一種無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展，外周血淋巴細(xì)胞染色體核型分析已成為產(chǎn)前診斷的常規(guī) 檢測(cè)項(xiàng)目。而要獲得數(shù)目多的可供核型分析的分裂相細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)增殖是基 礎(chǔ)。
[0003] 細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)是在體外模擬細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境生長(zhǎng)而建立的，而來(lái)源于動(dòng)物或 者是人類(lèi)的血清被廣泛用于細(xì)胞的維持和增殖。血清中含有細(xì)胞存活和生長(zhǎng)所必須的成 分：生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，粘附因子，蛋白，維生素，微量元素和激素等，血清還可以作為緩沖 劑、螯合劑。另外，血清中的白蛋白，胎球蛋白和其他蛋白能夠影響細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的物理特 性，如pH，剪切力，粘度，滲透壓和氣體傳遞率等。
[0004] 然而，使用血清也存在許多問(wèn)題。價(jià)格昂貴，血清價(jià)格不斷上漲，費(fèi)用約占到培 養(yǎng)基成本一半；血清質(zhì)量參差不齊，存在質(zhì)量不穩(wěn)定性，會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量的差異；另 外，血清中存在支原體和其它病毒異源污染，造成生物產(chǎn)品的安全性問(wèn)題，雖然可以經(jīng)滅活 處理，但是，這樣的處理會(huì)影響血清的促細(xì)胞生長(zhǎng)能力。
[0005] 為了解決血清在廣泛運(yùn)用上的問(wèn)題，企業(yè)逐漸轉(zhuǎn)向了無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物衍生成分甚 至化學(xué)成分確定培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其主要組成包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L型植 物血球凝集素、復(fù)合氨基酸、亞硒酸鈉、檸檬酸鐵、重組人胰島素、緩沖體系。
[0007] 作為優(yōu)選的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基。
[0008] 作為優(yōu)選的，所述復(fù)合氨基酸包括：L-谷氨酸300mg/L、L-甘氨酸100mg/L、L-天 冬氨酸400mg/L、L-絲氨酸360 mg/L、L-蘇氨酸80 mg/L、L-亮氨酸80 mg/L、L-脯氨酸 200 mg/L〇
[0009] 作為優(yōu)選的，所述緩沖體系為NaHC03。
[0010] 作為優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中各組分的含量為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基10-10. 5 g/L，L型植物 血球凝集素18-22 mg/L，復(fù)合氨基酸18-22 ml/L、亞硒酸鈉50-70 n mol /L、檸檬酸鐵 0.5-1.5 mg/L、重組人胰島素 8-12 mg/L，緩沖體系 1.8-2.2 g/L。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基不含有動(dòng)物或人的血清，避免了使 用動(dòng)物血清可能導(dǎo)致的安全問(wèn)題，同時(shí)可以降低產(chǎn)品生產(chǎn)成本，增強(qiáng)產(chǎn)品不同批次間的質(zhì) 量穩(wěn)定性，提升細(xì)胞培養(yǎng)效果，為臨床檢驗(yàn)提供安全可靠的試劑。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0013] 實(shí)施例1 UlL氨基酸母液的配制：在500 mL注射用水中分別加入L-谷氨酸300 mg、L-甘氨酸 100 mg、L-天冬氨酸400 mg、L-絲氨酸360 mg、L-蘇氨酸80 mg、L-亮氨酸80 mg、L-脯 氨酸200 mg，攪拌溶解后定容至LOL。分裝后4°C貯存?zhèn)溆?。?shí)施例1-3的培養(yǎng)基均使用 本氨基酸母液。
[0014] 2、IL無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基的配制方法為：在800mL注射用 水中加入RPMI 1640培養(yǎng)基干粉10.4 g，溶解后加入碳酸氫鈉 2.0 g、氨基酸母液20 mL、 PHA-L 20 mg/L、亞硒酸鈉 60 nmol/L、梓檬酸鐵I mg和重組人胰島素 10 mg，攪拌使充分溶 解，用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 0-7. 4之間，0.22 um濾膜過(guò)濾 除菌，分裝，-20 °C貯存?zhèn)溆谩?br>[0015] 實(shí)施例2 IL無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基的配制方法為：在SOOmL注射用水中加 入RPMI 1640培養(yǎng)基干粉10 g，溶解后加入碳酸氫鈉 2. 2 g、氨基酸母液18 mL、PHA-L 22 mg/L、亞硒酸鈉 50 nmol/L、朽1檬酸鐵0. 5 mg和重組人胰島素 12 mg，攪拌使充分溶解，用 0· lmol/L鹽酸和0· lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 0-7. 4之間，0· 22um濾膜過(guò)濾除菌，分 裝，-20 °C貯存?zhèn)溆谩?br>[0016] 實(shí)施例3 IL無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基的配制方法為：在SOOmL注射用水中加 入RPMI 1640培養(yǎng)基干粉10.5 g，溶解后加入碳酸氫鈉 1.8 g、氨基酸母液22 mL、PHA-L 18 mg/L、亞硒酸鈉 70 nmol/L、朽1檬酸鐵1.5 mg和重組人胰島素 8 mg，攪拌使充分溶解，用 0· lmol/L鹽酸和0· lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 0-7. 4之間，0· 22um濾膜過(guò)濾除菌，分 裝，-20 °C貯存?zhèn)溆谩?br>[0017] 實(shí)施例4淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定 采用實(shí)施例1-3制備的培養(yǎng)基及含小牛血清的對(duì)比培養(yǎng)基進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。
