln)。有8個乳瘦蛋白濃度低于檢測極限(0.3ng/mL)，將這些數值設定為0.2ng/mL。另外還在將低于檢測極限的數值設定為O的條件下進行了分析，然而結果沒有大幅改變，因此沒有報告。為了檢查哺乳期對ln(乳脂連蛋白)濃度的影響，我們使用了RHMB即時和縱向數據。在橫斷性分析(cross-sectionalanalysis)中，用ln(乳脂連蛋白)作為因變量構建線性回歸模型。在縱向性分析中，構建重復測量的混合模型，其中對每個提供者的截距隨機進行處理。用基于該數據獲得的貝葉斯信息標準(BIC)選擇最佳相關性結構(在本實例中，跨越不同的時間點獲得ln(乳脂連蛋白)間的相等相關性)。因變量是ln(乳脂連蛋白)，自變量是哺乳天數。為了確定種族對乳脂連蛋白濃度的影響，用Wilcoxon秩和檢驗比較了在大約1個月哺乳期時RHMB-縱向組中的非西班牙裔白人(范圍26-42天)與墨西哥組中的西班牙裔人(范圍31-40天)的中值乳脂連蛋白。為了確定母親肥胖對乳脂連蛋白濃度的影響，對RHMB-縱向人群的母親BMI進行了橫斷性和縱向性的檢驗。在橫斷性分析中，將ln(乳脂連蛋白)針對每個時間點的母親BMI進行回歸。在縱向性分析中，以母親BMI混合模型程序的重復測量結果為影響因素對ln(乳脂連蛋白)的重復測量結果進行建模。對人乳脂連蛋白測定的檢驗脫脂乳系列稀釋物的脂連蛋白濃度與標準曲線平行。向脫脂乳樣品中摻入5、20和100ng/mL人脂連蛋白標準品，所添加質量的回收率平均為109%。人乳中的脂連蛋白和瘦蛋白所有樣品的脫脂乳中均檢出了免疫活性脂連蛋白(表2)。乳脂連蛋白濃度與胎齡無關(p20.18)。表2.人乳脂連蛋白和瘦蛋白濃度研究人乳庫(RHMB)即時縱向墨西哥乳脂連蛋白濃度,ng/mL中值(范圍)16.6(6.9,80.4)17.7(4.2,87.9)11.7(6.2,39.8)乳瘦蛋白濃度，ng/mL中值(范圍)0.4(ND,2.2)N/AN/A在RHMB-即時樣品中，對乳中的瘦蛋白和脂連蛋白濃度均進行了測試(圖1)。中值脂連蛋白濃度比瘦蛋白濃度大超過40倍(分別為16.6對0.4ng/ml，由Wilcoxon秩和檢驗得pO.OOOl)。乳脂連蛋白和乳瘦蛋白的濃度^皮此正相關(Spearmanr=0.37,p=0.046)。乳中脂連蛋白的濃度比血清中低得多。在新生兒中，血清脂連蛋白濃度據報道的范圍是20-60ug/mL[48，49]，而我們發(fā)現乳脂連蛋白濃度的范圍是4.2-87.9ng/mL。然而，乳脂連蛋白濃度與腸系膜脂肪組織表達的脂連蛋白mRNA的濃度一致[50]，可能提示局部作用。瘦蛋白是另外的唯——種已在人乳中測量的脂肪細胞因子(adipokine)([47，51-53]。在本研究的RHMB-即時樣品中，乳瘦蛋白濃度比脂連蛋白低40倍。本研究中測得的乳中瘦蛋白濃度比其他研究中報道的瘦蛋白略低[20，47，51]。濃度較低可能是由于本研究中檢查的哺乳期更長。脂連蛋白在整個哺乳期內降低在RHMB-即時樣品中(n=30)，哺乳期的月數與ln(乳脂連蛋白)負相關，(3=-0.059±0.024,p=0.02。這些結果在RHMB-縱向樣品中得到了確認，RHMB-縱向樣品中哺乳期的月數也與ln(乳脂連蛋白)負相關。p=-0.059士0.007,p〈0.0001(圖2)。根據這些結果，預期到哺乳7個月時為止，與哺乳l周相比，乳脂連蛋白會降低6.9ng/mL。