專(zhuān)利名稱(chēng)：用于b細(xì)胞淋巴瘤治療的針對(duì)cd20的單克隆抗體的生產(chǎn)方法
用于B細(xì)胞淋巴瘤治療的 針對(duì)CD20的單克隆抗體的生產(chǎn)方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)可溶形式的抗體的重組方法，所述抗體結(jié)合 CD20，用于治療患有復(fù)發(fā)的或難治的、低級(jí)的或?yàn)V泡的、CD20陽(yáng)性B 細(xì)胞非何杰金淋巴瘤(NHL )的患者。所述治療將包括免疫活性抗CD20 抗體；或放射性標(biāo)記的抗CD20抗體和/或協(xié)同策略的使用，所述協(xié)同 策略中標(biāo)記和非標(biāo)記抗體將用于NHL治療。該方法描述了編碼抗 -CD20的核酸序列的從頭合成、構(gòu)建的核酸序列向感受態(tài)細(xì)菌中的轉(zhuǎn) 化、以及構(gòu)建的核酸序列向哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的亞克隆，以表達(dá)期 望的蛋白質(zhì)。包含與感興趣的基因相連的控制元件的DNA構(gòu)建體已被 公開(kāi)。感興趣的核酸序列已經(jīng)密碼子優(yōu)化，以允許在適合的哺乳動(dòng)物 宿主細(xì)胞中表達(dá)。發(fā)明背景抗體已經(jīng)被公認(rèn)為是以高度的特異性和親和性來(lái)識(shí)別并靶向幾乎 任何分子的有力工具。單克隆抗體(mAbs)已經(jīng)被用作體外診斷劑， 因而容i午用于RIA、 ELISA免疫細(xì)J包病理法和流式細(xì)I包術(shù)的試劑的世 界性標(biāo)準(zhǔn)化。單克隆抗體也已經(jīng)廣泛地用于腫瘤抗原的體內(nèi)定位以及 癌癥的免疫治療。這種難題已經(jīng)通過(guò)兩種基本類(lèi)型的抗體的開(kāi)發(fā)來(lái)解決。第一種類(lèi) 型，稱(chēng)為嵌合抗體，其中僅鼠恒定結(jié)構(gòu)域被人源的等效結(jié)構(gòu)域替換 (Morrison et al,P.N.A.S., 1984， 81, 6851-6855; Boulianne et al, Nature, 1985, 314, 268-270;和Neuberger et al, Nature, 1985, 314, 268-270)。 第二種類(lèi)型是其中鼠恒定結(jié)構(gòu)域和鼠框架區(qū)都被人源的等效結(jié)構(gòu)域和 區(qū)域替換。該第二種抗體被稱(chēng)為人源化的或CDR移植抗體(Jones et al, Nature, 1986, 321， 522-525;和Riechmann et al， Nature, 1988, 332, 323-327)。例如，對(duì)于治療用途，人IgGl和大鼠IgG2b是當(dāng)前偏愛(ài)的 同種型。進(jìn)一步地，在人IgG同種型中，IgGl和IgG3似乎對(duì)于補(bǔ)體和 細(xì)胞介導(dǎo)的裂解最有效，因而用于殺死腫瘤細(xì)胞。人抗體無(wú)需"人源化，，，然而分泌人抗體的細(xì)胞系是非常不穩(wěn)定的， 一般-皮證明不適合大 規(guī)模生產(chǎn)。為了產(chǎn)生足夠量的抗體用于完全的臨床使用，期望的是采用有效 的重組表達(dá)系統(tǒng)。由于骨髓瘤細(xì)胞代表了專(zhuān)用于抗體生產(chǎn)和分泌的天 然宿主，來(lái)自骨髓瘤細(xì)月包的細(xì)胞系已經(jīng);故用于重組抗體的表達(dá)。通常， 需要基于免疫球蛋白基因調(diào)節(jié)元件的復(fù)雜載體設(shè)計(jì)，并且高度可變的最終表達(dá)水平已被報(bào)道(Winter etal, Nature, 1988, 332, 323-327; Weidleetal, Gene， 1987， 60, 205-216; Nakatani et al, Bio/Technology, 1989, 7, 805-810;和Gillies et al, Bio/Technology, 1989， 7, 799-804)?？蛇x擇的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)是通過(guò)使用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞提 供的那些。