[0018] 對(duì)比培養(yǎng)基配方為：RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基9. 36g/L，小牛血清10%(W/V)，PHA-L 20mg/L，肝素 0· 1%(W/V)。
[0019] 實(shí)驗(yàn)步驟： 取無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基和對(duì)比培養(yǎng)基各一瓶，在無(wú)菌條件下用2ml注射器滴加20滴抗凝 血，輕輕搖勻，放入37°培養(yǎng)箱中放置72小時(shí)，每隔12小時(shí)輕搖1次。收獲前2小時(shí)用Iml 注射器滴加入秋水仙堿，終濃度為0. 02 ug/ml，搖勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。用移液器將無(wú) 血清細(xì)胞培養(yǎng)基移入IOml離心管，1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清液，經(jīng)固定后滴一滴細(xì) 胞懸液于玻片上，推片。待片干后用瑞氏染色液染色，細(xì)胞呈天藍(lán)色。油鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè) 單核細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
[0020] 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式：淋轉(zhuǎn)率=1000個(gè)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞數(shù)/1000*100%。
[0021] 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1: 表1
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明培養(yǎng)基在不添加動(dòng)物或人的血清的情況下，同樣能夠提升 細(xì)胞的培養(yǎng)效果，為臨床檢驗(yàn)提供安全可靠的試劑。
[0022] 以上實(shí)施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不背離本 發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見(jiàn)的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其主要組成包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L型 植物血球凝集素、復(fù)合氨基酸、亞硒酸鈉、檸檬酸鐵、重組人胰島素、緩沖體系。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所 述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所 述復(fù)合氨基酸包括：L-谷氨酸300mg/L、L-甘氨酸100mg/L、L-天冬氨酸400mg/L、L-絲氨 酸 360 mg/L、L-蘇氨酸 80 mg/L、L-亮氨酸 80 mg/L、L-脯氨酸 200 mg/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所 述緩沖體系為NaHCO3。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征 在于，所述培養(yǎng)基中各組分的含量為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基10-10. 5 g/L，L型植物血球凝集素18-22 11^凡，復(fù)合氨基酸18-22 1111凡、亞硒酸鈉5〇-7〇111]1〇1凡、朽1檬酸鐵0.5-1.5 11^凡、重組人 胰島素8-12 mg/L，緩沖體系L8-2.2 g/L。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其主要組成包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L型植物血球凝集素、復(fù)合氨基酸、亞硒酸鈉、檸檬酸鐵、重組人胰島素及緩沖體系。本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基不含有動(dòng)物或人的血清，避免了使用動(dòng)物血清可能導(dǎo)致的安全問(wèn)題，同時(shí)可以降低產(chǎn)品生產(chǎn)成本，增強(qiáng)產(chǎn)品不同批次間的質(zhì)量穩(wěn)定性，提升細(xì)胞培養(yǎng)效果，為臨床檢驗(yàn)提供安全可靠的試劑。
【IPC分類(lèi)】C12N5/0783
【公開(kāi)號(hào)】CN105018425
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510399372
【發(fā)明人】邱壯偉, 丘力功, 倪世明
【申請(qǐng)人】廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月9日