乳脂連蛋白濃度在整個哺乳期降低。與此一致的是，先前的研究記載多種乳蛋白在整個哺乳期降低[15-17]。我們還檢查了種族對脂連蛋白濃度的影響。在哺乳一個月時，墨西哥血統(tǒng)的西班牙裔母親的乳脂連蛋白濃度顯著低于非西班牙裔白人提供者的乳脂連蛋白濃度。這些差異最有可能有其生理基礎，因為非西班牙裔白人和西班牙裔人的乳樣品是在相同的哺乳期內用相同的方案收集，并且由相同的個人進行測定的，因此采樣和測定的誤差已被最小化。而且，乳中脂連蛋白濃度的種族差異與血清中的脂連蛋白濃度平行。多個研究證實，白人的血清脂連蛋白濃度高于亞洲人[54，55]、美國印第安人[29]和非洲裔美國人[56]。盡管沒有直接比較非西班牙裔白人和西班牙裔人之間的血清脂連蛋白濃度，但是墨西哥人群被認為主要是美國印第安人和白人群體的組合[57]。因此可以預期，墨西哥人乳中會發(fā)現較低的脂連蛋白濃度。人乳脂連蛋白與妊娠后母親體重有關在RHMB-縱向組中，橫斷性地來看，在大多數時間點上妊娠后母親的BMI與ln(乳脂連蛋白)顯著地正相關(表3)。即使在沒有達到統(tǒng)計學顯著性時，相關性的大小在哺乳的1-7個月也是相對恒定的((3(范圍)=0.08-0.13,p(范圍)二0.01-0.16)。表3.母親BMI關于ln(乳脂連蛋白)濃度的回歸的橫斷性p系數哺乳月份N11-平方(％)P土SEp-值12221.00.09±0.040.0322216.10.08±0.040.0632120.40.08±0.040.0442026.20.10±0.040.0252029.20.11±0.040.0161529.20.13±0.060.0471416.00.10±0.070.16在縱向分析中(圖4)，母親妊娠后BMI與ln(乳脂連蛋白)顯著相關(p=0.10±0.02，p<0.0001)。當排除大于50ng/mL的離群乳脂連蛋白濃度時(排除來自2位個人的14個縱向數值)，這種關系仍然高度顯著(^=0.08±0.02，p<0.0001)。與血清中的脂連蛋白濃度相對一一肥胖與血清中的脂連蛋白濃度負相關[58]—一我們發(fā)現乳中脂連蛋白濃度與母親的肥胖正相關。對于這一發(fā)現的一個可能的解釋是脂連蛋白、催乳激素與肥胖之間的關系。脂連蛋白受到催乳激素的負調節(jié)[59,60]，而催乳激素是哺乳期婦女乳腺發(fā)育的主要確定因素。催乳激素的分泌在肥胖癥中減弱[61,62]。因此，體重大的母親體內催乳激素負調節(jié)的降低，可能對乳腺組織局部產生的脂連蛋白濃度及其分泌向人乳中的分泌產生正向影響。先前的研究證實，乳的成分并不經常在胃中降解，這一方面是因為人乳的組合物為蛋白質形成一個保護性環(huán)境[63]，一方面是因為嬰兒胃的酸度減弱[64]以及胃蛋白質水解有限[65]。確實，口服施用的胰島素并不被降解，因此能夠刺激腸道成熟[63，66，67]。因為脂連蛋白已經被證實可提高胰島素敏感性[68,69],所以它也可能增強胰島素在嬰兒腸道中的作用。脂連蛋白還可能直接影響嬰兒腸道，因為先前的研究已經證實，脂連蛋白受體1在胎兒小腸內表達[70]。人乳中的脂連蛋白與嬰兒體重相關利用上述來自CBC的22個組縱向性樣品，探索了人乳中脂連蛋白與嬰兒體重之間的縱向性關系。