使用這些細(xì)胞容許幾種治療蛋白的大量產(chǎn)生，用于研究和 臨床使用(Kaufman et al， Mol.Cell.Biol， 1985, 5, 1750-1759;和 Zettlmeissl et al, Bio/Technology, 1987, 5, 720-725 )。然而，《艮少情 況下使用這些細(xì)胞用于抗體的表達(dá)，迄今為止報(bào)道的鼠抗體表達(dá)水平 是很低的,約0.01-0.1 mu.g/ml (Weidleetal, Gene, 1987， 51, 21-29; 和Feysetal, Int.J.Cancer， 1988, 2, 26-27)?？笴D20抗體特異性地結(jié)合抗原CD20 (人B淋巴細(xì)胞限制的分化 抗原，Bp35),為具有約35 kD分子量位于前B淋巴細(xì)胞和成熟B淋 巴細(xì)月包上的疏水性5爭(zhēng)膜蛋白。該抗原還在〉90%的B細(xì)l包非何杰金'淋巴 瘤(NHL)上表達(dá)，但未在造血干細(xì)胞、原B細(xì)胞、正常血漿細(xì)胞或 其他正常組織上發(fā)現(xiàn)。CD20調(diào)節(jié)細(xì)胞周期起始和分化的活化過(guò)程中的 早期步驟，并且可能作為鈣離子通道起作用。CD20不從細(xì)胞表面脫落， 在抗體結(jié)合時(shí)不一皮內(nèi)在化。游離CD20抗原未在循環(huán)中發(fā)現(xiàn)?？笴D20 抗體通過(guò)征募身體的天然防雄卩來(lái)攻擊和殺死其經(jīng)由CD20抗原而結(jié)合 的B細(xì)胞來(lái)起作用。宿主細(xì)胞殺傷通過(guò)兩種機(jī)制發(fā)生1 )補(bǔ)體依賴(lài)性 細(xì)胞毒性(CDC )途徑和2 )抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC ) 途徑?？笴D20抗體是遺傳工程化的嵌合鼠/人單克隆抗體。該抗體是含 有鼠的輕鏈和重鏈可變區(qū)序列以及人恒定區(qū)序列的IgGl k免疫球蛋 白?？笴D20抗體由兩條451個(gè)氨基酸的重4連和兩條213個(gè)氨基酸的輕 鏈(#4居cDNA分析)組成，具有約145 kD的分子量?？笴D20抗體 對(duì)CD20抗原有大約8.0 nM的結(jié)合親合性。嵌合的抗CD20抗體通過(guò)含有抗生素慶大霉素的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生?？笴D20抗體通過(guò)親和層析和離子交換層析來(lái)純化。 本發(fā)明涉及可結(jié)合CD20的抗體的構(gòu)建、克隆、表達(dá)、純化和生產(chǎn)。 該抗體將是靶向治療劑，指明用于治療患有復(fù)發(fā)的或難治的、低級(jí)的 或?yàn)V泡的、CD20陽(yáng)性B細(xì)胞非何杰金淋巴瘤(NHL)的患者。發(fā)明概述本發(fā)明涉及編碼多肽抗-CD20的核酸序列的轉(zhuǎn)化。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了編碼抗-CD20分子的重鏈和輕鏈的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了由所述核酸序列編碼的相應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明的特別的方面涉及抗-CD20分子的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的從頭合成。進(jìn)一步公開(kāi)的是，具有感興趣的核酸序列的載體構(gòu)建體的構(gòu)建、所述載體構(gòu)建體向感受態(tài)細(xì)菌中的轉(zhuǎn)化、以及抗-CD20鏈向哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的亞克隆。發(fā)明的詳細(xì)il明抗CD20抗體是小鼠-人嵌合抗體。它由兩條鏈組成l)輕鏈，其 由來(lái)自小鼠單克隆抗體2B8的輕鏈的可變區(qū)和人k恒定區(qū)組成；和2 ) 重鏈，其由來(lái)自小鼠單克隆抗體2B8的重鏈的可變區(qū)和人IgGl恒定區(qū) 組成。該抗體序列在專(zhuān)利WO94/11026中有描述。對(duì)于cDNA構(gòu)建體的編碼區(qū)的合成，遵循了從頭開(kāi)始的方法，因 為分泌抗CD20小鼠單克隆抗體的雜交瘤2B8在公眾領(lǐng)域不是可獲得 的。從頭的基因合成還將允許針對(duì)用于蛋白表達(dá)的特定哺乳動(dòng)物細(xì)胞 系的密碼子優(yōu)化。