在考慮了數據的相關性結構和重復測量之后，乳中脂連蛋白濃度與嬰兒在最多28周內的體重增加負相關(卩±SE:-0.20±0.12kg，p=0.082)，并就嬰兒的年齡和年齡進行了調整。盡管這個關系在統(tǒng)計上并不顯著，但是我們的樣本量太小，無法檢測到這種效果。這一關系在圖5中顯示，其中以乳脂連蛋白的自然對數對就年齡調整過的嬰兒體重的殘差(residual)作圖。為了進一步檢查乳脂連蛋白與嬰兒生長之間的關系，從包含306個墨西哥母親-嬰兒對的組中隨機選出36個在產后1個月時收集的樣品。盡管墨西哥和美國母親之間總乳脂連蛋白水平存在差異，產后1個月時的乳脂連蛋白的自然對數與產后1個月和4個月時嬰兒肥胖之間的相關性的大小在墨西哥和辛辛那提人群中是相似的(表4)。表4:ln(乳脂聯(lián)素)與產后1個月的生長狀態(tài)之間的相關'性(*=口<0.10)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>對11個具有完整數據的母親-嬰兒對的乳脂連蛋白暴露量(metric)的分析顯示，嬰兒在產后24周對乳脂連蛋白的累積暴露量范圍是123.2-220.5ng/ml。該暴露度量(已除以25以獲得更有臨床意義的解釋)與嬰兒在出生到24周之間的生長速度負相關(生長速度/24周[kg^5.76-0.28[APN暴露],p=0.06，圖6)。因此，我們的數據提示，人乳中脂連蛋白在生命的前6個月用乳喂養(yǎng)的嬰兒中與較低的體重相關，而與年齡無關。這些發(fā)現對為什么母乳喂養(yǎng)的嬰兒通常比用嬰兒配方食品喂養(yǎng)的嬰兒更瘦提供了有趣的可能解釋。乳鼠中血清脂連蛋白水平與小鼠乳中的脂連蛋白水平相關對哺乳期間小鼠乳中脂連蛋白的自然水平進行了測量。發(fā)現脂連蛋白水平在哺乳的早期最高，在哺乳的晚期最低(圖7)。如果乳中的脂連蛋白被吸收進入血清，則乳鼠血清中的水平應當受到所進食的乳中脂連蛋白水平的差異的影響。對來自乳鼠的血清進行分析，檢測脂連蛋白水平，發(fā)現血清脂連蛋白在哺乳的最初幾天里最高，而在哺乳的晚期最低(圖8)。這些數據與乳脂連蛋白是哺乳期哺乳動物血清脂連蛋白的來源是一致的?？诜┯玫闹B蛋白可以被吸收到血清中為了測量脂連蛋白跨越幼小哺乳動物的腸黏膜并被吸收進入血清中的能力，將功能性重組人脂連蛋白(在哺乳動物細胞中表達)經口施用到小鼠幼崽的胃中。給予鹽水作為對照。用人脂連蛋白特異的ELISA測定系統(tǒng)測量管腔液(luminalfluid)、腸和血清中的人脂連蛋白。如圖9所示，口服施用人脂連蛋白的小鼠的腸腔液所含人脂連蛋白的水平與所服人脂連蛋白的量成比例。如圖9所示，給予最高量人脂連蛋白的小鼠在腸腔中具有最高水平的人脂連蛋白，而僅口服施用鹽溶液的在腸腔中沒有人脂連蛋白。由此可見，口服施用可成功地在腸內產生完整的脂連蛋白。人脂連蛋白被轉運進入腸組織，而同樣地，給予最高量脂連蛋白的小鼠在其腸內組織中具有最高的水平。而且，施加到腸內的人脂連蛋白被吸收進入血清。如圖9所示，給予最高量人脂連蛋白的小鼠顯示最高的血清脂連蛋白水平。由此可見，人脂連蛋白在幼小哺乳動物中能夠從腸被吸收進入血清，并且被吸收的脂連蛋白可以解釋乳脂連蛋白水平與乳兒中生理后果之間的關系。含有脂連蛋白的組合物脂連蛋白可以在含有藥物可接受的載體的組合物中施用，藥物可接受的載體例如磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇水混合物、水和乳狀液如油/水或水/油乳狀液，以及各種潤濕劑或賦形劑。