編碼抗CD20抗體的輕鏈的核苷酸序列表示在SEQ ID 1中。編碼抗CD20抗體的輕鏈的核苷酸序列的經(jīng)密碼子優(yōu)化的版本表 示在SEQ ID2中。過(guò)程的一部分一皮改變，以確j呆在哺乳動(dòng)物細(xì)月包系，例如CHO Kl和HEK 293中的最佳的重組蛋白表達(dá)。編碼抗CD20抗體的重鏈的核苷酸序列 表示在SEQ ID 3中。編碼抗CD20抗體的重鏈的核苷酸序列的經(jīng)密碼子優(yōu)化的版本描 述在SEQ ID 4中。在抗CD20抗體重鏈的編碼DNA序列中的密碼子作為密碼子優(yōu)化 過(guò)程的一部分^皮改變，以確保在哺乳動(dòng)物細(xì)l包系，例如CHOK1和HEK 293中的最佳的重組蛋白表達(dá)。表達(dá)載體的選擇用于抗CD20抗體表達(dá)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以基于商業(yè) 上可獲4f的載體之一 (例如，分別來(lái)自Invitrogen或BD Biosciences的 ; cZ)A^或),其一皮^f務(wù)改以包括以下特4正(a) 多克隆位點(diǎn)，用于將編碼抗CD20抗體的輕抗體鏈和重抗體 鏈的cDNA插入到同 一載體的獨(dú)立表達(dá)盒中。(b) 表達(dá)載體的設(shè)計(jì)還可以接納獨(dú)立的(雙順?lè)醋?IRES介導(dǎo) 的綠色熒光蛋白共表達(dá)，其將容許使用熒光輔助的細(xì)胞分選來(lái)快速篩 選高表達(dá)性轉(zhuǎn)染子。(c) 嵌合的輕抗體鏈和重抗體鏈向具有不同選擇標(biāo)記的兩個(gè)獨(dú) 立的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中的克隆。RTX抗體鏈在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的亞克隆從頭合成的抗CD20抗體重鏈(RTX-HC)和抗CD20抗體輕鏈 (RTX-LC )作為cDNA片段獲得，被克隆到pBSKII載體和構(gòu)建體中， 分別稱(chēng)為pBSKII-RTX-LC和pBSKII-RTX-HC。 DNA凈皮轉(zhuǎn)4匕到DH10b Eco"細(xì)胞中，接種在含有氨千青霉素的LB瓊脂平板上。將來(lái)自平板 的菌落接種到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行DNA迷你制備。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)了兩 條抗體鏈的序列。全長(zhǎng)抗CD20抗體輕鏈和重鏈分別亞克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 pCAIN和pCAID中。用BglII和EcoRI消化pBSKII/RTX-LC克隆和 pCAIN載體。產(chǎn)生的構(gòu)建體稱(chēng)為pCAIN/RTX-LC。來(lái)自前者的插入片 段(700 bp)和來(lái)自后者的載體主干進(jìn)行凝膠純化并連接(圖5)。連 接混合物轉(zhuǎn)化到熱激感受態(tài)DH10b細(xì)胞中，并接種在含有氨節(jié)青霉素 作為選摔抗生素的LB瓊脂平板上。挑選出幾個(gè)轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行DNA迷 你制備。通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶消化來(lái)檢查克隆(圖6)。用BamHI和EcoRI消化pBSKII/RTX-HC克隆和pCAID載體，產(chǎn) 生的構(gòu)建體稱(chēng)為pCAID/RTX-HC。來(lái)自前者的插入片段(1429 bp)和 來(lái)自后者的載體主干進(jìn)行凝膠純化并連接(圖7)。連接混合物轉(zhuǎn)化到 熱激感受態(tài)DH10b細(xì)胞中，并接種在含有氨芐青霉素作為選擇抗生素 的LB瓊脂平板上。挑選出幾個(gè)轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行DNA迷你制備。通過(guò)限 制性?xún)?nèi)切酶消化來(lái)檢查克隆(圖8)。DNA測(cè)序和分析對(duì)分別克隆到pCAID和pCAIN哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的RTX-HC 和RTX-LC的最終克隆進(jìn)4亍測(cè)序并確認(rèn)它們的序列精確性。