脂連蛋白可以和在施用給患者時不產生不良作用、過敏反應或者其它不希望的反應的材料組合。所用的載體或介質可以包括溶劑、分散劑、包衣(coatings)、吸收促進劑、控釋劑和一種或多種惰性賦形劑(其包括淀粉、多羥基化合物、?；瘎?、微晶纖維素、稀釋劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等)等。如果期望，可以通過標準水成或非水成技術對本公開組合物的片劑進行包衣。脂連蛋白可以口服施用給藥，例如作為藥片、藥丸、凝膠、糊劑、糖漿、大丸藥、干藥糖劑、漿劑、膠嚢、粉末、顆粒；作為水性液體或非水性液體中的溶液或懸液；作為水包油乳狀液或油包水乳狀液，或者以一些其他的形式?？诜┯媒o藥的組合物可以包含粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑、調味劑和潤濕劑。口服施用給藥的制劑例如藥片可以任意地被包衣或刻痕(scored)，并可以制劑化從而使其中活性成分穩(wěn)定、延時或可控地釋放。脂連蛋白還可以通過直腸栓劑、噴霧管、鼻飼管、直接注入到GI道或胃或者腸胃外加以給藥。含有脂連蛋白的藥物組合物還可以包括治療劑，例如抗病毒劑、抗生素、益生菌、止痛劑和抗炎劑。合適的劑量可以由本領域的普通技術人員根據患者的免疫狀況、體重和年齡等因素來加以確定。在一些情況下，劑量的濃度可以和人乳中存在的脂連蛋白濃度相似。脂連蛋白還可以添加到其他組合物中。例如，可以將它添加到嬰兒配方食品或營養(yǎng)組合物或乳增強劑(例如人乳增強劑，例如Enfamil)中。脂連蛋白可以包含在含有常量營養(yǎng)物(例如食用脂肪、碳水化合物和蛋白質)的組合物中。食用脂肪包括例如椰子油、豆油和甘油單酸酯和甘油二酯。碳水化合物包括例如葡萄糖、食用乳糖、和水解玉米淀粉。蛋白質源包括例如，蛋白質源可以是例如，大豆蛋白、乳清和脫脂乳。含有寡糖劑的組合物，包括營養(yǎng)組合物，也可以包括維生素和礦物質(例如4丐、磷、鉀、鈉、氯、鎂、錳、鐵、銅、鋅、硒、石典、維生素A、E、D、C和B復合物)。已經對本發(fā)明的大量實施方案進行了說明。然而，應當理解，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下可以進行各種修改。因此，其他的實施方案也包含在權利要求的范圍內。參考文獻1.Gartner,L.M.，etal.,Breastfeedingandtheuseofhumanmilk.Pediatrics,2005.115(2):p.496-506.2.Walker,W.A.，Thedynamiceffectsofbreastfeedingonintestinaldevelopmentandhostdefense.AdvExpMedBiol，2004.554:p.155-70.3.Newburg，D.S.，Innateimmunityandhumanmilk.JNutr，2005.135(5):p.1308-12.4.Heird,^NV.C.andA.Lapillonne,Theroleofessentialfattyacidsindevelopment.AmiuRevNutr,2005.25:p.549-71.5.Jensen,C丄.