編碼抗CD20抗體抗體鏈的基因的維持和增殖編碼抗CD20抗體的嵌合輕鏈和重鏈的cDNA構(gòu)建體將在標(biāo)準(zhǔn)的 細(xì)菌細(xì)胞系，例如Top 10 (Invitrogen )中維持和增殖。在CHO-Kl中的短暫的/穩(wěn)定的重組蛋白表達(dá)(a) 構(gòu)建體的短暫的/穩(wěn)定的表達(dá)將使用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)進(jìn)行，這是FDA批準(zhǔn)用于工業(yè)應(yīng)用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。短暫的表達(dá)對(duì)于檢查構(gòu)建體的表達(dá)和快速獲得少量的重組蛋白是有用的。(b) 隨后，使用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)發(fā)展顯示了期望的單克隆抗體的穩(wěn) 定和高度表達(dá)的CHO細(xì)胞?？笴D20抗體的純化抗CD20抗體的成熟嵌合抗體由兩條抗體重鏈(451個(gè)氨基酸x 2 ) 和兩條抗體輕鏈(213個(gè)氨基酸x2)組成，并具有約145 kDa的分子 量。兩條鏈都具有N-末端20個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列，其在激素的分泌之 前被裂解下來(lái)。在根據(jù)上述建議的功能/結(jié)合分析確立了可重現(xiàn)的生物活性之后， 將進(jìn)行努力來(lái)優(yōu)化純化步驟。純化策略將以加工經(jīng)濟(jì)性、加速市場(chǎng)化、 可擴(kuò)展性、重現(xiàn)性、以及產(chǎn)物的最大純度為目標(biāo)，而功能穩(wěn)定性和結(jié) 構(gòu)完整性作為主要目標(biāo)。為此，將探索使用過(guò)濾(常規(guī)過(guò)濾和切向流 過(guò)濾)和層析的組合方法。工藝質(zhì)量評(píng)定要求和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)研究將在3個(gè)批次上進(jìn)行。因而，本發(fā)明考慮了純化過(guò)程中的以下步驟a. 使用COHC/A1HC/0.45 y深度過(guò)濾器的初步澄清b. ^f吏用基于切向流過(guò)濾的Pellicon XL Biomax 50 kDa截留過(guò)濾器濃縮c. 層析步驟一I:使用Prosep VA Ultra用于基于血清的(2 %胎 牛血清[FCS])培養(yǎng)物上清液/以及Prosep VA對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)物上清液 的親和層析d. 層析步驟一II:強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑，例如SP Sepharosee. 層析步驟一III:流經(jīng)堿性強(qiáng)陰離子交換劑，例如CellufmeQ (基于纖維素的介質(zhì))，用于除去宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸。f. 使用體積排阻過(guò)濾去除病毒，以及使用Cellufme sulfate濾除 蛋白Ag. 無(wú)菌過(guò)濾h. 使用Remtox/Cellufine ET層析的內(nèi)毒素去除 h.制劑使用生物化學(xué)的、免疫學(xué)的和物理化學(xué)的方法對(duì)目標(biāo)蛋白身份的確認(rèn) 每個(gè)階段的總蛋白回收率使用二喹啉曱酸法(BCA) /Bradford染 料結(jié)合方法來(lái)測(cè)定。純化的每個(gè)階段的目標(biāo)蛋白濃度將使用高度特異 的和可靠的基于酶的免疫分析，例如直接或間接夾心ELISA Qualitative 來(lái)檢測(cè)，在每個(gè)階段之后將是目標(biāo)特異性western分析。采用反相色譜 法、等電聚焦和二維凝膠電泳來(lái)評(píng)估純化的產(chǎn)物。使用遠(yuǎn)UV圓二色 法來(lái)檢查二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。分子量和寡聚狀態(tài)將使用體積排阻和 MALDI-TOF來(lái)研究。研究還將集中于蛋白質(zhì)相對(duì)于pH值和溫度的穩(wěn) 定性。