，etal.,Effectsofmaternaldocosahexaenoicacidintakeonvisualfbnctionandneurodevelopmentinbreastfedterminfants.AmJClinNutr,2005.82(1):p.125-32.6.Khe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I[LNF-III]、乳糖-N-丁糖[LNT]和乳糖-N-新丁糖[LNneoT]。19.權利要求1-4中任一項的方法，其中純化的脂連蛋白經過修飾而包含至少一個從下組選擇的基團乳糖-N-巖藻戊糖I;乳糖-N-巖藻戊糖II;3，-巖藻糖基乳糖；乳糖-N-巖藻戊糖II;乳糖-N-二巖藻己糖I;乳糖二巖藻丁糖；乳糖N-丁糖；乳糖N-新丁糖；3，-唾液酸基乳糖；3，-唾液酸基乳糖胺；6，-唾液酸基乳糖；6，-唾液酸基乳糖胺；唾液酸基乳糖-N-新丁糖c;單唾液酸基乳糖-N-己糖；二唾液酸基乳糖-N-己糖I;單唾液酸基乳糖-N-新己糖I;單唾液酸基乳糖-N-新己糖II;二唾液酸基乳糖-N-新己糖；二唾液酸基乳糖-N-丁糖；二唾液酸基乳糖-N-己糖II;唾液酸基乳糖-N-丁糖a;二唾液酸基乳糖-N-己糖I;唾液酸基乳糖-N-丁糖b;3，-唾液酸基-3-巖藻糖基乳糖；二唾液酸單巖藻糖基乳糖-N-新己糖；單巖藻糖基單唾液酸基乳糖-N-辛糖(唾液酸基Lea);唾液酸基乳糖-N-巖藻己糖II;二唾液酸基乳糖-N-巖藻戊糖II;和單巖藻糖二唾液酸基乳糖-N-丁糖。20.權利要求1-4中任一項的方法，其中純化的脂連蛋白具有至少一個從下面選擇的模塊葡萄糖基半乳糖基模塊、葡萄糖基葡萄糖基模塊、半乳糖基葡萄糖基模塊或者半乳糖基半乳糖基模塊。21.權利要求1-4中任一項的方法，其中施用脂連蛋白使得脂連蛋白的血漿濃度達到10嗎/ml-100jig/ml。22.權利要求1-4中任一項的方法，其中施用脂連蛋白使得脂連蛋白的血漿濃度達到10(ig/ml-75嗎/ml。23.權利要求1-4中任一項的方法，其中施用脂連蛋白使得脂連蛋白的血漿濃度達到20嗎/ml-60pg/ml。24.權利要求1-4中任一項的方法，其中施用脂連蛋白使得脂連蛋白的血漿濃度達到1昭/ml-100嗎/ml。25.前述權利要求中任一項的方法，其中脂連蛋白是寡聚體的形式，所述寡聚體包括至少兩個成熟脂連蛋白亞單位。26.權利要求1-21中任一項的方法，其中脂連蛋白是三聚體的形式。27.權利要求1-21中任一項的方法，其中脂連蛋白是六聚體的形式。28.權利要求1-21中任一項的方法，其中脂連蛋白是含有至少6個亞單位的寡聚體的形式。29.權利要求1-21中任一項的方法，其中脂連蛋白是含有至少12個亞單位的寡聚體的形式。30.—種含有純化的脂連蛋白的營養(yǎng)補劑。31.—種含有純化的脂連蛋白的嬰兒配方食品。全文摘要本文描述了通過口服脂連蛋白或其生物活性片段治療各種疾病的方法。文檔編號C07K14/00GK101415461SQ200780008310公開日2009年4月22日申請日期2007年1月9日優(yōu)先權日2006年1月9日發(fā)明者戴維·S·紐伯格,莉薩·J·馬丁,阿迪思·L·莫羅申請人:兒童醫(yī)院醫(yī)療中心