NESP是超糖基化蛋白，純化的蛋白的糖基化模式將使用氣相色 譜法(GC分析)來(lái)記錄。7.抗CD20抗體的體外和體內(nèi)活性分析分析將使用以下方式進(jìn)行a)在流式細(xì)月包計(jì)分析中4吏用熒光標(biāo)記的Clq的人Clq結(jié)合和CD-20陽(yáng)性SB細(xì)月包b) CD20陽(yáng)性SB細(xì)胞的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞裂解c) 使用CD20陽(yáng)性細(xì)胞和CD20陰性細(xì)胞的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性效 應(yīng)物分析抗CD20抗體的臨床前體內(nèi)生物活性將在非人靈長(zhǎng)類(lèi)(獼猴)上測(cè)試a) 來(lái)自外周血、淋巴結(jié)和骨髓的B細(xì)l包減少效力b) 與嵌合抗體相關(guān)的任何毒性的評(píng)估
權(quán)利要求
1. 制備具有體內(nèi)生物學(xué)活性的抗CD20單克隆抗體的方法，包括以下步驟·抗CD20單克隆抗體的輕鏈和重鏈的從頭合成的步驟·抗CD20抗體的全長(zhǎng)κ輕鏈的構(gòu)建的步驟·抗CD20抗體的全長(zhǎng)IgG1重鏈的構(gòu)建的步驟·載體的構(gòu)建步驟，所述載體包含編碼抗-CD20分子的輕多肽鏈和重多肽鏈的核酸序列?！た笴D20抗體鏈在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中亞克隆以生產(chǎn)生物學(xué)活性抗體分子的步驟。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼抗CD20抗體的輕鏈 的核苷酸序列表示在SEQID 1中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼抗CD20抗體的重鏈 的核苷酸序列表示在SEQID2中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中包含編碼抗-CD20的重鏈的核 酸片段的載體經(jīng)歷定點(diǎn)誘變。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述全長(zhǎng)抗CD20重鏈和輕鏈 被亞克隆到哺乳動(dòng)物載體中
6. 具有體內(nèi)生物學(xué)活性的抗CD20單克隆抗體的制備方法，包 括用圖No.的載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、以及從所述宿主細(xì)胞或其生長(zhǎng) 培養(yǎng)基分離所述產(chǎn)物的步驟。
7. —種藥物組合物，包含治療有效量的抗CD20抗體和藥學(xué)上 可接受的稀釋劑、佐劑或載體，其中所述抗體是從培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的哺 乳動(dòng)物細(xì)l包純化的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)可溶形式的抗體的重組方法，所述抗體結(jié)合CD20，用于治療患有復(fù)發(fā)的或難治的、低級(jí)的或?yàn)V泡的、CD20陽(yáng)性B細(xì)胞非何杰金淋巴瘤(NHL)的患者。所述治療將包括免疫活性抗CD20抗體；或放射性標(biāo)記的抗CD20抗體和/或協(xié)同策略的使用，所述協(xié)同策略中標(biāo)記和非標(biāo)記抗體將用于NHL治療。該方法描述了編碼抗-CD20的核酸序列的從頭合成、構(gòu)建的核酸序列向感受態(tài)細(xì)菌中的轉(zhuǎn)化、以及構(gòu)建的核酸序列向哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的亞克隆，以表達(dá)期望的蛋白質(zhì)。包含與感興趣的基因相連的控制元件的DNA構(gòu)建體已被公開(kāi)。感興趣的核酸序列已經(jīng)密碼子優(yōu)化，以允許在適合的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101273063SQ200680026978
公開(kāi)日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日
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